Nanobiotechnologie: Werkzeuge für die Proteomik : molekulare Organisation und Manipulation von Proteinen und Proteinkomplexen in Nanodimensionen

First milestone of this Ph.D. thesis was the successful extension of conventional NTA/His-tag technique to self-assembling, multivalent chelator thiols for high-affinity recognition as well as stable and uniform immobilization of His-tagged proteins on chip surfaces. Bis-NTA was linked via an oligoethylene glycol to alkyl thiols by an efficient modular synthesis strategy yielding a novel, multivalent compound for formation of mixed SAMs with anti-adsorptive matrix thiols on gold. Multivalent chelator chips allow a specific, high-affinity, reversible, long-term immobilization of His-tagged proteins. In AFM studies reversibility of the specific protein immobilization process was visualized at single molecule level. The entire control over the orientation of the immobilized protein promotes this chip surface to an optimal platform for studies focusing on research targets at single molecule level and nanobiotechnology. Based on the constructed protein chip platform above and a novel AFM mode (contact oscillation mode, COM) – developed during the current Ph.D. work – protein nanolithography under physiological conditions enabling fabrication of active biomolecular patterns in countless variety has been established. Reversible COM-mediated nanostructuring is exceptionally suitable for multiplexed patterning of protein assemblies in situ. The first selfassembled protein layer acts as a biocompatible and ductile patterning material. Immobilized proteins can be replaced by the AFM tip applying COM, and the generated structures can be erased and refilled with different proteins, which are immobilized in a uniform and functional manner. Multi-protein arrays can be systematically fabricated by iterative erase-and-write processes, and employed for protein-protein interaction analysis. Fabrication of two-dimensionally arranged nanocatalytic centres with biological activity will establish a versatile tool for nanobiotechnology. As an alternative chip fabrication approach, the combined application of methodologies from surface chemistry, semiconductor technology, and chemical biology demonstrated successfully how pre-patterned templates for micro- and nanoarrays for protein chips are fabricated. The surface physical, as well the biophysical experiments, proved the functionality of this technology. The promises of such process technology are fast and economic fabrication of ready-to-use nanostructured biochips at industrial scale. Membrane proteins are complicated in handling and hence require sophisticated solutions for chip technological application. A silicon-on-insulator (SOI) chip substrate with microcavities and nanopores was employed for first technological investigation to construct a protein chip suitable for membrane proteins. The formation of an artificial lipid bilayer using vesicle fusion on oxidized SOI cavity substrates was verified by CLSM. Future AFM experiments will give further insights into the chip architecture and topography. This will provide last evidence of the sealing of the cavity by the lipid bilayer. Transmembrane proteins will be employed for reconstitution experiments on this membrane protein chip platform. Highly integrated microdevices will find application in basic biomedical and pharmaceutical research, whereas robust and portable point-of-care devices will be used in clinical settings.Erster Meilenstein der vorliegenden Arbeit war die erfolgreiche Erweiterung des konventionellen NTA/His-tag-Konzepts auf selbst-assemblierende, multivalente Chelatorthiole für die hochaffine Erkennung und stabile, einheitliche Immobilisierung His-getaggter Proteine auf Chipoberflächen. Mittels einer effizienten, modularen Synthesestrategie wurden Bis-NTA-Module über Oligoethylenglykoleinheiten an Alkylthiole angebunden. Diese Chelatorthiole wurden zusammen mit antiadsorptiven Matrixthiolen zur Ausbildung gemischter selbst-assemblierender Monolagen (SAMs) auf Goldoberflächen eingesetzt. Die multivalenten Chelatorchips erlauben eine spezifische, hochaffine, umkehrbare und langfristige Immobilisierung His-getaggter Proteine. Die Umkehrbarkeit der spezifischen Proteinimmobilisierung wurde in rasterkraftmikroskopischen (AFM) Studien bis zur Einzel-Molekül-Ebene visualisiert. Die vollständige Kontrolle über die Orientierung immobilisierter Proteine qualifiziert diese entwickelte Chipoberfläche zu einer optimalen Plattform für Anwendungsbereiche der Einzelmolekülbiochemie und Nanobiotechnologie. Basierend auf dieser Plattform für Proteinchips und einem – im Rahmen dieser Arbeit – neuentwickelten AFM-Modus (Kontaktoszillationsmodus, COM) wurde die „Protein-Nanolithographie“ etabliert, welche die Fabrikation von aktiven, biomolekularen Strukturen in unzähliger Vielfalt ermöglicht. Die umkehrbare COM-vermittelte Nanolithographie ist insbesondere für die multiplexe Anordnung von Proteinverbänden in situ geeignet. Die erste Schicht immobilisierter Proteine fungiert als ein biokompatibles und verformbares Strukturierungsmaterial. Diese immobilisierten Proteine können nun im Kontaktoszillationsmodus mit der AFM-Spitze lokal entfernt („Löschen“) und gegen andere Proteine – die an die freigelegte Chipoberfläche ebenfalls spezifisch und funktional immobilisieren – ausgetauscht werden („Schreiben“). Arrays, bestehend aus mehreren unterschiedlichen Proteinen können nun systematisch in iterativen Lösch-und-Schreib-Vorgängen fabriziert und für Proteininteraktionsanalysen eingesetzt werden. Die Fabrikation von zwei-dimensional arrangierten nanokatalytischen Zentren mit biologischer Aktivität wird von großem Nutzen für die Nanobiotechnologie sein. Eine alternative Herstellungsmethode aus einer Kombination von Oberflächenchemie, Halbleitertechnologie und chemischer Biologie wurde für die Fabrikation von vorstrukturierten Templaten für Mikro- und Nanoarrays entwickelt. Die Funktionalität dieser Chipplattform wurde anhand oberflächen- und biophysikalischer Experimente erfolgreich gezeigt. Zukünftiges Ziel ist die Anfertigung vorstrukturierter Template in der Dimension weniger Nanometer zur Ausbildung von Bio-Arrays mit einzelnen Molekülen. Ein weiteres Ziel besteht in der kompletten Verlagerung des Herstellungsprozesses in die Gasphase. Eine Produktion in der Gasphase verspricht eine schnelle und wirtschaftliche Erzeugung sofort einsatzbereiter nanostrukturierter Biochips im industriellen Maßstab. Der Umgang mit Membranproteinen verlangt besondere Vorkehrungen im experimentellen Milieu, ebenso speziell sind die Bedürfnisse in den entsprechenden Chip-Anwendungen. Ein Chip mit Mikrokavitäten und Nanoporen, basierend auf der „Silicon-on-Insulator“ (SOI)-Technologie, wurde für erste technologische Studien zum Entwurf eines Proteinchips für Membranproteine eingesetzt. Künstliche Lipidmembranen wurden auf der SOI-Oberfläche mittels Vesikelfusion ausgebildet und mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie gezeigt. Zukünftige AFM-Experimente werden weitere Einsichten in die Chiparchitektur und Topographie ermöglichen. Transmembranproteine werden in Rekonstitutionsexperimenten für funktionale Studien der Membranproteinchips eingesetzt. Anwendungsbereiche solcher hochintegrierten Mikrosysteme sind sowohl in der biologischen Grundlagenforschung als auch in mobilen Diagnostikgeräten im klinischen Einsatz zu finden

