Research of polyphenols with neuroprotective potential in a yeast model of degeneration

Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012Polyphenols are the most abundant phytochemicals in the human diet. It is known that the consumption of polyphenol-rich foods, especially fruits and vegetables, translates into benefits for human health. Polyphenols besides to be free radical scavengers, are now considered to invoke a spectrum of cellular mechanisms of action, such as induction of endogenous antioxidants; modulation of genes related to cell survival/death; cell signaling pathway regulatory activity and regulation of the mitochondrial function. Increasing production of free radicals is one of the major causes of degeneration that can occur via redox-cycling, metabolism of xenobiotics, ageing, environmental toxins and mutant proteins. Agents that prevent these phenomena could be of particular therapeutic interest. In this study a yeast model of degeneration composed by four Saccharomyces cerevisiae strains with different sensitivities to oxidative stress, was implemented. Extracts from fruits and leaves of Corema album and Arbutus unedo were submitted to an in vitro procedure that mimics the gastro-intestinal digestion to obtain the Polyphenol-digested fractions (PDFs). After chemical characterization and toxicity, the PDFs protective effect was evaluated in the yeast model of degeneration. Protective effects were observed for ∆yap1 and ∆sod1 strains due to the treatment with C. album fruit and A. unedo fruit and leaf PDFs. At the same time alterations on GSH/GSSG ratio for these two strains were also observed in the presence of the PDFs with protective effects. However, it was not observed an effect in the production of reactive oxygen species (ROS) mediated by the tested PDFs, indicating that ROS scavenging is not the mechanism of action of PDFs. This work provided valuable information about possible mechanisms of protection of polyphenols after gastrointestinal digestion that will be further evaluated in a yeast model of Parkinson’s disease already implemented in DSB laboratory to provide more insights.Os polifenóis são os fitoquímicos mais abundantes na dieta humana. O consumo de alimentos ricos nestes compostos, principalmente frutas e vegetais, tem sido cada vez mais associado a efeitos benéficos para a saúde humana. Além disso, estudos indicam que há uma forte associação entre o consumo de alimentos ricos em polifenóis e a diminuição da incidência de doenças degenerativas. Os polifenóis são compostos conhecidos como sendo capazes de eliminar espécies reactivas de oxigénio, no entanto em estudos mais recentemente tem-se vindo a constatar que estes compostos estão também envolvidos num largo espectro de mecanismos de acção celulares, como é o caso da activação de moléculas antioxidantes endógenas, quelação de iões, modulação de genes relacionados com a morte/sobrevivência celular, regulação da activação de genes/proteínas de vias de sinalização celular e ainda na regulação da função mitocondrial. As reacções redox, que ocorrem no interior das células, estão na base de numerosas vias metabólicas importantes na homeostasia celular. O aumento na produção celular de espécies reactivas de oxigénio, ou de azoto, é uma das principais causas associadas ao desenvolvimento de doenças degenerativas. Este aumento pode ocorrer devido a vários tipos de insultos celulares como o metabolismo de xenobióticos, toxinas ambientais, proteínas mutantes tóxicas para a célula e mais importante, devido a processos de envelhecimento. A levedura Saccharomyces cerevisiae é um dos modelos biológicos mais versáteis para estudar as doenças degenerativas, devido ao facto dos mecanismos relacionados com a disfunção mitocondrial ou proteossomal e a desregulação transcricional serem extremamente bem conservados entre leveduras e humanos, permitindo estudar os mecanismos envolvidos neste tipo de doenças. Para além disso, os mecanismos inerentes à produção de espécies reactivas de oxigénio e de apoptose são reproduzidos com sucesso em levedura. Neste estudo o principal objectivo consiste em avaliar o potencial protector de metabolitos provenientes da digestão de frutos e folhas de Corema album e Arbutus unedo num modelo de degeneração em levedura optimizado durante este trabalho. Estudos preliminares do laboratório Biologia da Doença e do Stresse (resultados não publicados) demostraram que as fracções totais não digeridas destas duas plantas apresentam elevada capacidade antioxidante e actividade protectora de células submetidas a stresse. Para atingir os objectivos propostos para este trabalho foi inicialmente optimizado um modelo de degeneração em levedura induzido pelo H2O2. Este modelo é composto por 4 estirpes de S. cerevisiae (BY4714, ∆yap1, ∆sod1 e AD1-8), que apresentam diferentes sensibilidades ao stress oxidativo. Numa primeira fase foram definidos os tempos de geração (Tg) para cada estirpe, sendo de 2 h para BY4741 e ∆yap1 e de 3 h para ∆sod1 e AD1-8 e as concentrações de H2O2 a usar tanto em meio sólido como em meio líquido. Em meio solido foram escolhidas as concentrações de 0.15 mM para ∆yap1 e ∆sod1 e 0.5 mM para BY4741 e AD1-8, para incubações prolongadas. Em meio líquido foi escolhida a concentração de 2 mM de H2O2 e o Tg de cada estirpe como tempo de incubação. Os resultados obtidos para as curvas de crescimento indicam que baixas concentrações de H2O2 na célula podem activar mecanismos de defesa e activação de genes que são importantes para o crescimento e diferenciação celulares. Os extractos hidroetanólicos provenientes de frutos e folhas de C. album e A. unedo foram submetidos a um processo de digestão in vitro que mimetiza as alterações que ocorrem durante a digestão gastro intestinal e a um passo final de limpeza, para obtenção das fracções digeridas de polifenóis (FDPs). Paralelamente foram também digeridos os extractos totais de Rubus ideaus fruto e Ginkgo biloba folha para fins comparativos, visto que estas duas espécies estão descritas como tendo capacidade de melhorar o desempenho celular constituindo benefícios para a saúde humana. Numa segunda fase deste estudo foi efectuada a caracterização química dos extractos obtidos em cada etapa do processo de digestão in vitro, tendo sido avaliado o conteúdo total em fenóis e a capacidade antioxidante in vitro. Esta caracterização permitiu a compreensão das alterações e perdas que ocorrem nos compostos desde que são ingeridos até ao final da digestão no intestino delgado. Em particular neste estudo foram utilizadas as fracções IN, correspondente ao conteúdo que entra passivamente na circulação sanguínea e OUT, que diz respeito ao conteúdo que é atinge o colón, visto que podem ocorrer várias alterações químicas aos compostos. A terceira tarefa permitiu avaliar a toxicidade inerente a cada FDPs por “spot assays”, tendo sido escolhida a concentração máxima de 250 ∆g GAE.mL-1 para a qual foi posteriormente testado o seu efeito protector. Acima desta concentração a FDP de C. album folha já apresenta toxicidade. Para testar o efeito protector destas fracções no modelo de degeneração em levedura, sob condições de stresse oxidativo foram utilizadas duas metodologias distintas. Após seleccionadas as FDPs que apresentam melhorias na viabilidade por spot assays, foi avaliado o estado metabólico geral das células pelo ensaio do CellTiter-Blue viability assay. Em ambos os métodos, tanto para a ∆yap1 como para a ∆sod1 foi observada uma capacidade protectora dos metabolitos digeridos do fruto de C. album e do fruto e folha de A. unedo. Estes resultados permitem concluir que os mecanismos de defesa celulares são activados ou modelados pelos compostos naturais presentes nestas espécies como é o caso dos polifenóis. No caso da FDP dos frutos de A. unedo os resultados indicam uma capacidade de activar mecanismos que permitem á célula defender-se mais eficazmente quando submetida a um stresse oxidativo posteriormente. Numa fase final do trabalho foi avaliado o estado redox da célula. A produção exacerbada de espécies reactivas de oxigénio nas células submetidas está descrita como uma das condições de maior importância no desenvolvimento de doenças degenerativas, foi avaliada a produção destas espécies na presença e na ausência das FDPs, após as células serem submetias a um stresse oxidativo. Estas espécies foram quantificadas pelo método de H2DCFDA e foi observado um aumento na produção destas espécies quando estas eram incubadas na presença de H2O2. No entanto contrariamente ao esperado não foram observadas quaisquer alterações na produção de espécies reactivas de oxigénio, quando as células eram pré-incubadas com os FDPs. Estes resultados contrariam alguns estudos que apontam a eliminação destas espécies como o mecanismo pelo qual os polifenóis melhoram a viabilidade celular mas reforça a ideia que estes compostos possam actuar por outros mecanismos de regulação envolvidos na defesa celular. Outro parâmetro analisado foi o conteúdo em tióis totais por HPLC. Apenas foram observadas diferenças nos níveis de GSH reduzido para as estirpes ∆yap1 e ∆sod1, quando submetidas ou não a stresse oxidativo, não se tendo observado diferenças para a WT. O facto de não se observarem diferenças para a WT dever-se-á ao facto de esta estirpe possuir todos os mecanismos antioxidantes necessários para repor os níveis de GSH reduzido. Avaliou-se então a razão GSH/GSSG para as estirpes mais afectadas, ∆yap1 e ∆sod1, na presença e na ausência das FDPs. A razão GSH/GSSG é considerado um indicador do estado redox das células. Na presença das FDPs com capacidade protectora, foi observada uma diminuição no estado oxidado das células para a estirpe ∆sod1. No entanto, para a estirpe ∆yap1 apenas o fruto de A. unedo apresenta capacidade de melhorar significativamente o estado redox da célula, quando esta é submetida à condição de stresse oxidativo, sendo que ainda assim não é capaz de repor os níveis normais de oxidação celular para o ∆yap1. Observou-se ainda através das metodologias aplicadas que a estirpe yap1 é a mais afetada pelo stresse oxidativo, o que era espectável, uma vez que o factor de transcrição Yap1p para o qual esta estirpe é mutante, regula vários enzimas antioxidantes como a SOD1 e SOD2. As metodologias aplicadas neste trabalho parecem indicar que os polifenóis presentes nas fracções digeridas têm a capacidade de afectar os mecanismos relacionados com sobrevivência e proliferação celular. Este trabalho fornece informação importante acerca de possíveis mecanismos de protecção dos polifenóis depois da digestão gastrointestinal, que serão avaliados posteriormente num modelo de PD em levedura já implementado no laboratório da Biologia da Doença e do Stresse

Characterisation of microbial attack on archaeological bone

As part of an EU funded project to investigate the factors influencing bone preservation in the archaeological record, more than 250 bones from 41 archaeological sites in five countries spanning four climatic regions were studied for diagenetic alteration. Sites were selected to cover a range of environmental conditions and archaeological contexts. Microscopic and physical (mercury intrusion porosimetry) analyses of these bones revealed that the majority (68%) had suffered microbial attack. Furthermore, significant differences were found between animal and human bone in both the state of preservation and the type of microbial attack present. These differences in preservation might result from differences in early taphonomy of the bones. © 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved