Arquitectura nuclear e integridad del genoma

Nuestro laboratorio está interesado en entender los mecanismos celulares implicados en el control del espacio intracelular y la morfogénesis de la célula. Para estudiar los mecanismos que gobiernan este control a nivel molecular y celular usamos como modelo la levadura de fisión, Schyzosaccharomyces pombe. Esta levadura es unicelular, cilíndrica y crece de forma polarizada por extensión de las puntas hasta que alcanzan una masa celular crítica. Entonces se activa la entrada en mitosis y los cromosomas son segregados a lo largo del eje longitudinal de la célula. Al finalizar la mitosis, las células se dividen simétricamente generando dos células hijas con idéntica información genética y tamaño. Esta levadura determina con precisión los sitios de crecimiento de la célula, en los extremos opuestos para crecer en linea recta, y el centro de la misma, donde posiciona la maquinaria de division. El citoesqueleto de S. pombe consta de filamentos de actina, de "patches" de actina y de microtubulos (MTs). La desorganización del citoesqueleto de MT produce defectos en el posicionamiento del núcleo y del plano de división, asi como, defectos en el establecimiento de los sitios de crecimiento y de la forma celular. Los microtúbulos interfásicos son muy dinámicos en esta levadura y están organizados en haces antiparalelos con los extremos (+) orientados hacia las puntas de las célula y los extremos (-) solapando alrededor del centro de la misma donde estos haces están unidos a la envuelta nuclear. Esta simple organización de los MT permite a S. pombe transportar de forma vectorial factores de polaridad hacia las puntas de la célula y posicionar el núcleo en el centro geométricode la misma. Los filamentos de actina están también polarizados en la célula con los extremos "barbed", o de crecimiento rápido, orientados hacia los extremos de la célula durante interfase y hacia el centro durante citocinesis. Esta polarización permite el transporte dirigido de vesículas de secreción mediado por la miosina tipo V hacia los sitios de crecimiento y división respectivamente. Defectos en el citoesqueleto de actina o en el transporte celular mediado por actina produce también una pérdida de la polaridad y de la forma celular.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tec

Proteaosome dynamics during quiescence in Schizosaccharomyces pombe

The Proteasome is one of the largest protein complexes present in eukaryotic cells and it is responsible for 90% of total protein degradation. Thus, proteasome availability and correct function are key elements in eukaryotic cells form yeast to human to deal with unfolded or unwanted proteins. When the concentration of cells in culture increases, cells initiate a metabolic reprogramming in order to become quiescent. During this developmental state of no proliferation, the proteasome is sequestered in cytoplasmic granules, so they are readily available when those cells resume growth. However, the mechanisms involved in proteasome storage and recycling are poorly understood. Here, we use the fission yeast as eukaryotic model to study proteasome dynamics. Previous work done in our laboratory have shown that the existence of two separate proteasome pools: one cytoplasmic and one nuclear. The objective of this work is to study the formation, composition and dissolution of the proteasome storage granules (PSGs), and to analyze consequences for cell survival in conditions in which PSGs are not formed during quiescence. To accomplish this, we are using a collection of deletion of kinases to try to interfere with proteasome storage signalling, and a mutant required for the synthesis of ubiquitin, the molecule that target proteins for degradation via proteasome. All these mutants were expressing the proteasome subunits tagged with either GFP or tomato as proteasome marker. We used confocal imaging, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments and cell survival assays in cells exposed to low glucose concentration to promote quiescence to induce PSGs and study their localization and dynamics. Our result show that whereas none of the kinases assayed so far present significant defects in PSG formation, a mutant defective in the polyubiquitin gene (ubi4), shows a severe reduction in the number of cells capable of generating these PSGs in low glucose. This result suggests an important role of the ubiquitin in the formation and/or composition of PSGs. We are currently checking deletion of additional kinases, analyzing the rate of PSGs dissolution upon refeeding with rich media, as well as setting up assays to determine the rate of cell survival in conditions of defective PSG formation

Análisis de la expresión de marcadores tumorales en muestras de tumores humanos

Motivación: Los últimos datos de la OMS muestran una incidencia de 14,1 millones de casos nuevos de cáncer y 8,2 millones de muertes por cáncer en el mundo, siendo el cáncer de pulmón el principal causante de muerte por cáncer en hombres y el cáncer de mama en mujeres (1). En la actualidad existen varios test genómicos que han identificado huellas genómicas de tipos específicos de cáncer como Ampliseq, Oncotype Dx o MammaPrint, pero sólo unos pocos incluyen datos clínicos a parte de los genéticos. El análisis de expresión de los marcadores que forman dichos test permiten predecir la evolución del tumor o la respuesta a tratamiento (2). El objetivo del proyecto es generar un test genómico basado en una huella genómica de cáncer de mama de 40 genes y otro basado en una huella de 36 genes de adenocarcinoma de pulmón. Estos test permitirán estratificar a los pacientes en tres grupos de riesgo y predecir la supervivencia de los mismos (3). En paralelo pretendemos analizar la expresión de genes que codifican bombas de detoxificación implicadas en la resistencia a quimioterapia (MDR, multidrug resistance).Métodos: De los 75 genes incluidos en el análisis de expresión se seleccionaron por un lado 32 genes de cáncer de mama, 30 genes de adenocarcinoma de pulmón y 6 genes de expresión constitutiva usados en los test genómico-clínicos patentados de Dueñas y col. (3); por otro lado, se hizo una revisión bibliográfica para seleccionar genes de transportadores ABC. A partir de ADNc de las biopsias y los primers diseñados se analizará la expresión de los marcadores en una plataforma BioMark 96.96 IFC Dynamic Array (Fluidigm). Esta plataforma es barata, sencilla y permite analizar la expresión de hasta 96 genes de forma simultánea mediante PCR cuantitativa.Resultados: De momento hemos diseñado los primers para todos los marcadores y hemos amplificado mediante PCR estándar 65 de los 75 marcadores. A continuación, los productos de PCR serán secuenciados para confirmar que corresponden a los marcadores y se analizará su expresión en cada muestra tumoral mediante PCR cuantitativa.Conclusiones: El análisis estadístico de los datos de qRT-PCR de las muestras de tumores humanos permitirá conocer que genes se encuentran sobre-expresados y cuales reprimidos en cada tumor; pudiendo predecir la evolución de la enfermedad en cada paciente y diseñar protocolos de quimioterapia más eficientes, acercándonos a la medicina personalizada

Generation of new tools to fight/counteract protein aggregation.

Cells need to eliminate unfolded, damaged, or aged protein in order to maintain protein homeostasis, a mechanism known as proteostasis. Whereas molecular chaperones contribute to proteostasis by promoting correct protein folding, the proteasome, and autophagy are the main proteolytic machinery for the selective elimination of these proteins.¹ Mutation in components of these systems or stress situations that overwhelm these proteostasis mechanisms results in the accumulation of damaging protein aggregates that in humans cause neurodegenerative diseases. Furthermore, during aging, there is an overall decrease in the activity of these proteins’ clearance machinery which generates a state of chronic proteostasis stress that eventually leads to cell death.²In this project, we aim to build different genetic tools to assay proteolytic activities in S. pombe cells and determine the relative level of protein aggregation. These tools will allow us to characterize in more detail both, the stress-induced protein aggregations and the activity and relative level of aggregation in different proteasome mutants. In addition, using different molecular biology techniques, we will develop genetic tools to induce proteotoxicity through the expression of human proteins prone to aggregation, and hallmarks of neurodegenerative diseases.Finally, it is known that molecular chaperones prevent protein aggregation by interacting and blocking aggregation-prone domains. In this context, using both, a mutant of the proteasome which accumulates protein aggregates and mimics an aged cell, and some of the tools generated.., we will screen compounds that function as chemical chaperones and decrease proteotoxicity. These chemical chaperones might help to develop new treatments for neurodegenerative diseases and aging.

La regulación del Spindle Assembly Checkpoint en Schizosaccharomyces pombe

Motivación: Durante la mitosis, el huso mitótico formado por microtúbulos y moléculas asociadas, se encarga de la correcta segregación de los cromosomas. La pérdida o ganancia de cromosomas durante la mitosis puede promover cambios genéticos que predispongan al cáncer. Las células eucariotas tienen mecanismos que proporcionan a la célula un tiempo extra cuando existen problemas para capturar los cromosomas de forma adecuada. Este mecanismo, conservado de levaduras a humanos, se denomina Checkpoint del huso mitótico o Spindle Assembly Checkpoint (SAC). Una observación inicial mostró que las rutas de estrés son esenciales para el funcionamiento del Checkpoint del huso. Consistente con esta observación se comprobó que Bub1, una quinasa esencial para el funcionamiento del SAC, presenta sitios consenso de fosforilación por las MAPKs. En este proyecto se estudió la relevancia funcional de los sitios de fosforilación por MAPK de Bub1 en la levadura S. pombe.Métodos: Para estudiar la regulación del SAC, se usó el análisis genético y microscópico de la división celular en mutantes defectivos de este sistema de control en mitosis. Técnicas como la transformación y la clonación también fueron utilizadas.Resultados: Hemos demostrado que el SAC está regulado por la ruta de estrés de la MAPK pmk1 en S. pombe. La inactivación de la ruta MAPK a través de la deleción de pmk1, hace que las células sean sensibles a una droga que induce despolimerización en los microtúbulos del spindle, indicativo de defectos en el SAC. Mediante análisis genético, encontramos que este mecanismo es dependiente de bub1, un regulador central del SAC. Además, se ha estudiado la división celular en un mutante de Bub1 en el que se han eliminado 5 sitios putativos de fosforilación por MAPKs observándose, que dicho mutante es incapaz de llevar a cabo una segregación cromosómica correcta.Conclusiones: Se ha determinado que la ruta de la MAPK pmk1 se requiere para la supervivencia de S. pombe en condiciones en las que se compromete la función del huso mitótico así como la importancia de los sitios de fosforilación consenso de MAPK presentes en la quinasa Bub1. Nuestro estudio revela una conexión entre las rutas de MAPKs y el correcto funcionamiento del SAC. La pérdida total o parcial de esta regulación da lugar a eventos de aneuploidía. Este estudio puede ser relevante para entender cómo las células eucariotas evitan la aneuploidía, una de las características más comunes en tumores y que suelen modificar la progresión tumoral hacia diferentes estados de malignidad

Differential clinical characteristics and prognosis of intraventricular conduction defects in patients with chronic heart failure

Intraventricular conduction defects (IVCDs) can impair prognosis of heart failure (HF), but their specific impact is not well established. This study aimed to analyse the clinical profile and outcomes of HF patients with LBBB, right bundle branch block (RBBB), left anterior fascicular block (LAFB), and no IVCDs. Clinical variables and outcomes after a median follow-up of 21 months were analysed in 1762 patients with chronic HF and LBBB (n = 532), RBBB (n = 134), LAFB (n = 154), and no IVCDs (n = 942). LBBB was associated with more marked LV dilation, depressed LVEF, and mitral valve regurgitation. Patients with RBBB presented overt signs of congestive HF and depressed right ventricular motion. The LAFB group presented intermediate clinical characteristics, and patients with no IVCDs were more often women with less enlarged left ventricles and less depressed LVEF. Death occurred in 332 patients (interannual mortality = 10.8%): cardiovascular in 257, extravascular in 61, and of unknown origin in 14 patients. Cardiac death occurred in 230 (pump failure in 171 and sudden death in 59). An adjusted Cox model showed higher risk of cardiac death and pump failure death in the LBBB and RBBB than in the LAFB and the no IVCD groups. LBBB and RBBB are associated with different clinical profiles and both are independent predictors of increased risk of cardiac death in patients with HF. A more favourable prognosis was observed in patients with LAFB and in those free of IVCDs. Further research in HF patients with RBBB is warranted

Búsqueda selectiva de fármacos en la flora vascular andaluza que interfieran con el proceso de destoxificación celular, eficaces como coadyuvantes en la terapia antitumoral

El objetivo principal del tratamiento quimioterapico es conseguir la muerte de la célula tumoral. Para ello es necesario que la mayor cantidad de fármaco activo posible llegue a su diana molecular en el interior de la célula, si embargo, muchos pacientes desarrollan resistencia al tratamiento farmacológico. Cuando la resistencia farmacológica surge a fármacos no relacionados ni químicamente, ni por mecanismo de acción, se le llama resistencia a múltiples fármacos (MDR, Multi-Drug Resistance) (Dexter and Leith, 1986). Estos paciente tienen una capacidad normal para captar los fármacos, pero sus células tumorales sobre-expresan transportadores de membrana que los eliminan o destoxifican (Gottesman, 2002). Nuestro objetivo en este proyecto es la búsqueda de inhibidores de las bombas destoxificadoras que puedan ser usados como coadyuvantes en la terapia anti-tumoral. El descubrimiento de nuevos fármacos requiere de estrategias de escrutinios biológicos y de una fuente de principios activos. En nuestro laboratorio hemos desarrollado un bio-indicador de destoxificación celular basado en la levadura Schizosaccharomyces pombe. En esta levadura los mecanismos de destoxificación son muy similares a los que presentan las células humanas y dependen de los mismos transportadores. Usando este bio-indicador, estamos realizando ensayos sistemáticos de nuevos principios activos extraídos de la flora vascular andaluza.Dexter, D. L. and Leith, J. T. (1986). Tumor heterogeneity and drug resistance. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 4, 244-57.Gottesman, M. M. (2002). Mechanisms of cancer drug resistance. Annual review of medicine 53, 615-27

Uncovering moonlighting functions of nucleoporins across species

Trabajo presentado en la 24th International C.elegans Conference, celebrada en Glasgow (Escocia) del 24 al 28 de junio de 2023.Nuclear pore complexes (NPCs) are composed of multiple copies of 30-35 nucleoporins (Nups; NPPs in C. elegans) embedded in the nuclear envelope (NE) and act as regulators of RNA and protein transport between the cytoplasm and nucleoplasm. In addition to their function in nucleocytoplasmic transport, the contact of Nups with chromatin at NPCs and in the nuclear interior has allowed the emergency of non-transport functions. These non-canonical functions of Nups are relevant to human pathologies and developmental phenotypes that arise as a result of Nup mutations. Moreover, there are Nups that gain a new localization upon certain stress conditions, such as heat stress. These ¿mobile Nups¿ have been detected both in human and fission yeast cells. The mechanisms underlying the mobility of Nups, and the phenotypes and pathologies associated with defects in these new roles of mobile Nups are just emerging in the field. The general hypothesis of this project is that specific nucleoporins have acquired new functions during evolution, acting therefore as moonlighting proteins. We recently discovered a novel heat stress-induced structure in fission yeast, termed nucleolar rings (NuRs), which accumulate of a specific subset of Nups (PMID: 33176152). To uncover moonlighting functions of nucleoporins conserved across species we apply acute heat stress to a variety of C. elegans strains with deletions and/or fluorescent tags in endogenous Nup (npp) loci. We report that certain Nups detach rapidly from NPCs upon exposure to heat stress whereas other Nups remain stable. Unexpectedly, the behaviour of individual Nups seems not to correlate with their position within the NPC. Benefitting from the many genome tagging and mutagenesis efforts in the community, we expect to perform a systematic analysis of most NPC components and thereby obtain a detailed view of Nups in stress resistance.Peer reviewe

Relationship between eating styles and temperament in an Anorexia Nervosa, Healthy Control, and Morbid Obesity female sample

Contains fulltext : 127209.pdf (Publisher’s version ) (Closed access)Objectives: Eating styles have been studied in both Obesity (OB) and Eating Disorders (ED), but they have not been examined in these two weight conditions together. The present study explores differences in eating styles in an Anorexia Nervosa (AN) and OB sample, compared to Healthy Controls (HC), and it analyses their relationship with Body Mass Index (BMI) and personality traits. Method: The total sample consisted of 291 female participants (66 AN, 79 OB and 146 HC). Evaluation: Assessment measures included the Dutch Eating Behaviour Questionnaire-DEBQ- and the Temperament and Character Inventory-Revised-TCI-R-. Results: The MANCOVA test showed significant differences among the three groups for all eating styles, with emotional eating being more typical in the OB group and restrained eating more typical in the AN group. Partial correlation analyses showed relationships between emotional and external eating and BMI, as well as relationships with different temperament and character traits. The step-wise discriminant function analysis showed that the DEBQ correctly classified 65.6% of the sample into the three weight categories; when combined with the TCI-R, correct classification increased to 72.6%. Conclusions: Weight conditions showed different eating behaviour patterns. Temperament and character traits were related to eating behaviours. DEBQ and TCI-R were able to discriminate between groups. Differences in eating styles in the weight groups can have implications for understanding the development and maintenance of OB and ED.8 p

Diagnosis and management of asymptomatic bacteriuria in kidney transplant recipients: a survey of current practice in Europe

International audienceBackgroundAsymptomatic bacteriuria is frequent in kidney transplant recipients (KTRs). However, there is no consensus on diagnosis or management. We conducted a European survey to explore current practice related to the diagnosis and management of asymptomatic bacteriuria in adult KTRs.MethodsA panel of experts from the European Renal Association–European Dialysis Transplant Association/Developing Education Science and Care for Renal Transplantation in European States working group and the European Study Group for Infections in Compromised Hosts of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases designed this cross-sectional, questionnaire-based, self-administered survey. Invitations to participate were e-mailed to European physicians involved in the care of KTRs.ResultsTwo hundred and forty-four participants from 138 institutions in 25 countries answered the survey (response rate 30%). Most participants [72% (176/244)] said they always screen for asymptomatic bacteriuria in KTRs. Six per cent (15/240) reported never treating asymptomatic bacteriuria with antibiotics. When antimicrobial treatment was used, 24% of the participants (53/224) said they would start with empirical antibiotics. For an episode of asymptomatic bacteriuria caused by a fully susceptible microorganism and despite no contraindications, a majority of participants (121/223) said they would use a fluoroquinolone (n = 56), amoxicillin/clavulanic acid (n = 38) or oral cephalosporins (n = 27).ConclusionsScreening for and treating asymptomatic bacteriuria are common in KTRs despite uncertainties around the benefits and harms. In an era of antimicrobial resistance, further studies are needed to address the diagnosis and management of asymptomatic bacteriuria in these patients