»Small is beautiful« : Bioforschung in der Nanowelt

Im Zuge der steigenden Bedeutung der Proteomforschung und der »Molekularisierung« der Medizin werden neue, effizientere Plattformen zur Untersuchung von Proteinen und deren Wechselwirkungen notwendig. Hier bietet die Nanotechnologie, eine Wissenschaft mit Ursprüngen in der Physik und der Halbleiterindustrie, attraktive Lösungsperspektiven. Ein Bereich der Forschung am Institut für Biochemie der Universität Frankfurt um Prof. Dr. Robert Tampé widmet sich den Aspekten der Nanotechnologie zur Entwicklung von Protein-Chips für die Proteomforschung und Erzeugung von Mustern im Kleinstformat

Anchoring of Histidine-Tagged Proteins to Molecular Printboards: Self-assembly, Thermodynamic Modeling, and Patterning

In this paper the multivalent binding of hexahistidine (His6)-tagged proteins to β-cyclodextrin (β-CD) self-assembled monolayers (SAMs) by using the nickel(II) complex of a hetero-divalent orthogonal adamantyl nitrilotriacetate linker (4) is described. Nonspecific interactions were suppressed by using monovalent adamantyl-hexa(ethylene glycol) derivative 3. With the mono-His6-tagged maltose binding protein (His6-MBP), thermodynamic modeling based on surface plasmon resonance (SPR) titration data showed that the MBP molecules in solution were linked, on average, to Ni4 in 1:1 stoichiometry. On the surface, however, the majority of His6-MBP was complexed to surface-immobilized β-CDs through three Ni4 complexes. This difference is explained by the high effective β-CD concentration at the surface and is a new example of supramolecular interfacial expression. In a similar adsorption scheme, SPR proved that the α-proteasome could be attached to β-CD SAMs in a specific manner. Patterning through microcontact printing of (His6)4-DsRed-fluorescent timer (DsRed-FT), which is a tetrameric, visible autofluorescent protein, was carried out in the presence of Ni4. Fluorescence measurements showed that the (His6)4-DsRed-FT is bound strongly through Ni4 to the molecular printboard

Reversible Immobilization of Proteins in Sensors and Solid‐State Nanopores

The controlled functionalization of surfaces with proteins is crucial for many analytical methods in life science research and biomedical applications. Here, a coating for silica‐based surfaces is established which enables stable and selective immobilization of proteins with controlled orientation and tunable surface density. The coating is reusable, retains functionality upon long‐term storage in air, and is applicable to surfaces of complex geometry. The protein anchoring method is validated on planar surfaces, and then a method is developed to measure the anchoring process in real time using silicon nitride solid‐state nanopores. For surface attachment, polyhistidine tags that are site specifically introduced into recombinant proteins are exploited, and the yeast nucleoporin Nsp1 is used as model protein. Contrary to the commonly used covalent thiol chemistry, the anchoring of proteins via polyhistidine tag is reversible, permitting to take proteins off and replace them by other ones. Such switching in real time in experiments on individual nanopores is monitored using ion conductivity. Finally, it is demonstrated that silica and gold surfaces can be orthogonally functionalized to accommodate polyhistidine‐tagged proteins on silica but prevent protein binding to gold, which extends the applicability of this surface functionalization method to even more complex sensor devices

Cell adhesion molecule DM-GRASP presented in different nanopatterns to neurons regulates attachment and neurite growth

Adhesion and neurite formation of neurons and neuroblastoma cells critically depends on the lateral spacing of the cell adhesion molecule DM-GRASP offered as nanostructured substrate

Molecular self-assembly, chemical lithography, and biochemical tweezers: A path for the fabrication of functional nanometer-scale protein arrays

Turchanin A, Tinazli A, El-Desawy M, et al. Molecular self-assembly, chemical lithography, and biochemical tweezers: A path for the fabrication of functional nanometer-scale protein arrays. Advanced Materials. 2008;20(3):471-477.Electron-induced chemical lithography combined with self-assembled monolayers and multivalent chelators for high-affinity capturing of His-tagged proteins are used to obtain specific, stable, highly parallel, and functional protein micro- and nanoarrays on solid substrates. ne functionality of the generated large-area protein arrays is shown in situ via specific, homogeneous, oriented and reversible immobilization of His(6)-tagged 20S proteasome and fluorescence labelled His(10)-tagged maltose binding proteins