Contribución de residuos conservados de cisteína a la regulación redox del catabolismo de la Rubisco.

RESUMEN La Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) cataliza el primer paso en la asimilación fotosintética de carbono a través del ciclo de Calvin y es, por tanto, la principal vía de entrada del CO2 de la atmósfera en la biosfera. La estructura del enzima en organismos eucariotas es un hexadecámero compuesto por 8 subunidades grandes (de 51-58KDa, de codificación cloroplástica) y 8 subunidades pequeñas (de 12-18KDa, de codificación nuclear). La Rubisco desempeña una importante función no catalítica como reserva de nitrógeno, azufre y carbono, al degradarse de forma rápida y selectiva en condiciones de senescencia natural o inducida por estrés. Una de las respuestas más generalizadas ante diferentes tipos de estrés en distintos organismos es la oxidación de grupos tioles de la Rubisco, que se ha relacionado in vitro e in vivo con la inactivación y susceptibilización proteolítica del enzima. Con estos antecedentes, en la presente tesis se ha profundizado en el conocimiento de los mecanismos que regulan la actividad y la disponibilidad proteolítica de la Rubisco a través del estado de oxidación de residuos de cisteína del propio enzima. Dentro de este tema, se estudiaron los siguientes aspectos concretos: 1. Patrón diferencial de proteolisis de Rubisco reducida y oxidada. La utilización de proteasas de baja especificidad de secuencia como sondas estructurales reveló que la accesibilidad del sitio de corte tras la Lys 18 de la subunidad grande de la Rubisco de diferentes especies no depende del estado redox del enzima. Por otro lado, la oxidación de las cisteínas conservadas de Rubisco induce un cambio conformacional progresivo que favorece la exposición del lazo Ser61-Thr68 de la subunidad grande a la acción de proteasas exógenas. El corte proteolítico en este lazo, situado en la interfase entre las dos subunidades grandes que componen cada uno de los dímeros del holoenzima, promueve el desensamblaje y la digestión completa (no restringida) del enzima. La proteolisis de la Rubisco por subtilisina puede modelizarse mediante un sistema de tres ecuaciones diferenciales acopladas, que incluye cuatro constantes cinéticas de primer orden: k1, para el procesamiento tras la Lys 18, k2, para el corte en el lazo Ser61-Thr68 de una subunidad grande intacta, k2´, para el corte en el mismo lazo de una subunidad grande previamente procesada tras la Lys 18 y k3, para el desensamblaje y la consecuente proteolisis no restringida. El modelo describe correctamente la cinética de proteolisis y puede utilizarse como herramienta para detectar cambios conformacionales y comportamientos anómalos en enzimas mutantes. 2. Obtención de mutantes de Rubisco por sustitución de residuos conservados de cisteína. Los procedimientos de transformación cloroplástica y nuclear de C. reinhardtii han permitido la obtención de mutantes fotosintéticamente activos de cisteínas conservadas de la subunidad grande (C84S, C247S, C284S, C427S, C449S, C459S y C449S/C459S) y de la subunidad pequeña (C41S, C83S) de la Rubisco. La futura caracterización de estos mutantes puede ayudar a desvelar el papel concreto que cada uno de estos residuos pueda desempeñar en el control redox del enzima. 3. Estudio del papel del par Cys 449-459 en la modulación redox de la Rubisco. De entre los mutantes obtenidos, se escogieron los correspondientes a los residuos de cisteína 449 y 459 de la subunidad grande de la Rubisco para una caracterización más detallada. El residuo de cisteína 459, con un alto grado de conservación entre las secuencias de plantas superiores, algas verdes y cianobacterias, se encuentra en C. reinhardtii a una distancia de la cisteína 449 compatible con la formación de un puente disulfuro. La sustitución de los residuos de cisteína 449 y 459 no provoca cambios apreciables en el centro activo del enzima en estado reducido aunque supone una ligera desestabilización de la estructura nativa, percibible sólo a temperaturas muy superiores a la fisiológica. Los residuos de cisteína 449 y 459 de la subunidad grande de la Rubisco son necesarios para inactivar completamente el enzima a potenciales redox elevados y favorecen de forma redundante la exposición del lazo Ser61-Thr68 a la acción de proteasas exógenas in vitro en condiciones oxidantes. Las cisteínas 449 y 459 tienen un papel aparentemente redundante de forma que su relevancia funcional sólo se pone de manifiesto in vivo al sustituir ambos residuos. Así, el doble mutante, a diferencia de los mutantes simples, presenta un mayor contenido de Rubisco, proteínas totales y pigmentos fotosintéticos por célula durante la fase estacionaria de crecimiento. El estrés salino se ha descrito como un desencadenante de estrés oxidativo en el interior del cloroplasto, y se escogió como modelo para el estudio del papel redox de las cisteínas 449 y 459 in vivo, en condiciones que inducen la degradación de Rubisco. La sustitución simultánea de los residuos de cisteína 449 y 459 intensifica la degradación de Rubisco y los procesos de inactivación, polimerización en agregados de alto peso molecular y asociación de la proteína con las membranas, relacionados con el catabolismo del enzima. Se presenta una discusión sobre los posibles mecanismos por los cuales las cisteínas 449 y 459 pueden estar implicadas en estos procesos in vivo, en base a los datos bibliográficos de los que se dispone hasta el momento. ____________________________________________________________________________________________________ SUMMARY In the present work, it has been intended to further characterize the mechanisms that regulate the activity and the proteolytic availability of Rubisco through the redox state of its cysteine residues. The following aspects were studied: 1. Differential proteolytic pattern upon Rubisco oxidation. The oxidation of conserved cysteine residues induces a progressive conformational change that favours the exposure of the Ser61-Thr68 loop of the large subunit to exogenous proteases. A proteolytic cut in this loop promotes disassembly and the complete digestion of the enzyme. A mathemathical model with three coupled differential equations is proposed. This model fits properly the observed kinetics of proteolytic fragmentation and can be used as a tool to detect conformational changes in mutant enzymes. 2. Site-directed mutagenesis of conserved cysteine residues of Rubisco in Chlamydomonas reinhardtii. In order to test the contribution of each of the conserved cysteines to redox regulation, photosynthetically active Rubisco mutants corresponding to large subunit (C84S, C247S, C284S, C427S, C449S, C459S, C449S/C459S) and small subunit (C41S, C83S) conserved cysteines residues were obtained. 3. Study of the role of the Cys449-459 pair in Rubisco redox modulation through analyis of the phenotype of the C449S, C459S and C449S/C459S mutants. Cysteine residues 449 and 459 of the large subunit are involved in full inactivation of the enzyme at strong oxidizing conditions, and favour the exposure of loop Ser61-Thr68 to in vitro proteolytic attack. Cysteines 449 and 459 have a redundant role in vivo, in such a way that their physiological role becomes evident only after substitution of both residues. The double mutant accumulates a higher biomass per cell and shows a more intense response to saline stress in processes (degradation, aggregation, association to membranes and inactivation) related to the catabolism of the enzyme

Structural Dissection of the Active Site of Thermotoga maritima β-Galactosidase Identifies Key Residues for Transglycosylating Activity

Manuscript of the article published in print 13 April 2016. The Supporting Information is available free of charge on the ACS Publications website at DOI:10.1021/acs.jafc.6b00222 .Glycoside hydrolases, specifically β-galactosidases, can be used to synthesize galacto-oligosaccharides (GOS) due to the transglycosylating (secondary) activity of these enzymes. Site-directed mutagenesis of a thermoresistant β-galactosidase from Thermotoga maritima has been carried out to study the structural basis of transgalactosylation and to obtain enzymatic variants with better performance for GOS biosynthesis. Rational design of mutations was based on homologous sequence analysis and structural modeling. Analysis of mutant enzymes indicated that residue W959, or an alternative aromatic residue at this position, is critical for the synthesis of β-3′-galactosyl-lactose, the major GOS obtained with the wild-type enzyme. Mutants W959A and W959C, but not W959F, showed an 80% reduced synthesis of this GOS. Other substitutions, N574S, N574A, and F571L, increased the synthesis of β-3′-galactosyl-lactose about 40%. Double mutants F571L/N574S and F571L/N574A showed an increase of about 2-fold.This work was funded by grant BIO2013-48779-C4-3-R, from Spain's 'Secretaría de Estado de Investigación, Desarrollo e Innovación'. D T-P was supported by a FPU fellowship from 'Ministerio de Economía y Competitividad'.Peer reviewe

Talleres de propuestas y sugerencias de alumnos de Grado para la mejora del Programa Docentia

El Proyecto tiene como objetivo la implementacion de una Cultura de Calidad en los alumnos de grados de diferentes Grados de Ciencias de la Salud. Y el estudio de posibles vias y mecanismos para aumentar la implicacion de los alumnos de la UCM en el Programa Docentia

Clonal chromosomal mosaicism and loss of chromosome Y in elderly men increase vulnerability for SARS-CoV-2

The pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2, COVID-19) had an estimated overall case fatality ratio of 1.38% (pre-vaccination), being 53% higher in males and increasing exponentially with age. Among 9578 individuals diagnosed with COVID-19 in the SCOURGE study, we found 133 cases (1.42%) with detectable clonal mosaicism for chromosome alterations (mCA) and 226 males (5.08%) with acquired loss of chromosome Y (LOY). Individuals with clonal mosaic events (mCA and/or LOY) showed a 54% increase in the risk of COVID-19 lethality. LOY is associated with transcriptomic biomarkers of immune dysfunction, pro-coagulation activity and cardiovascular risk. Interferon-induced genes involved in the initial immune response to SARS-CoV-2 are also down-regulated in LOY. Thus, mCA and LOY underlie at least part of the sex-biased severity and mortality of COVID-19 in aging patients. Given its potential therapeutic and prognostic relevance, evaluation of clonal mosaicism should be implemented as biomarker of COVID-19 severity in elderly people. Among 9578 individuals diagnosed with COVID-19 in the SCOURGE study, individuals with clonal mosaic events (clonal mosaicism for chromosome alterations and/or loss of chromosome Y) showed an increased risk of COVID-19 lethality

re-habitar El Carmen : Un proyecto sobre patrimonio contemporáneo

El proyecto _re-HABITAR suponía para el propio proceder de la institución un avance más allá del reconocimiento, registro, inventario o protección patrimonial de la arquitectura del siglo XX y del Movimiento Moderno para posicionarse en la acción preventiva y conservativa de ese legado contemporáneo. Para ello, la praxis patrimonial se aferraba a un modelo: el de la vivienda social en España en la segunda mitad del siglo XX; a un caso concreto: el de la barriada de Nuestra Señora del Carmen (Recasens Méndez-Queipo de Llano, 1958); y a un requisito fundamental: analizar un objeto vivo y en uso, aún con la presencia de quienes lo vivieron y usaron desde su origen

Reducing the environmental impact of surgery on a global scale: systematic review and co-prioritization with healthcare workers in 132 countries

Abstract Background Healthcare cannot achieve net-zero carbon without addressing operating theatres. The aim of this study was to prioritize feasible interventions to reduce the environmental impact of operating theatres. Methods This study adopted a four-phase Delphi consensus co-prioritization methodology. In phase 1, a systematic review of published interventions and global consultation of perioperative healthcare professionals were used to longlist interventions. In phase 2, iterative thematic analysis consolidated comparable interventions into a shortlist. In phase 3, the shortlist was co-prioritized based on patient and clinician views on acceptability, feasibility, and safety. In phase 4, ranked lists of interventions were presented by their relevance to high-income countries and low–middle-income countries. Results In phase 1, 43 interventions were identified, which had low uptake in practice according to 3042 professionals globally. In phase 2, a shortlist of 15 intervention domains was generated. In phase 3, interventions were deemed acceptable for more than 90 per cent of patients except for reducing general anaesthesia (84 per cent) and re-sterilization of ‘single-use’ consumables (86 per cent). In phase 4, the top three shortlisted interventions for high-income countries were: introducing recycling; reducing use of anaesthetic gases; and appropriate clinical waste processing. In phase 4, the top three shortlisted interventions for low–middle-income countries were: introducing reusable surgical devices; reducing use of consumables; and reducing the use of general anaesthesia. Conclusion This is a step toward environmentally sustainable operating environments with actionable interventions applicable to both high– and low–middle–income countries

Identification and Structural Analysis of Amino Acid Substitutions that Increase the Stability and Activity of Aspergillus niger Glucose Oxidase

Glucose oxidase is one of the most conspicuous commercial enzymes due to its many different applications in diverse industries such as food, chemical, energy and textile. Among these applications, the most remarkable is the manufacture of glucose biosensors and in particular sensor strips used to measure glucose levels in serum. The generation of ameliorated versions of glucose oxidase is therefore a significant biotechnological objective. We have used a strategy that combined random and rational approaches to isolate uncharacterized mutations of Aspergillus niger glucose oxidase with improved properties. As a result, we have identified two changes that increase significantly the enzyme's thermal stability. One (T554M) generates a sulfur-pi interaction and the other (Q90R/Y509E) introduces a new salt bridge near the interphase of the dimeric protein structure. An additional double substitution (Q124R/L569E) has no significant effect on stability but causes a twofold increase of the enzyme's specific activity. Our results disclose structural motifs of the protein which are critical for its stability. The combination of mutations in the Q90R/Y509E/T554M triple mutant yielded a version of A. niger glucose oxidase with higher stability than those previously described.This work was funded by grant BIO2013-48779-C4-3-R from Spain's "Secretaría de Estado de Investigación, Desarrollo e Innovación". NR was supported by a Marie Curie ITN fellowship from the European Union within the Project Leangreenfood. DTP was supported by a FPU fellowship from "Ministerio de Economía y Competitividad".USD 1,495 APC fee funded by the EC FP7 Post-Grant Open Access PilotPeer reviewe