Improvement of the design and generation of highly specific plant knockdown lines using primary synthetic microRNAs (pri-smiRNAs)

Niemeier S, Alves jun. L, Merkle T. Improvement of the design and generation of highly specific plant knockdown lines using primary synthetic microRNAs (pri-smiRNAs). BMC Research Notes. 2010;3(1): 59.Background: microRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs that post-transcriptionally regulate gene expression. In plants, they typically show high complementarity to a single sequence motif within their target mRNAs and act by catalyzing specific mRNA cleavage and degradation. miRNAs are processed from much longer primary transcripts via precursor miRNAs containing fold-back structures. Leaving these secondary structures intact, miRNAs can be re-designed experimentally to target mRNAs of choice. Results: We designed primary synthetic miRNAs (pri-smiRNAs) on the basis of the primary transcript of the Arabidopsis MIR159A gene by replacing the original miR159a and the corresponding miR159a* with novel sequences, keeping the overall secondary structure as predicted by the program RNAfold. We used the program RNAhybrid to optimize smiRNA design and to screen the complete Arabidopsis transcriptome for potential off-targets. To improve the molecular cloning of the pri-smiRNA we inserted restriction sites in the original MIR159A primary transcript to easily accommodate the smiRNA/smiRNA* DNA fragment. As a proof-of-concept, we targeted the single gene encoding chalcone synthase (CHS) in Arabidopsis. We demonstrate smiRNA(CHS) expression and CHS mRNA cleavage in different transgenic lines. Phenotypic changes in these lines were observed for seed color and flavonol derivatives, and quantified with respect to anthocyanin content. We also tested the effect of mismatches and excess G:U base pairs on knockdown efficiency. Conclusions: RNAhybrid-assisted design of smiRNAs and generation of pri-smiRNAs using a novel vector containing restriction sites greatly improves specificity and speed of the generation of stable knockdown lines for functional analyses in plants

Comprehensive prediction of novel microRNA targets in Arabidopsis thaliana

MicroRNAs (miRNAs) are 20–24 nt long endogenous non-coding RNAs that act as post-transcriptional regulators in metazoa and plants. Plant miRNA targets typically contain a single sequence motif with near-perfect complementarity to the miRNA. Here, we extended and applied the program RNAhybrid to identify novel miRNA targets in the complete annotated Arabidopsis thaliana transcriptome. RNAhybrid predicts the energetically most favorable miRNA:mRNA hybrids that are consistent with user-defined structural constraints. These were: (i) perfect base pairing of the duplex from nucleotide 8 to 12 counting from the 5′-end of the miRNA; (ii) loops with a maximum length of one nucleotide in either strand; (iii) bulges with no more than one nucleotide in size; and (iv) unpaired end overhangs not longer than two nucleotides. G:U base pairs are not treated as mismatches, but contribute less favorable to the overall free energy. The resulting hybrids were filtered according to their minimum free energy, resulting in an overall prediction of more than 600 novel miRNA targets. The specificity and signal-to-noise ratio of the prediction was assessed with either randomized miRNAs or randomized target sequences as negative controls. Our results are in line with recent observations that the majority of miRNA targets are not transcription factors

Etablierung und Optimierung der synthetischen primär-microRNA Technik für funktionale Genomanalysen in Arabidopsis thaliana

Niemeier S. Etablierung und Optimierung der synthetischen primär-microRNA Technik für funktionale Genomanalysen in Arabidopsis thaliana. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2010.MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse kleiner, nicht kodierender RNAs in Eukaryoten, die die Regulation ihrer Zielgene (targets) durch Spaltung der Transkripte oder Inhibition der Translation auf post-transkriptioneller Ebene vermitteln. miRNAs werden aus größeren, strukturell definierten Primärtranskripten prozessiert und zeigen in Pflanzen hohe Komplementarität zu den Zielsequenzen ihrer targets. Diese Eigenschaften können ausgenutzt werden, um künstliche oder synthetische miRNAs (amiRNAs oder smiRNAs) für gewünschte Gene oder Genfamilien zu exprimieren und deren (simultanen) knockdown herbeizuführen. In dieser Arbeit wurde das miRNA Vorhersageprogramm RNAhybrid genutzt, um das Design von smiRNAs zu optimieren. Es diente der hochspezifischen Vorhersage von off-targets für eine smiRNA und trug so zur Auswahl geeigneter smiRNA-Kandidaten bei. Eine weitere Optimierung der smiRNA-Technik bestand in der Generierung eines Vektors ("easy-cloning" Vektor, ECV), der die Klonierung eines smiRNA-Primärtranskriptes in einem Ein-Schritt-Verfahren erlaubte. Durch Insertion neuer Schnittstellen in das Primärtranskript der natürlichen MIR159a konnten die neuen smiRNA- und die komplementären smiRNA*-Sequenzen auf vereinfachte und beschleunigte Weise eingefügt werden. Für die Validierung des Ansatzes wurde eine smiRNA für das Chalkonsynthase-Gen (CHS) in Arabidopsis entworfen. Die pri-smiRNA(CHS) wurde auf konventionelle Art sowie mit Hilfe des ECV-Ansatzes generiert und in Arabidopsis exprimiert. Einige transgene Pflanzen zeigten starke phänotypische Auffälligkeiten. Sekundärmetabolite wie Proanthocyanidine, Anthocyane und Flavonole, zu deren Produktion die CHS in Pflanzen katalysiert, waren in den verschiedenen untersuchten Linien unterschiedlich stark reduziert. Einige Linien ähnelten eher dem Wildtypphänotyp, andere erreichten fast die phänotypischen Ausprägungen, die für chs Mutanten beobachtet werden. In diesen Linien war die stärkste Reduktion der Flavonoide und der CHS-Transkriptmengen zu beobachten, was negativ mit der Expressionsstärke des smiRNA(CHS) precursors korrelierte. Der ECV-Ansatz war ebenso effektiv wie die konventionelle Strategie. Ein vorhergesagtes off-target für die smiRNA(CHS), das durch andere Mittel nicht gefunden wurde, konnte anhand von Expressionsstudien bestätigt werden. Die Transkriptmenge dieses Gens war in den untersuchten Linien reduziert, erreichte aber nicht das geringe Niveau wie die CHS-Transkripte in den gleichen Linien. Um das Design von smiRNAs weiterhin zu optimieren, wurden verschiedene Varianten der smiRNA(CHS) in Pflanzen exprimiert. Diese bildeten Hybridstrukturen mit der Zielsequenz aus, die sich entweder durch einzelne Fehlpaarungen oder einen gesteigerten Anteil an G:U-Paarungen auszeichneten. So sollte untersucht werden, welche Veränderungen toleriert werden können, damit die Regulierung des Zielgens noch gewährleistet war und welche strukturellen Eigenschaften zur Vermeidung von off-targets beitragen können. Molekulare und phänotypische Analysen der verschiedenen transgenen Linien zeigten eine Reduzierung der CHS-Transkriptmenge sowie resultierende Phänotypen in Pflanzen, die die smiRNA(CHS) mit einer Fehlpaarung im 5'-Bereich der smiRNA exprimierten. Doch die hohe Effektivität der perfekt gepaarten smiRNA(CHS) wurde nicht erreicht. Für die übrigen Varianten wurde nur ein begrenzter silencing Effekt beobachtet. Die optimierte smiRNA-Technik wurde weiterhin für den multiplen knockdown von Genen angewandt, die für eine kleine Familie von Poly(A)-bindenden Proteinen (PABPCs) in Arabidopsis kodieren. Drei verschiedene smiRNAs wurden generiert und in Pflanzen exprimiert, die jeweils unterschiedliche Kombinationen der PABPC-Gene zum target hatten. Die stärksten Phänotypen zeigten Pflanzen, in denen fünf Gene gleichzeitig herunterreguliert waren. Sie waren deutlich kleiner als Wildtyppflanzen und in ihrem Wachstum verzögert. Rosettenblätter waren auffallend gewellt, Infloreszenzen verkürzt und die Pflanzen blühten später als Wildtypen. Transgene Linien, in denen nur drei PABPC-Gene durch smiRNAs reguliert wurden, zeigten sehr milde Phänotypen oder glichen Wildtyppflanzen, so dass auf redundante Funktionen der einzelnen Familienmitglieder geschlossen werden kann. Untersuchungen zur Lokalisierung von Poly(A)-RNA in Pflanzen mit drastischen phänotypischen Effekten zeigten, dass mRNA hier verstärkt im Zellkern akkumulierte. Gleiches wurde für Wildtyppflanzen beobachtet, die mit Leptomycin B behandelt wurden. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die PABPCs in direkter oder indirekter Weise am Export von mRNPs beteiligt sind, höchstwahrscheinlich über den Exportin1-vermittelten Transportweg

How the Hunga Tonga—Hunga Ha'apai Water Vapor Cloud Impacts Its Transport Through the Stratosphere: Dynamical and Radiative Effects

Abstract The eruption of the Hunga Tonga—Hunga Ha'apai (HTHH) volcano on 15 January 2022 injected about 150 Tg of water vapor (H2O), roughly 10% of the background stratospheric H2O content, to altitudes above 50 km. Simulations of the spatial evolution of the H2O cloud with the ICON‐Seamless model are very close to observations from the Aura Microwave Limb Sounder. The vertical transport of the H2O cloud had three phases: an initial subsidence phase, a stable phase, and a rising phase. Radiative cooling of H2O clearly affects the transport of the H2O cloud, as demonstrated with passive tracers, and is the main driver within the subsidence phase. It also counteracts the large‐scale rising motion in the tropics, leading to the stable phase, and modulates the large‐scale transport of the H2O cloud for about 9 months. This holds for different QBO phases, where the H2O cloud differs mainly in its vertical extent

Stratospheric aerosol size reduction after volcanic eruptions

The stratospheric aerosol layer plays an important role in the radiative balance of Earth primarily through scattering of solar radiation. The magnitude of this effect depends critically on the size distribution of the aerosol. The aerosol layer is in large part fed by volcanic eruptions strong enough to inject gaseous sulfur species into the stratosphere. The evolution of the stratospheric aerosol size after volcanic eruptions is currently one of the biggest uncertainties in stratospheric aerosol science. We retrieved aerosol particle size information from satellite solar occultation measurements from the Stratospheric Aerosol and Gas Experiment III mounted on the International Space Station (SAGE III/ISS) using a robust spectral method. We show that, surprisingly, some volcanic eruptions can lead to a decrease in average aerosol size, like the 2018 Ambae and the 2021 La Soufrière eruptions. In 2019 an intriguing contrast is observed, where the Raikoke eruption (48∘ N, 153∘ E) in 2019 led to the more expected stratospheric aerosol size increase, while the Ulawun eruptions (5∘ S, 151∘ E), which followed shortly after, again resulted in a reduction in the values of the median radius and absolute distribution width in the lowermost stratosphere. In addition, the Raikoke and Ulawun eruptions were simulated with the aerosol climate model MAECHAM5-HAM. In these model runs, the evolution of the extinction coefficient as well as of the effective radius could be reproduced well for the first 3 months of volcanic activity. However, the long lifetime of the very small aerosol sizes of many months observed in the satellite retrieval data could not be reproduced

Additional file 2: Figure S2. of Hyaline cartilage calcification of the first metatarsophalangeal joint is associated with osteoarthritis but independent of age and BMI

DCR-images and histological examination. A. DCR-images with hyaline cartilage calcifications (original size and 3 × magnification) of cartilage-bone slabs of the metatarsal heads from different donors and the corresponding Safranin O stainings from the central load-bearing zone of the metatarsal head. Histological OA grade was evaluated by the OARSI score. Deposition of cartilage calcification was detectable in all OA grades (OARSI 0–6) by DCR. B. The existence of DCR-detectable hyaline cartilage calcification (calcium-phosphate-crystals) was histochemically confirmed by von Kossa stainings. (DOCX 2250 KB

Additional file 3: Figure S3. of Hyaline cartilage calcification of the first metatarsophalangeal joint is associated with osteoarthritis but independent of age and BMI

Study population histogram by decade. 84 donors; 37 female and 47 male. The mean age was 62.73 years, SD ± 18.8, range 20–93 years. (DOCX 20 KB

An overview of the Families Improving Together (FIT) for weight loss randomized controlled trial in African American families

BACKGROUND: The Families Improving Together (FIT) randomized controlled trial tests the efficacy of integrating cultural tailoring, positive parenting, and motivational strategies into a comprehensive curriculum for weight loss in African American adolescents. The overall goal of the FIT trial is to test the effects of an integrated intervention curriculum and the added effects of a tailored web-based intervention on reducing z-BMI in overweight African American adolescents. DESIGN AND SETTING: The FIT trial is a randomized group cohort design the will involve 520 African American families with an overweight adolescent between the ages of 11–16 years. The trial tests the efficacy of an 8-week face-to-face group randomized program comparing M+FWL (Motivational Family Weight Loss) to a comprehensive health education program (CHE) and re-randomizes participants to either an 8-week on-line tailored intervention or control on-line program resulting in a 2 (M+FWL vs. CHE group) × 2 (on-line intervention vs. control on-line program) factorial design to test the effects of the intervention on reducing z-BMI at post-treatment and at 6-month follow-up. INTERVENTION: The interventions for this trial are based on a theoretical framework that is novel and integrates elements from cultural tailoring, Family Systems Theory, Self-Determination Theory and Social Cognitive Theory. The intervention targets positive parenting skills (parenting style, monitoring, communication); cultural values; teaching parents to increase youth motivation by encouraging youth to have input and choice (autonomy-support); and provides a framework for building skills and self-efficacy through developing weight loss action plans that target goal setting, monitoring, and positive feedback