Estructura y dinámica de proteínas en condiciones de aglomeración macromolecular : desarrollo de métodos avanzados de espectroscopía láser de fluorescencia con resolución temporal de picosegundos

Tesis de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Químicas, Departamento de Bioquímia y Biología Molecular I, leída el 11-12-2002Una característica común a todos los sistemas biológicos es su elevada concentración total de macromoléculas (50-400 mg/mL). Esta alta concentración de macromoléculas, tiene importantes efectos sobre la termodinámica y la cinética de las reacciones que tienen lugar en los medios fisiológicos. El estudio cuantitativo de las propiedades estructurales y de las interacciones en sistemas aglomerados, presenta dificultades experimentales y de interpretación para la mayoría de las técnicas biofísicas. El objetivo general de este trabajo es el desarrollo de métodos avanzados de anisotropía de fluorescencia con resolución temporal de picosengudos y de FCS, adecuados para la obtención de información cuatitativa en medios aglomerados que simulan las condiciones de aglomeración macromolecular existente "in vivo". En este trabajo, se ha estudiado el efecto de la aglomeración macromolecular debida a altas concentraciones de Rnasa A o de HSA sobre el equilibrio de homodimerización de la apoMb así como sobre la difusión rotacional y translacional tanto del dímero como del monómero de apoMB. Las técnicas de anisotropía de fluorescencia con resolución temporal han permitido detectar la formación de dímeros flexibles de apoMb en presencia de RNasa A como proteína aglomerante, en una proporción que aumenta al aumentar la concentración de RNasa A (0-250 mg/mL) y con constantes de asociación aparentes superiores a 10(5) -10(6) M, dependiendo de la concentración de RNasa A. En las soluciones de HSA como proteína aglomerante, la apoMb se mantiene monomérica en todo el intervalo de concentraciones de HSA estudiado (0-200 mg/mL). En diferente efecto observado sobre el equilibrio de dimerización de la apoMb es compatible con la menor exculsión de volumen en las soluciones de HSA que en las de Rnasa A para una misma concentración en mg/mL. En las soluciones de alta concentración de RNasa A o de HSA la microviscosidad que actúa sobre la difusión del monómero y el dímero de apoMb, es diferente de la viscosidad macroscópica y es distinta también para la difusión rotacional y translacional. Para los estudios de difusión translacional se utilizó la técnica de FCS. En ambos casos, existe una ley empírica potencial que relaciona la viscosidad microscópica en la macroscópica. La microviscosidad que actúa sobre la rotación es menor que la macroviscosidad y ésta a su vez es menor que la microsviscosidad translacionalDepto. de Bioquímica y Biología MolecularFac. de Ciencias QuímicasTRUEpu

Estructura y dinámica de proteínas en condiciones de aglomeración macromolecular : desarrollo de métodos avanzados de espectroscopía láser de fluorescencia con resolución temporal de picosegundos

Una característica común a todos los sistemas biológicos es su elevada concentración total de macromoléculas (50-400 mg/mL). Esta alta concentración de macromoléculas, tiene importantes efectos sobre la termodinámica y la cinética de las reacciones que tienen lugar en los medios fisiológicos. El estudio cuantitativo de las propiedades estructurales y de las interacciones en sistemas aglomerados, presenta dificultades experimentales y de interpretación para la mayoría de las técnicas biofísicas. El objetivo general de este trabajo es el desarrollo de métodos avanzados de anisotropía de fluorescencia con resolución temporal de picosengudos y de FCS, adecuados para la obtención de información cuatitativa en medios aglomerados que simulan las condiciones de aglomeración macromolecular existente "in vivo". En este trabajo, se ha estudiado el efecto de la aglomeración macromolecular debida a altas concentraciones de Rnasa A o de HSA sobre el equilibrio de homodimerización de la apoMb así como sobre la difusión rotacional y translacional tanto del dímero como del monómero de apoMB. Las técnicas de anisotropía de fluorescencia con resolución temporal han permitido detectar la formación de dímeros flexibles de apoMb en presencia de RNasa A como proteína aglomerante, en una proporción que aumenta al aumentar la concentración de RNasa A (0-250 mg/mL) y con constantes de asociación aparentes superiores a 10(5) -10(6) M, dependiendo de la concentración de RNasa A. En las soluciones de HSA como proteína aglomerante, la apoMb se mantiene monomérica en todo el intervalo de concentraciones de HSA estudiado (0-200 mg/mL). En diferente efecto observado sobre el equilibrio de dimerización de la apoMb es compatible con la menor exculsión de volumen en las soluciones de HSA que en las de Rnasa A para una misma concentración en mg/mL. En las soluciones de alta concentración de RNasa A o de HSA la microviscosidad que actúa sobre la difusión del monómero y el dímero de apoMb, es diferente de la viscosidad macroscópica y es distinta también para la difusión rotacional y translacional. Para los estudios de difusión translacional se utilizó la técnica de FCS. En ambos casos, existe una ley empírica potencial que relaciona la viscosidad microscópica en la macroscópica. La microviscosidad que actúa sobre la rotación es menor que la macroviscosidad y ésta a su vez es menor que la microsviscosidad translaciona

Impacto de la multirresistencia en la patogenicidad de Pseudomonas aeruginosa: perspectiva epidemiológica-clinica y experimental

[spa] P. aeruginosa es uno de los principales patógenos nosocomiales y posee una gran capacidad de desarrollar resistencias a los antimicrobianos con la emergencia de cepas multirresistentes (MDR) y extremadamente resistentes (XDR). En las últimas décadas se ha producido un incremento de las infecciones por cepas multirresistentes que plantea la necesidad de desarrollar estrategias de control de infección y un uso prudente de los antimicrobianos. En este contexto se desarrolla la presente tesis doctoral en la que se incluyen ocho trabajos publicados en revistas científicas, que están encaminados tanto a mejorar el conocimiento epidemiológico de P. aeruginosa como a evaluar el impacto de la multirresistencia en la patogenicidad y virulencia de P. aeruginosa desde una perspectiva clínica, epidemiológica y experimental. La posible existencia de un coste biológico asociado a la multirresistencia supondría una menor virulencia de las cepas multirresistentes y podría justificar un uso más selectivo de las antibioticoterapias empíricas. Este proyecto doctoral incluye un estudio retrospectivo de neumonías asociada a ventilación mecánica por P. aeruginosa en el que se demostró que la mortalidad precoz era superior en las causadas por cepas no multirresistentes que en aquellas causadas por cepas multirresistentes. En un segundo estudio retropectivo, se identificó el consumo de fluoroquinolonas como principal factor de riesgo para el desarrollo de bacteriemia por P. aeruginosa XDR. Esta tesis incluye un estudio observacional prospectivo en el que se realizó vigilancia activa de colonización intestinal y de infección por P. aeruginosa. Gracias a este estudio se demostró que: 1) la colonización intestinal por cepas de P. aeruginosa MDR es más tardía que la colonización por cepas sensibles; 2) el consumo previo de fluoroquinolonas y carbapenémicos son los principales factores de riesgo para la colonización por P. aeruginosa multirresistente; 3) la colonización intestinal es un requerimiento clave para el desarrollo posterior de infección por P. aeruginosa; 4) la invasividad clínica fue mayor en las cepas no multirresistentes que en las multirresistentes, desarrollando los pacientes colonizados por cepas de P. aeruginosa no multirresistente con más frecuencia y precocidad infección que aquellos colonizados por cepas multirresistentes policlonales; 5) la intensidad de la respuesta inflamatoria se asoció con la severidad de la infección por P. aeruginosa, especialmente en infecciones bacteriémicas y 6) la respuesta inflamatoria fue superior en las infecciones por P. aeruginosa XDR en las que había un mayor porcentaje de infecciones bacteriémicas. En esta tesis también se incluye un estudio multicéntrico de pacientes con bacteriemia por P. aeruginosa se investigaron los genotipos del sistema de secreción tipo III y su relación con el pronóstico de los pacientes; demostrándose que el genotipo exoU+ es uno de los principales determinantes de virulencia de P. aeruginosa y se asocia a una mayor mortalidad precoz. Este genotipo fue más frecuente en los fenotipos no multirresistentes que en los multirresistentes. Finalmente, mediante un modelo experimental in vitro e in vivo se evaluó el impacto de la multirresistencia en la patogenicidad y virulencia de P. aeruginosa. En el modelo de peritonitis-sepsis murino se observó que las cepas multirresistentes presentaron menor capacidad de producir infección localizada y diseminada, menor capacidad de producir respuesta inflamatoria y menor mortalidad que las cepas sensibles. En conjunto, nuestros resultados sugieren que las cepas de Pseudomonas aeruginosa multirresistente producen una colonización más tardía y sufren un coste biológico, manifestado con una menor tasa de crecimiento in vitro, una menor invasividad clínica, una menor capacidad de producir respuesta inflamatoria y una menor mortalidad atribuible de las cepas multirresistentes. Esto permite considerar un mayor margen en el abordaje empírico de estas situaciones clínicas y una utilización más ajustada de la antibioterapia.[eng] Pseudomonas aeruginosa is one of the most common nosocomial pathogens worldwide, and continuously evolving resistance to multiple antimicrobial agents has become a significant health problem. However, the biological implications of antibiotic resistance on the pathogenicity and virulence of P. aeruginosa are not clearly established. It is believed that acquisition of resistance mechanisms may have a negative impact on bacterial fitness (a fitness cost), resulting in impaired bacterial physiology and, in turn, a loss of virulence. Improve knowledge about the possible biological cost associated with resistance may help to implement infection control strategies as well as improve antibiotic prescription. In this context, this doctoral thesis evaluates the impact of multidrug resistance on the pathogenicity of P. aeruginosa through epidemiological, clinical and experimental studies. Using clinical and epidemiological data, we investigated if there were differences in the outcome, in the ability to develop colonization and infection between multidrug resistant (MDR) and non-MDR P. aeruginosa strains. In a retrospective study we observed that early mortality was higher in ventilator-associated pneumonia caused by non-MDR P. aeruginosa than those caused by MDR strains. In a prospective study we demonstrated that intestinal colonization occurred more prematurely for non-MDR P. than for MDR isolates. The ability to produce infection (clinical invasiveness) was also higher in patient colonized by non-MDR isolates than those colonized by MDR strains. Furthermore, using in vitro and in vivo models we demonstrated that MDR profiles were associated with a reduction in virulence of P. aeruginosa. In vitro growth rate was shorter in non-MDR than in MDR isolates. In a mice peritonitis/sepsis model we observed that non-MDR P. aeruginosa isolates had a greater ability to produce infection, to elicit inflammatory response and to cause mortality than MDR strains. Overall, our data suggest that multidrug resistance is associated with a biological cost in P. aeruginosa

Liderazgo transformacional y adaptación al cambio en el nuevo contexto educativo en la I.E. N° 83006 Andrés Avelino Cáceres, Cajamarca - 2021

A raíz del nuevo contexto educativo se ha generado una situación de cambios en el que se requiere gran capacidad de adaptación del personal docente, esperándose, además, una capacidad de liderazgo alto de la parte directiva a fin de manejar de forma adecuada los diferentes retos encontrados. En este contexto, se propone determinar la relación existente entre el liderazgo transformacional y sus diferentes dimensiones con respecto a la adaptación al cambio docente observado en la I.E. 83006 Andrés Avelino Cáceres, Cajamarca. El tipo de estudio propuesto corresponde a una investigación básica, con un diseño no experimental correlacional, estudiándose una muestra de 70 docentes sobre los cuales se aplicaron dos instrumentos tipo encuesta, uno para determinar el nivel de liderazgo transformacional observado por parte del área directiva de su plantel, y otro para evaluar su nivel de adaptación al cambio dentro del nuevo contexto educativo. Finalmente, se determinó estadísticamente una relación positiva y alta mediante Rho de Spearman de 0,852 entre el liderazgo transformacional y la adaptación al cambio observado en la institución, además de una relación alta y significativa por parte de las diferentes dimensiones (estimulación intelectual, motivación inspiracional, consideración individual e influencia idealizada) con la adaptación al cambio docente

Charged molecules modulate the volume exclusion effects exerted by crowders on FtsZ polymerization

14 p.-4 fig.-2 tab.We have studied the influence of protein crowders, either combined or individually, on the GTP-induced FtsZ cooperative assembly, crucial for the formation of the dynamic septal ring and, hence, for bacterial division. It was earlier demonstrated that high concentrations of inert polymers like Ficoll 70, used to mimic the crowded cellular interior, favor the assembly of FtsZ into bundles with slow depolymerization. We have found, by fluorescence anisotropy together with light scattering measurements, that the presence of protein crowders increases the tendency of FtsZ to polymerize at micromolar magnesium concentration, being the effect larger with ovomucoid, a negatively charged protein. Neutral polymers and a positively charged protein also diminished the critical concentration of assembly, the extent of the effect being compatible with that expected according to pure volume exclusion models. FtsZ polymerization was also observed to be strongly promoted by a negatively charged polymer, DNA, and by some unrelated polymers like PEGs at concentrations below the crowding regime. The influence of mixed crowders mimicking the heterogeneity of the intracellular environment on the tendency of FtsZ to assemble was also studied and nonadditive effects were found to prevail. Far from exactly reproducing the bacterial cytoplasm environment, this approach serves as a simplified model illustrating how its intrinsically crowded and heterogeneous nature may modulate FtsZ assembly into a functional Z-ring.This work was supported by Spanish government BIO2011-28941-C03 (GR and SZ) and BFU 2014-52070-C2-2-P (GR) (www.mineco.gob.es), European Commission HEALTH-F3-2009-223432 (GR) (http://ec.europa.eu/), and Human Frontiers Science Program RGP0050/2010-C102 (GR) (www.hfsp.org).Peer reviewe

Mecanismo de defensa del erizo europeo (Erinaceus europaeus)

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Drawbacks of dialysis procedures for removal of EDTA

9 p.-3 fig.Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) is a chelating agent commonly used in protein purification, both to eliminate contaminating divalent cations and to inhibit protease activity. For a number of subsequent applications EDTA needs to be exhaustively removed. Most purification methods rely in extensive dialysis and/or gel filtration in order to exchange or remove protein buffer components, including metal chelators. We report here that dialysis protocols,even as extensive as those typically employed for protein refolding, may not effectively remove EDTA, which is reduced only by approximately two-fold and it also persists after spin-column gel filtration, as determined by NMR and by colorimetric methods. Remarkably, the most efficient removal was achieved by ultrafiltration, after which EDTA became virtually undetectable. These results highlight a potentially widespread source of experimental variability affecting free divalent cation concentrations in protein applications.This work has been funded by the European Union's Horizon 2020 research and innovation programme under the Marie Sklowdowska-Curie grant agreement number 675132 (http://cordis.europa.eu/project/rcn/198275_en.html), and by grants from the Spanish Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO/FEDER, http://www.mineco.gob.es/ portal/site/mineco/idi) SAF2015-68590R to DPS and CTQ2015-64597-C2-2-P to FJC.Peer reviewe

Al rescate de la memoria. Trabajar la memoria histórico-familiar a través del cómic y la novela gráfica y crear un Fanzine conjunto.

En una sociedad hipermediatizada e hiperconectada en la que ha cambiado la manera de comunicarse y relacionarse, el Proyecto de Innovación Docente Al rescate de la memoria pretende hacer un alto en el modo de vida acelerado del alumnado y reparar y crear conciencia de la importancia del relato vivo de la memoria familiar. Trata de involucrar y motivar al alumnado estrechando los lazos intergeneracionales mediante la creación de un cómic o relato ilustrado que tenga como base la investigación y documentación de sus memorias familiares. Por otro lado, la Actividad de Aula Animarte propone dos actividades de animación con la intención de que sirvan como material de apoyo del Proyecto para la mejor visualización y construcción de la narración de sus historias. Ambos trabajos llevados a cabo en la asignatura de Dibujo Aplicado a la Ilustración I, componen el presente Trabajo de Fin de Máster comprendido en la modalidad A. Esta modalidad, tiene como fin responder ciertas problemáticas analizadas en el Ciclo Superior de Ilustración que se presentarán a lo largo del trabajo.<br /

Impact of generic entry on hospital antimicrobial use: a retrospective quasi-experimental interrupted time series analysis

Background: the impact of antimicrobials generic entry (GE) is controversial. Their introduction could provide an economic benefit yet may also increase their consumption, leadingto a higher risk of resistance. Our aim was to analyze the impact of GE on trends of antimicrobialconsumption in an acute-care hospital. Methods: a retrospective quasi-experimental interrupted timeseries analysis was conducted at a 400-bed tertiary hospital in Barcelona, Spain. All antimicrobials forsystemic use for which a generic product entered the hospital from January 2000 to December 2019 were included. Antimicrobial consumption was expressed as DDD/100 bed days. Results: after GE, the consumption of cefotaxime (0.09,p< 0.001), meropenem (0.54,p< 0.001), and piperacillin-tazobactam (0.13,p< 0.001) increased, whereas the use of clindamycin (−0.03,p< 0.001) anditraconazole (−0.02,p= 0.01) was reduced. An alarming rise in cefepime (0.004), daptomycin (1.02),and cloxacillin (0.05) prescriptions was observed, despite not achieving statistical significance. Onthe contrary, the use of amoxicillin (−0.07), ampicillin (−0.02), cefixime (−0.06), fluconazole (−0.13),imipenem-cilastatin (−0.50) and levofloxacin (−0.35) decreased. These effects were noticed beyondthe first year post GE. Conclusions: GE led to an increase in the consumption of broad-spectrummolecules. The potential economic benefit of generic antibiotics could be diluted by an increase inresistance. Antimicrobial stewardship should continue to monitor these molecules despite GE

Tracto digestivo de un insectívoro: erizo europeo (Erinaceus europaeus)

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