Étude des éléments fonctionnels et structuraux du récepteur humain liant le facteur activateur des plaquettes

Le facteur activateur des plaquettes (PAF) est un médiateur phospholipidique puissant, exerçant son influence au niveau du système nerveux, cardiovasculaire, reproducteur, respiratoire et immunitaire via un récepteur couplé aux protéines G (GPCR). Plusieurs résidus ont été conservés durant l'évolution des GPCRs dont deux cystéines (première et deuxième boucle extracellulaire). Les résultats obtenus avec le récepteur du PAF humain (hPAFR) supportent l'idée qu'un pont disulfure important existerait entre ces résidus. La réduction des ponts disulfures à l'aide du DTT amène une perte de liaison pour le 3H-PAF et le 3H-WEB2086. De plus, la substitution des cystéines 173 et 90 en alanine ou sérine abolit la réponse au PAF, l'expression à la surface et la liaison des différents ligands. La substitution du résidu cystéine 95 affecte aussi ces fonctions mais sans les abolir. Ceci suggère l'existence d'un pont disulfure reliant les résidus 90 et 173, primordial pour le hPAFR. D'autres résidus compris dans le motif (D/N)PxxY sont aussi importants dans le maintien de la conformation des GPCRs ainsi que dans l'endocytose qui suit une exposition au ligand. Les substitutions D289A, D289N, Y293A et Y293F furent utilisées afin d'évaluer l'importance des résidus de ce motif pour le hPAFR. À l'exception de Y293A, les mutants non-couplés (D63N, A230E, D289A et 'Y293A') sont fortement affectés dans leur capacité d'internalisation. À l'aide de bloqueurs d' internalisation, nous avons mis en évidence l'entrée concomitante du 3H-PAF et du hPAFR via les vésicules à clathrines. Ce processus est PKC indépendant et l'internalisation de Y293A démontre que la réponse ne participe pas au phénomène. En mettant au point un test d'internalisation, nous avons observé qu'une stimulation au PAF menait à une disparition de sites de liaison de 3H-WEB2086 distincte de la séquestration. Par contre, la réapparition de la liaison est internalisation et déphosphorylation dépendante. Elle suit donc une cinétique classique de resensibilisation. Les tyrosines kinases, la PKC et les caséines kinases 1 et 2 ne sont pas impliquées dans cette disparition. Cet état réfractaire semble découler d'un changement de conformation indépendant du couplage et mesurable par son effet sur la liaison du 3H-WEB2086. Certaines études font part de l'existence d'un état oligomérique des GPCRs. Par la coexpression du PAFR de type sauvage avec des récepteurs mutants, nous avons vérifié si certains possédaient un phénotype dominant. Les mutants N285I et K298stop sont capables d'inhiber la liaison du 3H-WEB2086 et d'affecter l'expression à la surface cellulaire. Les mutants D63N et D289A affectent l'affinité apparente pour le PAF. De plus, l'activité constitutive s'accroît fortement en présence du mutant D63N. Ces résultats démontrent qu'il est possible d'utiliser différents mutants pour affecter les caractéristiques apparentes des GPCRs. Des études plus approfondies pourraient mener à une meilleure compréhension de différentes maladies héréditaires dominantes et mener à des avenues de thérapies géniques

Upregulation of expression of the chemokine receptor CCR5 by hydrogen peroxide in human monocytes.

The objective of this study was to test the hypothesis that an oxidative stress can serve as a signal to regulate the expression of CCR5. When human monocytes were exposed to graded concentration of hydrogen peroxide (H(2)O(2)), CCR5 mRNA levels increased maximally at 4 h of exposure to 200 microM of H(2)O(2) and decreased by 24 h of treatment. Pretreatment of monocytes with the NF-kappaB inhibitor BAY 11-8072 blocked the H(2)O(2)-induced augmentation of CCR5 mRNA expression, suggesting a role for this transcription factor in the regulation of CCR5 expression. CCR5 protein expression on the plasma membrane was also increased by treatment with H(2)O(2,) as assessed by flow cytometry. This was accompanied by enhanced responsiveness of H(2)O(2)-pretreated monocytes to the CCR5 ligand MIP-1beta in terms of chemotaxis and c-fos gene activation. Our results suggest that oxidative stress may indeed modulate the expression of chemokine receptors and thus contribute to regulation of the inflammatory process

Comprehensive Signaling Profiles Reveal Unsuspected Functional Selectivity of δ-Opioid Receptor Agonists and Allow the Identification of Ligands with the Greatest Potential for Inducing Cyclase Superactivation

Prolonged exposure to opioid receptor agonists triggers adaptations in the adenylyl cyclase (AC) pathway that lead to enhanced production of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) upon withdrawal. This cellular phenomenon contributes to withdrawal symptoms, hyperalgesia and analgesic tolerance that interfere with clinical management of chronic pain syndromes. Since δ-opioid receptors (DOPrs) are a promising target for chronic pain management, we were interested in finding out if cell-based signaling profiles as generated for drug discovery purposes could inform us of the ligand potential to induce sensitization of the cyclase path. For this purpose, signaling of DOPr agonists was monitored at multiple effectors. The resulting signaling profiles revealed marked functional selectivity, particularly for Met-enkephalin (Met-ENK) whose signaling bias profile differed from those of synthetic ligands like SNC-80 and ARM390. Signaling diversity among ligands was systematized by clustering agonists according to similarities in Emax and Log(τ) values for the different responses. The classification process revealed that the similarity in Gα/Gβγ, but not in β-arrestin (βarr), responses was correlated with the potential of Met-ENK, deltorphin II, (d-penicillamine2,5)-enkephalin (DPDPE), ARM390, and SNC-80 to enhance cAMP production, all of which required Ca2+ mobilization to produce this response. Moreover, superactivation by Met-ENK, which was the most-effective Ca2+ mobilizing agonist, required Gαi/o activation, availability of Gβγsubunits at the membrane, and activation of Ca2+ effectors such as calmodulin and protein kinase C (PKC). In contrast, superactivation by (N-(l-tyrosyl)-(3S)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carbonyl)-l-phenylalanyl-l-phenylalanine (TIPP), which was set in a distinct category through clustering, required activation of Gαi/o subunits but was independent of the Gβγdimer and Ca2+ mobilization, relying instead on Src and Raf-1 to induce this cellular adaptation

Chemogenetics defines receptor-mediated functions of short chain free fatty acids

Differentiating actions of short chain fatty acids (SCFAs) at free fatty acid receptor 2 (FFA2) from other free fatty acid-responsive receptors and from non-receptor-mediated effects has been challenging. Using a novel chemogenetic and knock-in strategy, whereby an engineered variant of FFA2 (FFA2-DREADD) that is unresponsive to natural SCFAs but is instead activated by sorbic acid replaced the wild-type receptor, we determined that activation of FFA2 in differentiated adipocytes and colonic crypt enteroendocrine cells of mouse accounts fully for SCFA-regulated lipolysis and release of the incretin glucagon-like peptide-1 (GLP-1), respectively. In vivo studies confirmed the specific role of FFA2 in GLP-1 release and also demonstrated a direct role for FFA2 in accelerating gut transit. Thereby, we establish the general principle that such a chemogenetic knock-in strategy can successfully define novel G-protein-coupled receptor (GPCR) biology and provide both target validation and establish therapeutic potential of a ‘hard to target’ GPCR

Exploring use of unsupervised clustering to associate signaling profiles of GPCR ligands to clinical response.

Signaling diversity of G protein-coupled (GPCR) ligands provides novel opportunities to develop more effective, better-tolerated therapeutics. Taking advantage of these opportunities requires identifying which effectors should be specifically activated or avoided so as to promote desired clinical responses and avoid side effects. However, identifying signaling profiles that support desired clinical outcomes remains challenging. This study describes signaling diversity of mu opioid receptor (MOR) ligands in terms of logistic and operational parameters for ten different in vitro readouts. It then uses unsupervised clustering of curve parameters to: classify MOR ligands according to similarities in type and magnitude of response, associate resulting ligand categories with frequency of undesired events reported to the pharmacovigilance program of the Food and Drug Administration and associate signals to side effects. The ability of the classification method to associate specific in vitro signaling profiles to clinically relevant responses was corroborated using β2-adrenergic receptor ligands.This research was supported by a research contract from Pfizer Inc. and grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant 311997 to G.P.) and the Canadian Institutes of Health Research MOP 324876 (to G.P.), MOP 102630 (to M.B. and O.L.) and Foundation grant (FDN-148431) to MB. MB holds a Canada Research Chair in Signal Transduction and Molecular Pharmacology. Dr Lichtarge’s research was supported by National Institutes of Health (NIH 2R01 GM066099; NIH 5R01 GM079656). B.B. was supported by a studentship from Fonds de Recherche en Santé du Québec. P.D. was supported by a MITACS fellowship

The EHA Research Roadmap : Malignant Lymphoid Diseases

Peer reviewe

Étude des éléments fonctionnels et structuraux du récepteur humain liant le facteur activateur des plaquettes

Le facteur activateur des plaquettes (PAF) est un médiateur phospholipidique puissant, exerçant son influence au niveau du système nerveux, cardiovasculaire, reproducteur, respiratoire et immunitaire via un récepteur couplé aux protéines G (GPCR). Plusieurs résidus ont été conservés durant l'évolution des GPCRs dont deux cystéines (première et deuxième boucle extracellulaire). Les résultats obtenus avec le récepteur du PAF humain (hPAFR) supportent l'idée qu'un pont disulfure important existerait entre ces résidus. La réduction des ponts disulfures à l'aide du DTT amène une perte de liaison pour le 3H-PAF et le 3H-WEB2086. De plus, la substitution des cystéines 173 et 90 en alanine ou sérine abolit la réponse au PAF, l'expression à la surface et la liaison des différents ligands. La substitution du résidu cystéine 95 affecte aussi ces fonctions mais sans les abolir. Ceci suggère l'existence d'un pont disulfure reliant les résidus 90 et 173, primordial pour le hPAFR. D'autres résidus compris dans le motif (D/N)PxxY sont aussi importants dans le maintien de la conformation des GPCRs ainsi que dans l'endocytose qui suit une exposition au ligand. Les substitutions D289A, D289N, Y293A et Y293F furent utilisées afin d'évaluer l'importance des résidus de ce motif pour le hPAFR. À l'exception de Y293A, les mutants non-couplés (D63N, A230E, D289A et 'Y293A') sont fortement affectés dans leur capacité d'internalisation. À l'aide de bloqueurs d' internalisation, nous avons mis en évidence l'entrée concomitante du 3H-PAF et du hPAFR via les vésicules à clathrines. Ce processus est PKC indépendant et l'internalisation de Y293A démontre que la réponse ne participe pas au phénomène. En mettant au point un test d'internalisation, nous avons observé qu'une stimulation au PAF menait à une disparition de sites de liaison de 3H-WEB2086 distincte de la séquestration. Par contre, la réapparition de la liaison est internalisation et déphosphorylation dépendante. Elle suit donc une cinétique classique de resensibilisation. Les tyrosines kinases, la PKC et les caséines kinases 1 et 2 ne sont pas impliquées dans cette disparition. Cet état réfractaire semble découler d'un changement de conformation indépendant du couplage et mesurable par son effet sur la liaison du 3H-WEB2086. Certaines études font part de l'existence d'un état oligomérique des GPCRs. Par la coexpression du PAFR de type sauvage avec des récepteurs mutants, nous avons vérifié si certains possédaient un phénotype dominant. Les mutants N285I et K298stop sont capables d'inhiber la liaison du 3H-WEB2086 et d'affecter l'expression à la surface cellulaire. Les mutants D63N et D289A affectent l'affinité apparente pour le PAF. De plus, l'activité constitutive s'accroît fortement en présence du mutant D63N. Ces résultats démontrent qu'il est possible d'utiliser différents mutants pour affecter les caractéristiques apparentes des GPCRs. Des études plus approfondies pourraient mener à une meilleure compréhension de différentes maladies héréditaires dominantes et mener à des avenues de thérapies géniques

Caractérisation de gènes impliqués dans la biosynthèse d'un polycetide chez Saccharopolyspora hirsuta 367

Les polycétides forment une vaste famille de métabolites secondaires dont certains sont d'importance médicale et économique. Bien qu'on les retrouve chez une grande variété d'organismes, la plupart des gènes impliqués dans la biosynthèse de polycétide ont été clonés et caractérisés chez les bactéries du genre Streptomyces. Dans le but de faire avancer les connaissances sur les gènes impliqués dans la synthèse de ces molécules, un fragment d'ADN de Saccharopolyspora hirsuta 367 comportant des gènes de biosynthèse de polycétide, fut cloné. Une région de 5135 paires de bases, du fragment précédemment cloné dans le laboratoire du Dr. Déry, fut séquencée et analysée. Cette région comporte 6 cadrans de lecture ouverts (ORFs) complets distribués de toute évidence sur 3 opérons. La fonction du produit de ces gènes fut en grande partie déterminée en comparant la séquence déduite de chacun des ORFs à celle de protéines déjà publiée. Ainsi, deux de ces ORFs (l'ORF4 et l'ORF5) coderaient pour les sous-unités de la bèta-cétoacyl synthase, un autre (l'ORF6) pour une protéine pouvant transporter un groupement acyl, tandis qu'un quatrième (l'ORF3) coderait pour une béta-cétoréductase. Un des ORFs (l'ORF2) coderait pour une protéine n'ayant aucun analogue chez les gènes de biosynthèse de polycétide déjà clonés: un BCCP (protéine biotinylée transporteuse d'un groupement carboxyl). La fonction du produit du dernier ORF (l'ORF1) n'a pas été encore déterminée, mais le fait que cette protéine comporte un motif potentiel pour la formation d'une structure HTH (hélice-tour-hélice), nous laisserait penser qu'il pourrait s'agir d'une protéine régulatrice. La séquence du produit des quatre premiers ORFs (les ORF3 à 6) a été comparée à celle des gènes correspondant de biosynthèse d'autres polycétides (l'actinorhodine, la granaticine, la tétracénomycine, le pigment whiE de Streptomyces coelicolor A3(2) et un polycétide de Streptomyces cinnamonensis). Il en est ressorti que le produit des ORFs étudiés partage plus d'identité avec ceux impliqués dans la synthèse de la granaticine et de l'actinorhodine qu'avec les autres. Cette comparaison nous a permis d'observer que certaines régions sont fortement conservées. Bien que préliminaire, cette étude contribue à augmenter la connaissance sur la biosynthèse de polycétide et sur la génétique des actinomycètes

Caractérisation de gènes impliqués dans la biosynthèse d'un polycetide chez Saccharopolyspora hirsuta 367

Les polycétides forment une vaste famille de métabolites secondaires dont certains sont d'importance médicale et économique. Bien qu'on les retrouve chez une grande variété d'organismes, la plupart des gènes impliqués dans la biosynthèse de polycétide ont été clonés et caractérisés chez les bactéries du genre Streptomyces. Dans le but de faire avancer les connaissances sur les gènes impliqués dans la synthèse de ces molécules, un fragment d'ADN de Saccharopolyspora hirsuta 367 comportant des gènes de biosynthèse de polycétide, fut cloné. Une région de 5135 paires de bases, du fragment précédemment cloné dans le laboratoire du Dr. Déry, fut séquencée et analysée. Cette région comporte 6 cadrans de lecture ouverts (ORFs) complets distribués de toute évidence sur 3 opérons. La fonction du produit de ces gènes fut en grande partie déterminée en comparant la séquence déduite de chacun des ORFs à celle de protéines déjà publiée. Ainsi, deux de ces ORFs (l'ORF4 et l'ORF5) coderaient pour les sous-unités de la bèta-cétoacyl synthase, un autre (l'ORF6) pour une protéine pouvant transporter un groupement acyl, tandis qu'un quatrième (l'ORF3) coderait pour une béta-cétoréductase. Un des ORFs (l'ORF2) coderait pour une protéine n'ayant aucun analogue chez les gènes de biosynthèse de polycétide déjà clonés: un BCCP (protéine biotinylée transporteuse d'un groupement carboxyl). La fonction du produit du dernier ORF (l'ORF1) n'a pas été encore déterminée, mais le fait que cette protéine comporte un motif potentiel pour la formation d'une structure HTH (hélice-tour-hélice), nous laisserait penser qu'il pourrait s'agir d'une protéine régulatrice. La séquence du produit des quatre premiers ORFs (les ORF3 à 6) a été comparée à celle des gènes correspondant de biosynthèse d'autres polycétides (l'actinorhodine, la granaticine, la tétracénomycine, le pigment whiE de Streptomyces coelicolor A3(2) et un polycétide de Streptomyces cinnamonensis). Il en est ressorti que le produit des ORFs étudiés partage plus d'identité avec ceux impliqués dans la synthèse de la granaticine et de l'actinorhodine qu'avec les autres. Cette comparaison nous a permis d'observer que certaines régions sont fortement conservées. Bien que préliminaire, cette étude contribue à augmenter la connaissance sur la biosynthèse de polycétide et sur la génétique des actinomycètes

Un SIG dédié à la prolifération de l'huître creuse du Pacifique Crassostrea Gigas

International audienceAfter its massive introduction in the seventies in France Crassostrea gigas has became the main production of French oyster farming. From the early 1990's, C. gigas has started to spread many sites of Brittany and Normandy and, thanks to climate warming, its population has dramatically increased leading to a general invasion and to deep changes in ecosystems and biodiversity. A research program called PROGIG has been set up to evaluate the dynamic of this proliferation on French Channel and Atlantic coasts, and to identify its interactions with marine ecosystems and human activities. This paper presents the GIS implemented to integrate the data collected during field surveys of oyster populations, and the results of a spatial analysis of its potential interactions with human activities on coastal zone.L'huître creuse du Pacifique Crassostrea gigas est une espèce introduite massivement dans les années 70 en France pour les besoins de l'ostréiculture. Elle représente aujourd'hui l'essentiel de la production conchylicole française. Depuis le début des années 90, l'espèce a commencé à s'installer durablement sur de nombreux sites de Bretagne et de Normandie. Le processus de colonisation s'est accéléré depuis 2000, induisant des modifications profondes dans les écosystèmes et des changements dans la biodiversité. Ce phénomène d'invasion biologique a pour origine probable le réchauffement climatique qui favorise l'extension spatiale des zones dans lesquelles les huîtres peuvent pondre. Un programme de recherche a été mis en œuvre pour évaluer et quantifier la dynamique de cette prolifération au niveau des façades Manche et Atlantique et pour identifier les interactions réalisées avec les écosystèmes marins et les activités humaines. L'objet de cet article est de présenter le système d'information géographique (SIG) mis en œuvre pour intégrer les données de suivi de cette prolifération sur les côtes Manche-Atlantique de la Bretagne et pour l'analyse spatiale de ses interactions potentielles avec les activités humaines du littoral