Development and use of a yeast model system to study the cellular toxicity of human alpha-synuclein.

De ziekte van Parkinson (PD) treft meer dan 1% van de personen ouder dan 65. Dit aantal stijgt zelfs tot meer dan 5% voor 85-jarigen. Na de ziekte van Alzheimer wordt PD hierdoor de tweede meest voorkomende neurodegeneratieve ziekte. De ziekte uit zich hoofdzakelijk in motorische problemen. Typische kenmerken zijn bradykinesie, spierstijfheid, rusttremor en posturale instabiliteit. In een later stadium kan dit gepaard gaan met depressie en dementie, waardoor de onafhankelijkheid van de getroffen persoon verder aan banden wordt gelegd. Pathologisch gezien treedt er een progressieve degeneratie op van dopamine-producerende neuronen in de substantia nigra pars compacta en ontstaan er in de neuronen eiwit-achtige afzettingen die Lewy bodies (LB) worden genoemd.Leeftijd is een belangrijke risicofactor in het ontstaan van PD, maar een aantal omgevingsfactoren zouden eveneens het risico op PD beïnvloeden. Daarenboven werden er mutaties gevonden in een aantal genen die verantwoordelijk zijn voor de erfelijke vorm van de ziekte. Drie puntmutaties zijn geïdentificeerd in het SNCA gen dat codeert voor het proteïne a‑synucleïne en het hoofdbestanddeel vormt van LB. Daarnaast zijn er ook multiplicaties van dit gen waargenomen. De functie van a‑synucleïne blijft daarentegen nogal vaag, net zoals zijn rol in PD.In deze thesis werd er een gehumanizeerd gistmodel op punt gesteld en aangewend om de fysiologie en de cellulaire toxiciteit van a‑synucleïne nader te bestuderen. Om de eigenschappen van humaan a‑synucleïne beter in kaart te brengen, werd dit proteïne tot expressie gebracht in gist. Uit dit model blijkt dat wild type a‑synucleïne (WT‑syn) en de mutant A53T gelokalizeerd zijn aan de plasmamembraan van de gistcellen, waar zij kunnen aggregeren volgens een nucleatie-elongatie principe. Volgens dit principe creëert membraangebonden a‑synucleïne zogeheten kernen die dan instaan voor de aggregatie van de cytosolische vorm van het proteïne. Verder bemoeilijkt de aggregatie van WT‑syn en A53T het endocytose proces in gist, hetgeen de mogelijke functie van a‑synucleïne in het vesiculaire verkeer benadrukt.In tegenstelling tot WT‑syn en A53T bevindt de A30P mutant zich uitsluitend in het cytoplasma en werden hiervan bijgevolg geen aggregaten waargenomen in gistcellen.Er zijn verschillende parameters die de aggregatie beïnvloeden. Verhoging van het fosfolipidengehalte in de gistcellen en inhibitie van het proteasoom stimuleren de aggregaatvorming van a‑synucleïne. De inductie van autofagie daarentegen inhibeert de aggregaatvorming. Een volgend deel in deze thesis spitste zich toe op het belang van a‑synucleïne en oxidatieve stress in de ontwikkeling van PD.Ijzer-ionen verhogen de productie van vrije zuurstofradicalen (ROS) en stimuleren daardoor de aggregatie van a‑synucleïne in gist. Ook de heterologe expressie van WT‑syn in gistcellen heeft in deze context twee gevolgen. Ten eerste veroorzaakt WT‑syn een verhoogde productie van ROS en ten tweede maakt WT‑syn de cellen gevoeliger voor extra oxidatieve stress. Vertrekkende van het feit dat ROS in staat zijn om apoptose in gist te induceren, werden een aantal apoptotische merkers aangetoond.In gist is Yca1 een caspase dat mede verantwoordelijk is voor apoptose. Dit proteïne heeft een modulerende rol op de a‑synucleïne-toxiciteit in exponentieel groeiende, maar niet in stationaire faze-, gistcellen (Buttner et al., 2008). Deletie van het YCA1 gen stimuleert de aggregaatvorming van WT‑syn in deze exponentieel groeiende cellen.Het verouderingsproces wordt daarenboven nauw in verband gebracht met ROS en is beschreven in de Free Radical Theory of Aging . Met betrekking tot dit onderzoeksproject werd vervolgens aangetoond dat WT‑syn een drastische impact heeft op de levensduur van verouderde gistcellen. Dit effect kan volledig toegeschreven worden aan apoptose (Buttner et al., 2008). Ten slotte, in een laatste deel, werden proteïnen geïdentificeerd die het toxisch effect van a‑synucleïne in gist moduleren. Expressie van het tau‑proteïne of een klinische mutant hiervan (P301L‑tau), zorgt samen met WT‑syn of A53T voor verminderde celgroei en een verhoogde a‑synucleïne-aggregatie. Daarenboven werden na screening van een humane hippocampale cDNA bank proteïnen gevonden die de cellulaire toxiciteit van a‑synucleïne beïnvloeden. Het resultaat van deze screening is zeker relevant, aangezien de proteïnen betrokken zijn in het vesiculaire verkeer, de organizatie van actine en het microtubuli systeem. Reeds eerder werden deze systemen in verband gebracht met a‑synucleïne en/of PD. Co‑expressie van de proteïnen met WT‑syn verhoogt het toxisch effect en resulteert in een afwijkend aggregatie-gedrag van a‑synucleïne in gistcellen. Eén van deze proteïnen is Dkk3 dat, net zoals a‑synucleïne in gist, apoptose stimuleert. Deze thesis bevestigt de vele voordelen van het gebruik van Saccharomyces cerevisiae als modelsysteem. Bestaande gegevens betreffende de (patho‑)fysiologie en de cellulaire toxiciteit van a‑synucleïne werden geconfirmeerd en uitgebreid. Bovendien werd er additioneel bewijs geleverd voor het belang van het proteasoom, autofagie, ROS en oxidatieve stress, mitochondriale functie, apoptose en vesiculair verkeer in de ontwikkeling van PD. Toekomstgewijs biedt dit gistsysteem dan ook perspectieven voor het verdere onderzoek omtrent deze aandoening.status: publishe

Antifungal activity in plants from Chinese traditional and folk medicine

ETHNOPHARMACOLOGICAL RELEVANCE: From over 100 Chinese clinical trial publications, we retrieved 22 commercial preparations and 17 clinical prescriptions used as Traditional Chinese Medicine (TCM) for treating mycotic vaginitis, typically caused by Candida albicans. The 8 most frequently used plants as well as another 7 TCM and 18 folk medicinal plants used in the South of China for antifungal therapy were investigated for in vitro antifungal activity. CONCLUSIONS: The majority of plants, whose clinical use for antifungal treatment are well supported within TCM or Chinese folk medicine, show in vitro antifungal activity against Candida albicans. Since Candida species represent the most common fungal pathogen of humans, these results provide more scientific evidence supporting the clinical application of these plants, and can serve as a starting point for new drug discovery from TCM and Chinese folk medicine.status: publishe

Phosphorylation, lipid raft interaction and traffic of α-synuclein in a yeast model for Parkinson

Parkinson's disease is a neurodegenerative disorder characterized by the formation of Lewy bodies containing aggregated α-synuclein. We used a yeast model to screen for deletion mutants with mislocalization and enhanced inclusion formation of α-synuclein. Many of the mutants were affected in functions related to vesicular traffic but especially mutants in endocytosis and vacuolar degradation combined inclusion formation with enhanced α-synuclein-mediated toxicity. The screening also allowed for identification of casein kinases responsible for α-synuclein phosphorylation at the plasma membrane as well as transacetylases that modulate the α-synuclein membrane interaction. In addition, α-synuclein was found to associate with lipid rafts, a phenomenon dependent on the ergosterol content. Together, our data suggest that toxicity of α-synuclein in yeast is at least in part associated with endocytosis of the protein, vesicular recycling back to the plasma membrane and vacuolar fusion defects, each contributing to the obstruction of different vesicular trafficking routes

A yeast-based model of α-synucleinopathy identifies compounds with therapeutic potential

AbstractWe have developed a yeast-based model recapitulating neurotoxicity of α-synuclein fibrilization. This model recognized metal ions, known risk factors of α-synucleinopathy, as stimulators of α-synuclein aggregation and cytotoxicity. Elimination of Yca1 caspase activity augmented both cytotoxicity and inclusion body formation, suggesting the involvement of apoptotic pathway components in toxic α-synuclein amyloidogenesis. Deletion of hydrophobic amino acids at positions 66–74 in α-synuclein reduced its cytotoxicity but, remarkably, did not lower the levels of insoluble α-synuclein, indicating that noxious α-synuclein species are different from insoluble aggregates. A compound screen aimed at finding molecules with therapeutic potential identified flavonoids with strong activity to restrain α-synuclein toxicity. Subsequent structure–activity analysis elucidated that these acted by virtue of anti-oxidant and metal-chelating activities. In conclusion, this yeast-cell model as presented allows not only fundamental studies related to mechanisms of α-synuclein-instigated cellular degeneration, but is also a valid high-throughput identification tool for novel neuroprotective agents

A fungicidal piperazine-1-carboxamidine induces mitochondrial fission-dependent apoptosis in yeast

To unravel the working mechanism of the fungicidal piperazine-1-carboxamidine derivative BAR0329, we found that its intracellular accumulation in Saccharomyces cerevisiae is dependent on functional lipid rafts. Moreover, BAR0329 induced caspase-dependent apoptosis in yeast, in which the mitochondrial fission machinery consisting of Fis1 (Whi2), Dnm1 and Mdv1 is involved. Our data are consistent with a prosurvival function of Fis1 (Whi2) and a proapoptotic function of Dnm1 and Mdv1 during BAR0329-induced yeast cell death