Identifizierung von TNFalpha-induzierten Überlebensgenen mit der Cre-Genfalle

Das pro-inflammatorische Zytokin Tumornekrose-Faktor alpha (TNFalpha) kann, abhängig vom zellulären Kontext, sowohl Wachstum als auch Apoptose in Säugerzellen induzieren. Diese gegensätzlichen Effekte sind zurückzuführen auf die Fähigkeit von TNFalpha verschiedene Signalwege in der Zelle zu aktivieren. Nach einer vorübergehenden Aktivierung eines antiapoptotischen Genexpressionsprogrammes über einen membranständigen TNF-Rezeptor-Multiproteinkomplex und den Transkriptionsfaktor NF-KB, kommt es zur Modifikation des Signaltransduktionskomplexes. Dieser ist nun in der Lage andere Adapterproteine und Caspasen zu rekrutieren, was letztendlich zur Einleitung der Apoptose führt. Ziel dieser Arbeit war es neue Überlebensgene zu identifizieren, die nach TNFalpha-Behandlung transient aktiviert werden, da diese Gene in Tumorzellen möglicherweise dazu beitragen, apoptotischen Prozessen entgegenzuwirken. Langfristig könnten ihre Genprodukte als diagnostische Marker oder als Angriffspunkte für neue Therapieansätze dienen. Um TNFalpha-induzierte Überlebensgene zu identifizieren wurde als Modellsystem die menschliche Cervixkarzinomzellinie HeLa eingesetzt, welche resistent gegenüber TNFalpha ist. Allerdings wird bei Blockade der Translation, zusätzlich zu der Zytokinbehandlung, Apoptose ausgelöst. Dies zeigt, dass bei der alleinigen Zugabe von TNFalpha die Transkription von Überlebensgenen induziert wird, deren Aktivität apoptotische Signalwege blockiert. Zur Identifizierung dieser transient aktivierten Gene wurde eine Strategie benutzt, welche auf einer Kombination von Genfallen-Mutagenese und Cre/loxP-spezifischer Rekombination beruht. Zunächst wurde eine HeLa-Reporterzellinie mit einem stabil integrierten, Creabhängigen, molekularen Schalter generiert. Dieser besteht aus einer Kassette mit einem konstitutiv aktiven Promotor, der die Expression eines "gefloxten", selektionierbaren Markergens antreibt. 3’ hierzu befindet sich ein zweites Markergen, das in dieser Konfiguration transkriptionell inaktiv ist. Die Reporterzellinie wurde mit einer retroviralen Genfalle transduziert, die ein Cre-Rekombinasegen trägt, aber keine cis-regulatorischen DNA-Elemente besitzt, so dass die Cre-Expression vollständig von den zellulären Sequenzen in der Nachbarschaft der Integrationsstelle des Genfallen-Provirus abhängig wird. Eine transkriptionelle Aktivierung der Cre-Genfalle, auch wenn diese nur transient ist, führt zu einer Deletion des 5'-gelegenen Markergens in dem Selektionssystem und damit zur Expression des 3'-Markers. Diese irreversible Rekombination, die ein Indikator für eine transkriptionelle Aktivierung der Genfalle ist, wurde zur Selektion einer Zellpopulation mit Genfallen-Integrationen in TNFa-induzierten Genen genutzt. Aus einer aus 2 x 106 unabhängigen Insertionen bestehenden Genfallen-Integrationsbank wurde in einem zweistufigen Selektionsverfahren 50 HeLa-Zellinien mit Genfalleninsertionen in TNFalpha induzierbaren Genen isoliert. Die Sequenzierung Genfallen-flankierender genomischer Sequenzen und anschließender Datenbankanalyse ergab folgende Verteilung der Genfallen-Integrationen: 45 % lagen in annotierten Genen, 19 % in Genen mit unbekannter Funktion, 19 % in hypothetischen Genen, 5 % in ESTs (expressed sequence tags), 6 % in repetitiven Elementen und 6 % in nicht-annotierten Regionen. Neben bekannten TNFalpha-regulierten Genen wurde eine Reihe von neuen Genen identifiziert, welche bisher noch nicht mit der TNFalpha-Signaltransduktionskaskade assoziiert worden waren. Die Validierung der so gefundenen Gene in Northern-Blots machte deutlich, dass der Expressionsanstieg nach TNFalpha-Stimulation insgesamt nicht sehr stark ausgeprägt war, zeigte aber eine klare Induktion zweier Gene (rhobtb3, atf-1) nach Zytokin-Stimulation. Interessanterweise erfolgten die Genfalleninsertionen in 50 % aller Fälle in umgekehrter Orientierung zum annotierten Gen, was darauf hindeutet, dass mit Hilfe der gewählten Strategie nicht-kodierende RNAs identifiziert werden können. Obwohl der Nachweis dieser Transkripte und ihre biologische Relevanz noch aussteht, können sie in zwei Kategorien eingeteilt werden. Integrationen oberhalb von Genen oder in 5'-UTRs, repräsentieren entweder regulatorische RNAs, die mit Promotorelementen interagieren oder Transkripte, welche unter der Kontrolle von bidirektionalen Promotoren stehen. Die zweite Kategorie, Insertionen auf dem nicht-kodierenden Strang, innerhalb von Introns, legen das Vorkommen natürlicher antisense-Transkripte nahe. Interessanterweise liegen 50 % aller antisense-Integrationen 3' zu potentiellen Transkriptionsstartstellen, die mit verschiedenen Algorithmen vorhergesagt wurden. Dies kann als Hinweis darauf gewertet werden, dass entsprechende genomische Regionen tatsächlich transkribiert werden. Aufgrund neuer Erkenntnisse über die Funktionen von nicht-kodierenden RNA-Molekülen, gerade auch in Zusammenhang zur Tumorprogression, könnte deren mögliche regulatorische Rolle innerhalb der TNFalpha-Signaltransduktionskaskade von großem Interesse sein. Die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten Experimente führten nicht nur zur Identifizierung neuer, potentieller TNFalpha-Zielgene, sondern zeigten auch, dass Genfallen ein nützliches Werkzeug bei der Suche nach nicht-kodierenden RNAs in lebenden Zellen sein können und ihr Einsatz möglicherweise die Methode der Wahl für die Identifizierung derartiger Transkripte darstellt

Age constraints on crustal recycling to the mantle beneath the southern Chile Ridge: He-Pb-Sr-Nd isotope systematics

Basalts from the four southernmost segments of the subducting Chile Ridge (numbered 1-4 stepping away from the trench) display large variations in Sr, Nd, Pb, and He isotope and trace element compositions. Klein and Karsten [1995] showed that segments 1 and 3 display clear trace element evidence for recycled material in their source (e.g., low Ce/Pb). The uniformly midocean ridge basalt (MORB)-like ³He/⁴He and modest variations in Pb, Sr, and Nd isotopes of segment 1 (nearest the trench) suggest recent (<20 Ma) introduction of a contaminant into its source, consistent with recycling of material from the adjacent subduction zone. In contrast, segment 3 lavas display a dramatic southward increase in enrichment, extending to highly radiogenic Pb and Sr isotopic compositions (e.g., ²⁰⁶Pb/²⁰⁴Pb = 19.5) and the lowest ³He/⁴He yet measured in MORB (3.5RA). The segment 3 variations are most readily explained by ancient (~2 Ga) recycling of terrigenous sediment and altered crust, but we cannot rule out more recent recycling of material derived from a distant continental source. The similarity in isotropic signatures of segment 4 lavas to Indian Ocean MORB extends the Dipal anomaly to the Chile Ridge. Like Indian Ocean MORB, the segment 4 isotopic variations are consistent with contamination by anciently recycled pelagic sediment and altered crust and require a complex history involving at least three stages of evolution and possibly a more recent enrichment event. Southern Chile Ridge MORB reflect the extensive degree of heterogeneity that is introduced into the depleted upper mantle by diverse processes associated with recycling. These heterogeneities occur on a scale of ~50-100 km, corresponding to transform- and propagating-rift-bounded segmentation, and attest to the presence of distinct chemical domains in the mantle often bounded by surficial tectonic features that maintain their integrity on the scale sampled by melting

Анализ технологии предварительной подготовки нефти на месторождении "Н" (Красноярский край)

Объектом исследования является технология предварительной подготовки нефти на "Н" нефтегазоконденсатном месторождении. Целью выпускной квалификационной работы является анализ технологии предварительной подготовки нефти и подбор аппарата для отделения воды. В процессе выполнения выпускной квалификационной работы были изучены причины образования нефтяной эмульсии и способы ее разрушения; рассмотрены наиболее распространение устройства для отделения воды. Собраны данные по характеристике месторождения, составам пластовой нефти, газа и воды, технологии предварительной подготовки обводненной нефти.The object of the study is the technology of preliminary oil treatment at the" N " oil and gas condensate field. The purpose of the final qualification work is to analyze the technology of preliminary preparation of oil and the selection of a device for separating water. In the course of the final qualification work, the reasons for the formation of an oil emulsion and the methods of its destruction were studied; the most common devices for separating water were considered. Data on the characteristics of the field, the composition of reservoir oil, gas and water, and the technology of preliminary preparation of watered oil are collected

Identifying core features of adaptive metabolic mechanisms for chronic heat stress attenuation contributing to systems robustness

The contribution of metabolism to heat stress may play a significant role in defining robustness and recovery of systems; either by providing the energy and metabolites required for cellular homeostasis, or through the generation of protective osmolytes. However, the mechanisms by which heat stress attenuation could be adapted through metabolic processes as a stabilizing strategy against thermal stress are still largely unclear. We address this issue through metabolomic and transcriptomic profiles for populations along a thermal cline where two seagrass species, Zostera marina and Zostera noltii, were found in close proximity. Significant changes captured by these profile comparisons could be detected, with a larger response magnitude observed in northern populations to heat stress. Sucrose, fructose, and myo-inositol were identified to be the most responsive of the 29 analyzed organic metabolites. Many key enzymes in the Calvin cycle, glycolysis and pentose phosphate pathways also showed significant differential expression. The reported comparison suggests that adaptive mechanisms are involved through metabolic pathways to dampen the impacts of heat stress, and interactions between the metabolome and proteome should be further investigated in systems biology to understand robust design features against abiotic stress

Hadron structure from lattice quantum chromodynamics

This is a review of hadron structure physics from lattice QCD. Throughout this report, we place emphasis on the contribution of lattice results to our understanding of a number of fundamental physics questions related to, e.g., the origin and distribution of the charge, magnetization, momentum and spin of hadrons. Following an introduction to some of the most important hadron structure observables, we summarize the methods and techniques employed for their calculation in lattice QCD. We briefly discuss the status of relevant chiral perturbation theory calculations needed for controlled extrapolations of the lattice results to the physical point. In the main part of this report, we give an overview of lattice calculations on hadron form factors, moments of (generalized) parton distributions, moments of hadron distribution amplitudes, and other important hadron structure observables. Whenever applicable, we compare with results from experiment and phenomenology, taking into account systematic uncertainties in the lattice computations. Finally, we discuss promising results based on new approaches, ideas and techniques, and close with remarks on future perspectives of the field.Comment: 189 pages, to be published in Physics Report