Purification of HPV16 E6/E7 DNA plasmid-based vaccine using a modified monolithic support

Human papillomavirus (HPV) is one of the most common sexually transmitted diseases in the world and has been associated with several human cancers, like cervical cancer. Thus, effective vaccination against Human papillomavirus represents an opportunity for the control of this cancer. The development of therapeutic Human papillomavirus vaccines is required to facilitate the control and eliminate on of a preexisting Human papillomavirus infection. In the last years, the expansion of efficient plasmid DNA purification processes has fostered therapeutics applications like gene therapy and DNA vaccination. Recently, the application of chromatographic operations based on affinity interactions between plasmid DNA or impurities with specific amino acids immobilized in stationary phases has demonstrated good results in the supercoiled plasmid DNA purification. Despite of selectivity achieved with these ligands, conventional matrices present limitations such as the low binding capacity and diffusivity for plasmid DNA samples. Owing to bottlenecks associated to conventional matrices, monolithic supports have emerged as interesting alternatives due to the versatility of their structural characteristics. The research work present in this thesis describes a new strategy that combines the selectivity of arginine as affinity ligand with the versatility of the epoxy-based monoliths to efficiently purify the supercoiled HPV-16 E6/E7 plasmid from other plasmid isoforms and Escherichia coli impurities present in clarified lysate. Additionally, breakthrough experiments were designed to compare the dynamic binding capacity of plasmid DNA to the conventional arginine-agarose matrix with the modified monolithic support. The dynamic binding capacity obtained for the arginine-epoxy monolith was significantly higher than the capacity achieved in the arginine conventional support. Quality control tests indicated that the plasmid sample resultant from the purification step presented a purity degree approximately 100% and an homogeneity higher than 97% of supercoiled isoform, with an extremely reduced level of impurities (RNA, proteins, genomic DNA and endotoxins). Overall, given that the plasmid DNA final product meets regulatory specifications, this combined support can be the key to obtain an adequate non-viral vaccine against a Human papillomavirus infection.O Papiloma Vírus Humano é um vírus sexualmente transmissível que está relacionado com o desenvolvimento de vários cancros, como o cancro do colo do útero. Este tipo de cancro é a segunda maior causa de morte em mulheres, afetando mundialmente cerca de meio milhão de mulheres, das quais aproximadamente 274 mil morrem. A evidente associação que existe entre o Papiloma Vírus Humano e o cancro do colo do útero torna o Papiloma Vírus Humano um alvo interessante para o desenvolvimento de vacinas, no sentido de prevenir ou tratar o desenvolvimento do cancro. Atualmente, já são comercializadas duas vacinas preventivas, a Gardasil da Merck e a Cervarix da GlaxoSmithKline. Apesar de ambas mostrarem ser eficazes e seguras, possuem algumas limitações como elevado custo, não protegem contra todos os tipos de Papiloma Vírus Humano e trata-se de vacinas exclusivamente preventivas. Assim o desenvolvimento de vacinas terapêuticas pode ser uma estratégia promissora para colmatar estas falhas. A utilização do DNA plasmídico (pDNA) como uma vacina não viral tem-se tornado numa potencial estratégia terapêutica para prevenir ou tratar determinadas doenças de forma menos invasiva e segura comparando com os vetores virais. O mecanismo de actuação desta vacina baseia-se na expressão de proteínas antigénicas que desencadeiam uma resposta imunológica, evitando a progressão da doença . A preparação destas vacinas de DNA plasmídico requer o desenvolvimento de processos de produção e purificação que permitam obter grandes quantidades de plasmídeo na sua forma biologicamente ativa (isoforma superenrolada (sc)), cumprindo os requisitos das agências reguladoras no que diz respeito ao grau de pureza. Da ocorrência natural de complexos proteínas-DNA em sistemas biológicos sugeriu o desenvolvimento de uma estratégia de cromatografia de afinidade, utilizando matrizes convencionais de agarose com determinados aminoácidos imobilizados que reconhecem especificamente a isoforma superenrolada do DNA plasmídico. No entanto, as matrizes convencionais apresentam algumas limitações quando comparadas com os suportes monolíticos que possuem excelentes propriedades de transferência de massa e elevada capacidade de ligação para moléculas de grandes dimensões como o DNA plasmídico. Desta forma, o trabalho apresentado nesta tese consistiu na modificação de um monolito de epoxy por imobilização de aminoácidos de arginina, conjugando assim a selectividade deste ligando com a versatilidade do monolito de epoxy, tendo como finalidade purificar a isoforma sc do pDNA HPV-16 E6/E7. Numa fase inicial, foram realizados vários ensaios com amostras de DNA plasmídico pre-purificadas com o kit comercial, no sentido de avaliar e confirmar a presença dos ligandos de arginina, comparando o comportamento cromatográfico do monolito modificado com o mesmo suporte não modificado. Os resultados comprovaram que o monolito modificado reconhece especialmente o DNA plasmídico, permitindo a separação das isoformas superenrolada e circular aberta através de um gradiente por passos de NaCl. O mesmo não aconteceu com o monolito de epoxy não modificado, pois não ocorreu qualquer tipo de interacção do plasmídeo com o suporte. Posteriormente foi realizado um estudo de capacidade de ligação dinâmica para completar a caracterização do monolito com ligandos de arginina e comparar com a coluna convencional de arginina-argarose. Os resultados comprovaram que, para as mesmas condições de caudal e concentração de pDNA HPV-16 E6/E7, o monolito possui uma capacidade de ligação significativamente superior em comparação com a coluna convencional. Uma vez conseguida a separação das isoformas e a caracterização do monolito modificado com a arginina, a segunda fase do trabalho consistiu na purificação da isoforma sc do pDNA HPV-16 E6/E7 a partir de um lisado complexo de Escherichia coli. Os testes de controlo de qualidade revelaram que a amostra de sc de pDNA HPV-16 E6/E7, resultante da purificação com o monolito de epoxy modificado, apresentava um grau de pureza de aproximadamente 100% e uma homogeneidade superior a 97%. Para além disso, constituintes do hospedeiro como RNA e proteínas não foram detectados na amostra purificada e a quantidade de DNA genómico e endotoxinas estavam a baixo dos valores referenciados pelas agências reguladoras como a Food and Drug Delivery. Em suma, a combinação de ligandos de aminoácidos com suportes monolíticos pode ser uma solução promissora para obtenção de uma vacina não-viral baseada na isoforma sc do pDNA HPV-16 E6/E7, com o grau de pureza requerido para futuras aplicações terapêuticas contra a infecção por Papiloma Vírus Humano

Characterisation of microbial attack on archaeological bone

As part of an EU funded project to investigate the factors influencing bone preservation in the archaeological record, more than 250 bones from 41 archaeological sites in five countries spanning four climatic regions were studied for diagenetic alteration. Sites were selected to cover a range of environmental conditions and archaeological contexts. Microscopic and physical (mercury intrusion porosimetry) analyses of these bones revealed that the majority (68%) had suffered microbial attack. Furthermore, significant differences were found between animal and human bone in both the state of preservation and the type of microbial attack present. These differences in preservation might result from differences in early taphonomy of the bones. © 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved