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Development of chitosan-based nanoparticles for nasal immunization against hepatitis B
Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Tecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraVaccines are one of medicine greatest achievements, reducing the incidence of infectious
diseases and eradicating otherwise fatal diseases worldwide. However, hepatitis B virus (HBV)
infection is still a major global health concern and the most common cause of chronic liver
disease and mortality from hepatocellular carcinoma. New generation vaccines are needed in
order to overcome the limitations of the current HBV vaccines in the market. In this regard,
mucosal immunization constitutes an attractive alternative to the available parenteral vaccine,
especially in developing countries, since it would be best suited for mass immunization and
would provide protection at the pathogen entry site.
The main objective of this thesis was to develop the next generation of HBV vaccines
exploiting the immunomodulatory and mucoadhesive properties of chitosan-based delivery
nanoparticles. This strategy would improve not only mucosal- and cell-mediated immunity,
but would also allow the vaccine to be efficiently administered through the nasal mucosa. To
achieve this goal, two different approaches were developed and tested. First, a novel
prototypic system combining two well-established immunopotentiators, chitosan and
aluminium salts, was produced to deliver hepatitis B surface antigen (HBsAg). Adjuvant
combination has been considered a promising strategy to boost immunogenicity. The second
approach involved the generation of a gene delivery system consisting of complexes of human
serum albumin (HSA)-loaded chitosan nanoparticles with DNA (HSA-CH NP/DNA)
encoding HBsAg. The two delivery systems were characterized and evaluated, both in vitro and
in vivo.
In order to fulfill the main goal, we established a detailed methodology to easily obtain
large quantities of endotoxin-free chitosan without modifying its immunomodulatory
properties. Bacterial endotoxins content was assessed according to the recommendations of
the International Council for Harmonization (ICH) guideline and validated with in vitro data.
Chitosan-aluminium nanoparticles (CH-Al NPs) were prepared using a nanoprecipitation
technique; the optimal formulation exhibited a mean diameter of 280 nm and a positive
surface charge, showing no cytotoxic effects in two different cell lines and in a primary culture
of splenocytes, in the dose used for in vivo studies. In vitro uptake studies showed that CH-Al
NPs were efficiently internalized by epithelial cells, demonstrating potential as a delivery
system for a wide range of model antigens. Immunization studies showed that mice
subcutaneously immunized with HBsAg adjuvanted with CH NPs displayed enhanced
humoral and cellular immune responses.
To understand the underlying mechanisms of adjuvanticity of CH-Al NPs, the ability of
CH-Al NPs to promote dendritic cell (DC) activation and their potential to stimulate innate
and adaptive immune responses was assessed. Results were correlated to those obtained with
chitosan in solution (CH sol.) and conventional chitosan particles (CH-Na NPs). All the
formulations were capable of modulating Toll-like receptor (TLR)-9 agonist, CpG, induced
cytokine secretion in bone-marrow derived dendritic cells (BMDCs) and induced DC
maturation in the absence of cytokine production. After intraperitoneal (I.P.) injection, CH-Al
NPs were capable of generating a local immune response comparable to that elicited by the
vaccine adjuvant alum, with recruitment of neutrophils and eosinophils and concomitant
disappearance of resident macrophages and mast cells. After vaccination with CH-Al NPs in
combination with HBsAg, mice developed high antigen-specific immunoglobulin G (IgG)
titers in the serum, as well as in nasal and vaginal washes, generating an overall improved
immune profile in comparison to the commercially available vaccine Engerix-B.
In the second approach, a DNA vaccine was developed in which a plasmid coding for the
HBsAg was adsorbed on the surface of the HSA-loaded CH NPs. The presence of HSA
enhanced transfection activity and facilitated DNA release from the complex by weakening
the interaction between positively charged nanoparticles and negatively charged plasmid DNA
(pDNA). To assess in vivo the value of the developed formulation, immunization studies were
conducted. Nasal immunization with HSA-CH NP/DNA complexes elicited high levels of
serum anti-HBsAg IgG and antigen-specific IgA in nasal and vaginal secretions, while no
systemic or mucosal responses were detected after immunization with DNA alone. These
results confirm the ability of this novel delivery system to generate a mucosal immune
response, making it a valuable adjuvant for nasal vaccination against HBV.
Overall, our findings add to our knowledge of the mechanism of action of chitosan-based
formulations and illustrate that proper design is vital in order to generate an effective adjuvant
for HBV vaccines, capable of driving mucosal immune responses in addition to potent
humoral and cell-mediated immunity.As vacinas são uma das maiores conquistas da medicina, reduzindo a incidência de doenças
infeciosas e erradicando mundialmente doenças que outrora seriam fatais. Apesar de existir no
mercado uma vacina profilática contra a hepatite B, a infeção pelo vírus da hepatite B (VHB)
continua a ser um dos principais problemas de saúde pública e a causa mais comum de doença
hepática crónica e mortalidade por carcinoma hepatocelular. É por isso necessário uma nova
geração de vacinas que ultrapassem as limitações das vacinas contra o VHB atualmente no
mercado. Nesse sentido, a imunização pelas mucosas constitui uma alternativa apelativa à
vacina parentérica disponível, especialmente nos países em desenvolvimento, uma vez que
seria mais adequada para imunização em massa e proporcionaria proteção no local de entrada
do patogéneo, nomeadamente no caso de uma doença sexualmente transmitida.
Neste sentido, o principal objetivo desta tese consiste em desenvolver a próxima geração
de vacinas contra o VHB explorando as propriedades imunomoduladoras e mucoadesivas de
nanopartículas à base de quitosano. Esta nova vacina melhoraria não só a imunidade ao nível
das mucosas e a mediada por células, como permitiria que a vacina fosse administrada de
forma eficiente através da mucosa nasal. Para atingir este objetivo, duas estratégias diferentes
foram desenvolvidas e testadas. Primeiro, foi otimizado um novo sistema protótipico de
liberação do antigénio de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg), combinando dois
imunopotenciadores bem estabelecidos, o quitosano e os sais de alumínio, uma vez que a
combinação de adjuvantes tem sido considerada uma estratégia promissora para potenciar a
resposta imunológica; segundo, foram também desenvolvidos complexos de nanopartículas de
quitosano carregados com albumina de soro humano (HSA) e complexados com ADN (HSACH
NP/ADN), usados para estimular a resposta imune sistémica e nas mucosas após
administração intranasal. Os dois sistemas de libertação de moléculas ativas foram
caracterizados e avaliados quer in vitro, quer in vivo.
Para cumprir o objetivo principal, estabelecemos uma metodologia detalhada de modo a
obter facilmente quitosano livre de endotoxinas, sem comprometer as suas propriedades
bioquímicas. O conteúdo das endotoxinas bacterianas foi avaliado em conformidade com as
recomendações da diretiva do Conselho Internacional de Harmonização (ICH) e validado
com dados obtidos em estudos in vitro.
As nanopartículas de quitosano alumínio (CH-Al NPs) foram preparadas utilizando uma
técnica de nanoprecipitação; a formulação otimizada exibiu um diâmetro médio de 280 nm e
uma carga de superfície positiva, não apresentando efeitos citotóxicos em duas linhas celulares
diferentes e numa cultura primária de esplenócitos, para a dose utilizada posteriormente em
estudos de imunização. Estudos de internalização in vitro demonstraram que as CH-Al NPs
foram eficientemente internalizadas por células epiteliais exibindo potencial como sistema de
libertação para uma ampla gama de antigénios modelo. Estudos in vivo mostraram que
murganhos imunizados pela via subcutânea com HBsAg coadjuvado com CH NP
apresentaram uma melhor resposta imune humoral e celular quando comparado com o grupo
de murganhos vacinados apenas com o antigénio.
Para entender os mecanismos subjacentes de adjuvanticidade das CH-Al NPs, avaliou-se a
sua capacidade para promover a ativação de células dendríticas (DC), e o seu potencial para
estimular respostas imunes inatas e adaptativas. Os resultados foram correlacionados com os
obtidos com quitosano em solução (CH sol.) e partículas de quitosano convencionais (CH-Na
NP). Todas as formulações foram capazes de modular a secreção de citoquinas induzida por
agonistas dos recetores tipo-Toll (TLR)-9, CpG, em células dendríticas derivadas da medula
óssea de murganho (BMDCs) e induziram a maturação de DC na ausência de produção de
citoquinas. Após a injeção intraperitoneal (I.P.), as CH-Al NPs foram capazes de gerar uma
resposta imunitária local comparável à evocada por sais de alumínio usado com adjuvantes em
vacina que se caracterizou por recrutar neutrófilos e eosinófilos e por um desaparecimento de
macrófagos e mastócitos. Após a vacinação com CH-Al NP pela via subcutânea em
combinação com HBsAg, os murganhos desenvolveram títulos elevados de anticorpos IgG
anti-HBsAg no soro, bem como nas lavagens nasais e vaginais, gerando um perfil imunológico
melhorado em comparação com a vacina comercialmente disponível, Engerix-B.
Na segunda abordagem foi desenvolvida uma vacina de ADN na qual um plasmídeo que
codifica o HBsAg foi adsorvido na superfície das CH-NPs carregadas com HSA. A presença
de HSA aumentou a atividade de transfecção e facilitou a libertação de ADN a partir do
complexo, por enfraquecer a interação entre nanopartículas positivamente carregadas e o
ADN carregado negativamente. Para avaliar o potencial da formulação desenvolvida foram
conduzidos estudos in vivo. A imunização com complexos HSA-CH NP/ADN originou níveis
elevados de anticorpos IgG anti-HBsAg e anticorpos IgA específicos contra o HBsAg nas
secreções nasais e vaginais, enquanto não foram detetadas respostas sistémicas ou nas
mucosas após imunização com ADN sozinho. Estes resultados demonstram o potencial deste
novo sistema de administração em gerar uma resposta imune nas mucosas, tornando-o num
adjuvante promissor para a vacinação nasal contra o HBV.
De modo geral, os resultados obtidos melhoram o nosso conhecimento de formulações à
base de quitosano e demonstram que o design apropriado é vital para a formular um adjuvante
eficaz para vacinas contra o HBV, capaz de produzir respostas imune ao nível das mucosas
além de potenciar imunidade humoral e celular
Characterisation of microbial attack on archaeological bone
As part of an EU funded project to investigate the factors influencing bone preservation in the archaeological record, more than 250 bones from 41 archaeological sites in five countries spanning four climatic regions were studied for diagenetic alteration. Sites were selected to cover a range of environmental conditions and archaeological contexts. Microscopic and physical (mercury intrusion porosimetry) analyses of these bones revealed that the majority (68%) had suffered microbial attack. Furthermore, significant differences were found between animal and human bone in both the state of preservation and the type of microbial attack present. These differences in preservation might result from differences in early taphonomy of the bones. © 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved