Unterschiedliche Funktionen von Trail-Rezeptor 1 und Trail-Rezeptor 2 in Pankreaskarzinom-Zellen

Das Pankreaskarzinom hat trotz chirurgischer und chemotherapeutischer Therapie eine infauste Prognose. Seit einiger Zeit wird TRAIL als neue Therapieoption für Malignome erprobt. TRAIL ist ein Todesligand, der in Tumorzellen Apoptose auslösen kann, andere Zellen jedoch unbeschadet lässt. Neben TRAIL werden auch monoklonale agonistische Antikörper gegen TRAIL-Rezeptoren in klinischen Studien eingesetzt. Da TRAIL an zwei unterschiedliche Todesrezeptoren (TRAIL-R1 und TRAIL-R2) binden kann, wurden in der vorliegenden Arbeit die spezfischen Funktionen der beiden Rezeptoren in Pankreaskarzinom-Zellen untersucht. Die TRAIL-Rezeptor-Expression von Pankreaskarzinom-Zelllinien wurde mittels Western-Blot und Durchflusszytometrie analysiert. Pankreaskarzinom-Zellen wurden mit TRAIL oder mit, bereits in klinischen Studien evaluierten, agonistischen Antikörpern HGS-ETR1 (aktiviert TRAIL-R1) und HGS-ETR2 (aktiviert TRAIL-R2) stimuliert. Zur Hemmung des jeweiligen Rezeptors wurden antagonistische anti- TRAIL-R1/-TRAIL-R2-Antikörper verwendet. Zur Inhibition von PKC wurde GÖ6983 und zur Inhibition von MEK UO126 eingesetzt. Vitalität der Zellen wurde mittels Kristallviolett-Assay, NF-kB-Induktion mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) und Sezernierung von IL8 mittels ELISA bestimmt. Rezeptor-Lokalisation wurde mittels Immunfluoreszenz, die Rezeptorkomplexe wurden mittels Immunopräzipitation analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass alle untersuchten Pankreaskarzinom-Zelllinien TRAILR1 und TRAIL-R2 auf der Zelloberfläche exprimierten. Weiter induzierte TRAIL in diesen Zellen Apoptose und eine pro-inflammatorische Antwort (NF-kB und IL-8). Interessanterweise zeigte der Einsatz von antagonistischen Antikörpern gegen TRAIL-R1 bzw. -R2 in Kombination mit TRAIL-Stimulation, dass die TRAIL-induzierte Apoptose und nicht-apoptotische Antwort fast ausschließlich über TRAIL-R1 vermittelt wird. Dass jedoch beide Rezeptoren potentiell funktionsfähig sind, zeigte die Stimulation mit agonistischen Antikörpern. Sowohl HGS-ETR1 als auch HGSETR2 induzierten Apoptose, NF-kB und IL-8. Die Analyse der Rezeptorkomplexe zeigte, dass TRAIL-Stimulation zur Entstehung von Heterokomplexen aus TRAIL-R1 und TRAIL-R2, die Stimulation mit agonistischen Antikörpern hingegen zur Entstehung von Homokomplexen aus entweder TRAIL-R1 oder TRAIL-R2 führt. Weiter konnte nach TRAIL-Stimulation eine weitere, kleinere TRAIL-R2-Form identifiziert werden, die in der Molekulargröße einer nicht-glykosilierten Form entspricht. Die Untersuchung von Signaltransduktionswegen zeigte, dass die Hemmung von MEK Pankreaskarzinom-Zellen für TRAIL-vermittelte Apoptose ausschließlich über TRAIL-R1 sensibilisiert. Hingegen sensibilisiert die Hemmung von PKC die TRAIL-vermittelte Apoptose über beide Rezeptoren. Immunhistochemische Untersuchungen zeigten, dass TRAIL-R1 und -R2 auf der Zellmembran und im Zytoplasma lokalsiert sind. Interessanterweise konnte TRAILR2 zusätzlich auch im Zellkern nachgewiesen werden. Parallel durchgeführte Immunpräzipitation mit anschließender Sequenzierung und Identifizierung der Rezeptor-assoziierten Proteine zeigte, dass TRAIL-R2 (nicht aber TRAIL-R1) mit zahlreichen Kernproteinen assoziiert ist, die am Splicing und der Regulation der Genexpression beteiligt sind. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Pankreaskarzinom- Zellen funktionsfähigen TRAIL-R1 und TRAIL-R2 exprimieren, die nach selektiver Stimulation beide Apoptose auslösen können. Die apoptotische und proinflammatorische Antwort nach Stimulation mit dem natürlichen Liganden TRAIL wird jedoch nahezu ausschließlich über TRAIL-R1 vermittelt. Interessanterweise kann der TRAIL-R2 durch die Hemmung der anti-apoptotischen PKC reaktiviert werden. Eine mögliche Erklärung für die Inaktivität des TRAIL-R2 ist die Bildung von Heterokomplexen nach TRAIL-Stimulation oder der Einfluss der nicht-glykosilierten TRAIL-R2-Form. Zusätzlich lieferten die Ergebnisse dringende Hinweise auf die Beteiligung von TRAIL-R2 an Splicing- und Genregulationsvorgängen

Zur Bedeutung des Multicolour Bandings bei der Analyse von normalen und aberranten Chromosomen während verschiedener Phasen des Zellzyklus

Die zytogenetische Analyse chromosomaler Veränderungen mittels herkömmlicher Techniken, wie Giemsa- oder Reverse-Banding erlauben lediglich eine Unterscheidung zwischen positiven und negativen Banden und sind darüber hinaus stark von präparativen Einflüssen abhängig. Das Multicolour Banding produziert hingegen ein auf FISH-Sonden basierendes Vielfarbmuster, welches sich an der spezifischen DNA eines Chromosoms orientiert, eine sehr hohe Auflösung und Genauigkeit bietet und unabhängiger von der Präparation der Zellsuspension ist. Ein Großteil bereits bestimmter Metaphasechromosom-Bruchpunkte konnte mit dieser neuen Methode präzisiert bzw. korrigiert werden. Außerdem gelang es erstmals auch Interphasechromosomen auf Bandenniveau darzustellen, sie aufgrund ihrer Ähnlichkeit direkt mit Metaphasechromosomen zu vergleichen und sogar Aberrationen zu erkennen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, daß das Multicolour Banding herkömmlichen Bänderungstechniken teils deutlich überlegen ist und werfen zusätzlich Fragen zu etablierten Vorstellungen zur Anordnung des Interphasechromatins auf

Advanced control strategies for the continuous production of monoclonal antibodies

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Automation of high CHO cell density seed intensification via online control of the cell specific perfusion rate and its impact on the N-stage inoculum quality

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Topography-specific spindle frequency changes in obstructive sleep apnea

Background: Sleep spindles, as detected on scalp electroencephalography (EEG), are considered to be markers of thalamo-cortical network integrity. Since obstructive sleep apnea (OSA) is a known cause of brain dysfunction, the aim of this study was to investigate sleep spindle frequency distribution in OSA. Seven non-OSA subjects and 21 patients with OSA (11 mild and 10 moderate) were studied. A matching pursuit procedure was used for automatic detection of fast (≥ 13Hz) and slow (< 13Hz) spindles obtained from 30min samples of NREM sleep stage 2 taken from initial, middle and final night thirds (sections I, II and III) of frontal, central and parietal scalp regions. Results: Compared to non-OSA subjects, Moderate OSA patients had higher central and parietal slow spindle percentage (SSP) in all night sections studied, and higher frontal SSP in sections II and III. As the night progressed, there was a reduction in central and parietal SSP, while frontal SSP remained high. Frontal slow spindle percentage in night section III predicted OSA with good accuracy, with OSA likelihood increased by 12.1% for every SSP unit increase (OR 1.121, 95% CI 1.013 - 1.239, p=0.027). Conclusions: These results are consistent with diffuse, predominantly frontal thalamo-cortical dysfunction during sleep in OSA, as more posterior brain regions appear to maintain some physiological spindle frequency modulation across the night. Displaying changes in an opposite direction to what is expected from the aging process itself, spindle frequency appears to be informative in OSA even with small sample sizes, and to represent a sensitive electrophysiological marker of brain dysfunction in OSA

The Influence of IL-10 and TNFα on Chondrogenesis of Human Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Cultures

Chondrogenic differentiated mesenchymal stromal cells (MSCs) are a promising cell source for articular cartilage repair. This study was undertaken to determine the effectiveness of two three-dimensional (3D) culture systems for chondrogenic MSC differentiation in comparison to primary chondrocytes and to assess the effect of Interleukin (IL)-10 and Tumor Necrosis Factor (TNF)α on chondrogenesis by MSCs in 3D high-density (H-D) culture. MSCs were isolated from femur spongiosa, characterized using a set of typical markers and introduced in scaffold-free H-D cultures or non-woven polyglycolic acid (PGA) scaffolds for chondrogenic differentiation. H-D cultures were stimulated with recombinant IL-10, TNFα, TNFα + IL-10 or remained untreated. Gene and protein expression of type II collagen, aggrecan, sox9 and TNFα were examined. MSCs expressed typical cell surface markers and revealed multipotency. Chondrogenic differentiated cells expressed cartilage-specific markers in both culture systems but to a lower extent when compared with articular chondrocytes. Chondrogenesis was more pronounced in PGA compared with H-D culture. IL-10 and/or TNFα did not impair the chondrogenic differentiation of MSCs. Moreover, in most of the investigated samples, despite not reaching significance level, IL-10 had a stimulatory effect on the type II collagen, aggrecan and TNFα expression when compared with the respective controls

TRAILblazing Strategies for Cancer Treatment

In the late 1990s, tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), a member of the TNF-family, started receiving much attention for its potential in cancer therapy, due to its capacity to induce apoptosis selectively in tumour cells in vivo. TRAIL binds to its membrane-bound death receptors TRAIL-R1 (DR4) and TRAIL-R2 (DR5) inducing the formation of a death-inducing signalling complex (DISC) thereby activating the apoptotic cascade. The ability of TRAIL to also induce apoptosis independently of p53 makes TRAIL a promising anticancer agent, especially in p53-mutated tumour entities. Thus, several so-called TRAIL receptor agonists (TRAs) were developed. Unfortunately, clinical testing of these TRAs did not reveal any significant anticancer activity, presumably due to inherent or acquired TRAIL resistance of most primary tumour cells. Since the potential power of TRAIL-based therapies still lies in TRAIL's explicit cancer cell-selectivity, a desirable approach going forward for TRAIL-based cancer therapy is the identification of substances that sensitise tumour cells for TRAIL-induced apoptosis while sparing normal cells. Numerous of such TRAIL-sensitising strategies have been identified within the last decades. However, many of these approaches have not been verified in animal models, and therefore potential toxicity of these approaches has not been taken into consideration. Here, we critically summarise and discuss the status quo of TRAIL signalling in cancer cells and strategies to force tumour cells into undergoing apoptosis triggered by TRAIL as a cancer therapeutic approach. Moreover, we provide an overview and outlook on innovative and promising future TRAIL-based therapeutic strategies

Novel CACNA1A mutation(s) associated with slow saccade velocities

Mutations in the voltage-gated Cav2.1 P/Q-type calcium channel (CACNA1A) can cause a wide spectrum of phenotypes, including the episodic ataxia type 2. Beside the growing number of descriptions of novel CACNA1A mutations with episodic ataxia type 2 phenotype; there are only rare reports on interictal oculomotor signs other than nystagmus. We describe a novel CACNA1A mutation and an unclassified CACNA1A in-frame variant in a Swiss family presenting as the episodic ataxia type 2 phenotype associated with reduced saccade velocity. In this case series interictal clinical examination showed only minimal neurological findings as mild limb ataxia and nystagmus, but most interestingly saccade analysis of all three affected individuals demonstrated reduced mean saccade velocity. Genetic testing of CACNA1A revealed a de novo frame-shift mutation (c.2691dupC/p.Thyr898Leufs*170) in the index patient in addition to an unclassified in-frame variant (c.6657_6659dupCCA/p.His2220dup) segregating in all three affected individuals. The de novo frame-shift CACNA1A mutation and the unclassified in-frame CACNA1A variant were associated with the episodic ataxia type 2 phenotype and reduced mean saccade velocity, which suggests involvement of brainstem or neural pathways connecting brainstem and the cerebellum in this diseas