Das Pankreaskarzinom hat trotz chirurgischer und chemotherapeutischer Therapie
eine infauste Prognose. Seit einiger Zeit wird TRAIL als neue Therapieoption für
Malignome erprobt. TRAIL ist ein Todesligand, der in Tumorzellen Apoptose
auslösen kann, andere Zellen jedoch unbeschadet lässt. Neben TRAIL werden auch
monoklonale agonistische Antikörper gegen TRAIL-Rezeptoren in klinischen Studien
eingesetzt. Da TRAIL an zwei unterschiedliche Todesrezeptoren (TRAIL-R1 und
TRAIL-R2) binden kann, wurden in der vorliegenden Arbeit die spezfischen
Funktionen der beiden Rezeptoren in Pankreaskarzinom-Zellen untersucht.
Die TRAIL-Rezeptor-Expression von Pankreaskarzinom-Zelllinien wurde mittels
Western-Blot und Durchflusszytometrie analysiert. Pankreaskarzinom-Zellen wurden
mit TRAIL oder mit, bereits in klinischen Studien evaluierten, agonistischen
Antikörpern HGS-ETR1 (aktiviert TRAIL-R1) und HGS-ETR2 (aktiviert TRAIL-R2)
stimuliert. Zur Hemmung des jeweiligen Rezeptors wurden antagonistische anti-
TRAIL-R1/-TRAIL-R2-Antikörper verwendet. Zur Inhibition von PKC wurde GÖ6983
und zur Inhibition von MEK UO126 eingesetzt. Vitalität der Zellen wurde mittels
Kristallviolett-Assay, NF-kB-Induktion mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay
(EMSA) und Sezernierung von IL8 mittels ELISA bestimmt. Rezeptor-Lokalisation
wurde mittels Immunfluoreszenz, die Rezeptorkomplexe wurden mittels
Immunopräzipitation analysiert.
Die Ergebnisse zeigten, dass alle untersuchten Pankreaskarzinom-Zelllinien TRAILR1
und TRAIL-R2 auf der Zelloberfläche exprimierten. Weiter induzierte TRAIL in
diesen Zellen Apoptose und eine pro-inflammatorische Antwort (NF-kB und IL-8).
Interessanterweise zeigte der Einsatz von antagonistischen Antikörpern gegen
TRAIL-R1 bzw. -R2 in Kombination mit TRAIL-Stimulation, dass die TRAIL-induzierte
Apoptose und nicht-apoptotische Antwort fast ausschließlich über TRAIL-R1
vermittelt wird. Dass jedoch beide Rezeptoren potentiell funktionsfähig sind, zeigte
die Stimulation mit agonistischen Antikörpern. Sowohl HGS-ETR1 als auch HGSETR2
induzierten Apoptose, NF-kB und IL-8. Die Analyse der Rezeptorkomplexe
zeigte, dass TRAIL-Stimulation zur Entstehung von Heterokomplexen aus TRAIL-R1
und TRAIL-R2, die Stimulation mit agonistischen Antikörpern hingegen zur
Entstehung von Homokomplexen aus entweder TRAIL-R1 oder TRAIL-R2 führt.
Weiter konnte nach TRAIL-Stimulation eine weitere, kleinere TRAIL-R2-Form
identifiziert werden, die in der Molekulargröße einer nicht-glykosilierten Form
entspricht. Die Untersuchung von Signaltransduktionswegen zeigte, dass die
Hemmung von MEK Pankreaskarzinom-Zellen für TRAIL-vermittelte Apoptose
ausschließlich über TRAIL-R1 sensibilisiert. Hingegen sensibilisiert die Hemmung
von PKC die TRAIL-vermittelte Apoptose über beide Rezeptoren.
Immunhistochemische Untersuchungen zeigten, dass TRAIL-R1 und -R2 auf der
Zellmembran und im Zytoplasma lokalsiert sind. Interessanterweise konnte TRAILR2
zusätzlich auch im Zellkern nachgewiesen werden. Parallel durchgeführte
Immunpräzipitation mit anschließender Sequenzierung und Identifizierung der
Rezeptor-assoziierten Proteine zeigte, dass TRAIL-R2 (nicht aber TRAIL-R1) mit
zahlreichen Kernproteinen assoziiert ist, die am Splicing und der Regulation der
Genexpression beteiligt sind.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Pankreaskarzinom-
Zellen funktionsfähigen TRAIL-R1 und TRAIL-R2 exprimieren, die nach selektiver
Stimulation beide Apoptose auslösen können. Die apoptotische und proinflammatorische
Antwort nach Stimulation mit dem natürlichen Liganden TRAIL wird
jedoch nahezu ausschließlich über TRAIL-R1 vermittelt. Interessanterweise kann der
TRAIL-R2 durch die Hemmung der anti-apoptotischen PKC reaktiviert werden. Eine
mögliche Erklärung für die Inaktivität des TRAIL-R2 ist die Bildung von
Heterokomplexen nach TRAIL-Stimulation oder der Einfluss der nicht-glykosilierten
TRAIL-R2-Form. Zusätzlich lieferten die Ergebnisse dringende Hinweise auf die
Beteiligung von TRAIL-R2 an Splicing- und Genregulationsvorgängen