High dietary zinc feeding promotes persistence of multi-resistant E. coli in the swine gut

High levels of zinc oxide are used frequently as feed additive in pigs to improve gut health and growth performance and are still suggested as an alternative to antimicrobial growth promoters. However, we have recently described an increase of multi-resistant E. coli in association to zinc feeding in piglets. This previous study focused on clonal diversity of E. coli, observing the effect on multi-resistant strains by chance. To shed further light into this highly important topic and falsify our previous findings, we performed a zinc pig feeding trial where we specifically focused on in-depth analysis of antimicrobial resistant E. coli. Under controlled experimental conditions, piglets were randomly allocated to a high dietary zinc (zinc group) and a background zinc feeding group (control group). At different ages samples were taken from feces, digesta, and mucosa and absolute E. coli numbers were determined. A total of 2665 E. coli isolates were than phenotypically tested for antimicrobial resistance and results were confirmed by minimum inhibitory concentration testing for random samples. In piglets fed with high dietary zinc, we detected a substantial increase of multi-resistant E. coli in all gut habitats tested, ranging from 28.9-30.2% multi-resistant E. coli compared to 5.8-14.0% in the control group. This increase was independent of the total number of E. coli. Interestingly, the total amount of the E. coli population decreased over time. Thus, the increase of the multi-resistant E. coli populations seems to be linked with persistence of the resistant population, caused by the influence of high dietary zinc feeding. In conclusion, these findings corroborate our previous report linking high dietary zinc feeding of piglets with the occurrence of antimicrobial resistant E. coli and therefore question the feeding of high dietary zinc oxide as alternative to antimicrobial growth promoters

Einfluss von Futterzusätzen auf die porcine intestinale Escherichia coli Mikrobiota

Since the European Union prohibited antimicrobial growth promoters in livestock breeding in 2006, feed supplements like probiotics and bivalent cations have received more and more attention in animal farming. Pigs are the most relevant livestock population and supply the main part of meat consumed in Germany, which is a main global provider of slaughtered pigs. Furthermore, pigs are omnivores like humans and their gastrointestinal tract is similar to that of humans. Studying the intestinal microbiome in pigs is thus of particular importance not only for the pig population itself but also for understanding mechanisms of the human gut microbiome. As a part of the CRC 852 the aim of this project (A3) was to investigate the impact of the feed supplements E. faecium NCIMB 10415 (a probiotic strain) and the divalent metal ion zinc on the intestinal E. coli population in pigs. E. coli is a member of the gastrointestinal microbiota of birds and mammals, including pigs, and contributes to the maintenance of the microbial gut balance. However, E. coli is also one of the most important intestinal pathogens in pig production, causing high economic losses, and is usually the cause of post-weaning diarrhea. In two independent animal trials piglets were supplemented with the probiotic E. faecium NCIMB 10415 (E. faecium trial) and zinc oxide (zinc trial). Samples were taken from the intestine and the feces at different times around weaning. In the E. faecium trial E. coli strains were isolated from three intestinal habitats (mucosa, digesta, and feces) of the probiotic and control group. E. coli bacteria were characterized via PFGE for clonal analysis. The high diversity of E. coli was reflected by 168 clones. MLST was used to determine the phylogenetic background. Pathotypes of E. coli were further defined using VAG-PCR. While these analyses discerned only a few significant differences in the E. coli population between the two feeding groups (hlyF [P = 0.011], focG [P = 0.015], papC [P = 0.008], papGIII [P = 0.028], iroN [P = 0.04], and cvaC [P = 0.002], less frequent in the probiotic group), analyses distinguishing clones that were uniquely isolated in the probiotic group only, the control group only, or both groups (shared group) revealed clear effects. Interestingly, extra-intestinal pathogenic E. coli (ExPEC)-typical clones adhering to the mucosa were significantly reduced in the probiotic group (a total of 11 VAGs were reduced: tsh [P = 0.017], mat [P = 0.001], focG [P = 0.002], papC [P = 0.037], colV [P = 0.048], ompT [P = 0.003], cvaC [P = 0.004], iroN [P = 0.000], etsB [P = 0.003], etsC [P = 0.003], and hlyF [P = 0.001]). In addition, our data question the relevance of data based on only on the sampling of fecal E. coli. Using fecal samples only as a means of referring to the whole intestinal E. coli microbiota is questionable, because we could not detect any differences between fecal samples. In the zinc trial, E. coli were isolated from ileum and colon digesta of the high zinc (2,500 ppm), low zinc, and control group (50 ppm). After counting, the E. coli population was characterized via PFGE and MLST for the determination of the phylogenetic background. Phenotypic resistance screening via ADT and MIC testing was followed with detection of resistance genes for selected clones. While the E. coli number did not change significantly (P = 0.787), a higher diversity of E. coli clones in animals supplemented with high zinc compared to the control group could be detected (36 clones in control group only vs. 69 clones in high zinc group only; 76 clones shared by both groups) after dividing the clones from high zinc and control group into three groups: clones appearing only in the control group (control only), clones appearing only in the zinc group (zinc only), and clones appearing in both groups (shared). The proportion of multi-resistant E. coli was significantly increased in the zinc group only compared to the control group only (18.6% vs. 0%). The shared group harbored 13.2% multi-resistant E. coli. Additionally, up to three additional phenotypic and genotypic resistances could be detected in subclones isolated from the high zinc group compared to their clones. Characterization of these subclones implied a higher proportion of antimicrobial resistance due to zinc's influences on plasmid uptake. In conclusion, it seems that neither of the investigated feed supplements are optimal or suitable for the replacement of antibiotics as growth promoters in animal breeding. Although the results of this study imply a prophylactic effect of E. faecium against potential pathogenic E. coli at the mucosa, the lack of a better performance of the piglets and the negative effect of a delayed immune response in Salmonella challenges (Kreuzer et al., 2012a; Siepert et al., 2014) are an argument against an application of E. faecium. The results of the zinc trial showed that high zinc concentrations dramatically increase the proportion of multi-resistant E. coli. This is an unacceptable side effect, because feed supplements like zinc, used as replacement for antibiotics as growth promoter, should prevent the spread of multi-resistances. If the hypothesis regarding a higher plasmid uptake promoted by zinc could be proven, feeding with high zinc concentrations should be stopped immediately.Seit dem die Europäische Union den Einsatz von antibiotischen Wachstumsförderern in der landwirtschaftlichen Tierproduktion im Jahre 2006 verboten hat, ist die Verwendung von Futterzusätzen kontinuierlich angestiegen. Dabei stellt die Schweinehaltung einen Hauptanteil in der deutschen Tierproduktion dar. Neben der wichtigen Rolle in der Fleischproduktion sind Schweine und deren Darmmikrobiota auch gut geeignet um Rückschlüsse auf die menschliche intestinale Mikrobiota zu ziehen. Bei beiden Spezies handelt es sich um Omnivore deren Anatomie des Verdauungstrakts sich sehr ähnelt. Aufgrund der Wichtigkeit in der Tierproduktion und der Ähnlichkeit zur menschlichen Darmmikrobita eignen sich Schweine sehr gut um Einflüsse von verschiedenen Futterzusätzen auf die intestinale Mikrobiota und das Immunsystem, das eng mit der Mikrobiota verbunden ist zu untersuchen. Das Projekt war ein Teilprojekt (A3) des SFB 852 und hatte das Ziel den Einfluss der Futterzusätze Enterococcus (E.) faecium NCIMB 10415 (Probiotikum) und Zink auf die E. coli Mikrobiota in Schweinen zu untersuchen. Kommensale E. coli sind Bestandteil der Mikrobiota von Vögeln und Säugetieren und tragen zur Aufrechterhaltung der Darmbalance bei. Intestinal pathogene E. coli gehören zu den wichtigsten Pathogenen in der Mikrobiota und sind oft die Ursache von Durchfallerkrankungen bei Absetzferkeln. Die Fütterungsversuche sollten zeigen inwiefern die E. coli Population im Darm von den beiden Futterzusätzen beeinflusst wird. In zwei unabhängigen Tierversuchen mit Ferkeln wurden jeweils das Probiotikum E. faecium NCIMB 10415 (E. faecium Versuch) und das zweiwertige Metallkation Zink in Form von Zinkoxid (Zink Versuch) gefüttert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden unterschiedliche Proben aus dem Darm entnommen und der Kot der Ferkel gesammelt. Im E. faecium Versuch wurden Proben vor und nach dem Absetzen entnommen (Mucosa und Digesta aus dem Colon und Kot), da das ein besonderer Stressauslöser bei den Tieren ist. Nach der Isolierung von E. coli aus den Proben und der Identifizierung von 168 Klonen wurden diese auf Unterschiede in ihrer Virulenz und Phylogenie untersucht. Dabei zeigten sich jedoch kaum signifikante Unterschiede zwischen den zwei Fütterungsgruppen (hlyF [P = 0,011], focG [P = 0,015], papC [P = 0,008], papGIII [P = 0,028], iroN [P = 0,04] und cvaC [P = 0,002] waren in der Probiotikagruppe reduziert). Nach einer statistischen Analyse bei der die Klone nach deren Auftreten in drei Gruppen (Klone die ausschließlich in der Kontrollgruppe, der Probiotikagruppe und in beiden Fütterungs-gruppen vorkamen) geteilt wurden, konnte nachgewiesen werden, dass die Fütterung von E. faecium die ExPEC-typischen Gene an der Mucosa reduzieren konnte (insgesamt 11 VAGs waren reduziert: tsh [P = 0,017], mat [P = 0,001], focG [P = 0,002], papC [P = 0.037], colV [P = 0,048], ompT [P = 0,003], cvaC [P = 0,004], iroN [P = 0,000], etsB [P = 0,003], etsC [P = 0,003] und hlyF [P = 0,001]). Zudem konnte gezeigt werden wie wichtig es ist Proben direkt aus dem Darm zu entnehmen, da in den Kotproben keine Unterschiede nachgewiesen werden konnten. Somit können Kotproben nicht die genauen Verhältnisse in der E. coli Mikrobiota wiedergeben. Damit müssen Studien zur E. coli Mikrobiota, die nur auf Kotproben basieren, in Frage gestellt werden. Im Zinkversuch wurden die Proben (Digesta aus Ileum und Colon) erst nach dem Absetzen der Ferkel entnommen. Nach Auszählung und Isolierung der E. coli aus den Proben wurden 181 E. coli Klone mittels PFGE identifiziert. Nachdem genotypische Untersuchungen zum Nachweis von Virulenz-assoziierten Faktoren (VAG-PCR) und die MLST keine signifikanten Unterschiede im Auftreten von Virulenz und Phylogenie zeigen konnten (für alle getesteten Gene P-Werte ≥ 0,05), wurden die Klone mittels ADT und MIC auf Antibiotikaresistenzen untersucht. Während sich die E. coli Anzahl zwischen der hohen Zink- und Kontrollgruppe nicht signifikant unterschied (P = 0,787), konnte eine höhere Diversität von E. coli Klonen in den Tieren mit der hohen Zinkdosierung detektiert werden (36 Klone in der Kontroll- vs. 69 Klone in der hohen Zinkgruppe; 76 Klone, die in beiden Gruppen vorkamen), nachdem die Klone in drei Gruppen aufgeteilt wurden (Klone die nur in der Kontrollgruppe, nur in der Zinkgruppe und in beiden Gruppen vorkamen). Weiterhin zeigte der Vergleich der drei Gruppen, dass die Anzahl multiresistenter Klone in der Zinkgruppe erhöht war im Vergleich zur Kontrollgrupe (18,6% vs. 0%). Die Gruppe, die aus Klonen aus beiden Gruppen bestand, besaß 13,2% multiresistente E. coli. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass Klone und deren Subklone, die in beiden Gruppen vorkamen, in der PFGE ein gleiches Profil aufwiesen, sich jedoch in der Anzahl an Resistenzen unterschieden. Mit einer Plasmidprofilanalyse und Southern Blotting konnte gezeigt werden, dass die meisten der Antibiotikaresistenzen auf Plasmiden codiert waren. Somit war die Fütterung von Zink mit einem erhöhten Anteil an multiresistenten E. coli im Darm der Ferkel assoziiert. Ein Einfluss von Zink auf den Plasmidaustausch, der diesen erhöhen würde, könnte dabei eine mögliche Ursache sein. Im Rahmen dieser Arbeit wird deutlich, dass keines der beiden Futterzusätze als optimaler Ersatz für Antibiotika als Wachstumsförderer in der Tierproduktion geeignet ist. Obwohl unsere Ergebnisse auf einen prophylaktischen Effekt von E. faecium gegen potentiell pathogene E. coli an der Mukosa hinweisen, sprechen die fehlende Leistungssteigerung der Ferkel (Futteraufnahme, Wachstum) und der negative Einfluss auf die Immunantwort während der Salmonellen Infektionsversuche (Kreuzer et al., 2012a; Siepert et al., 2014) gegen eine Applikation von E. faecium. Der Zinkversuch hat gezeigt, dass hohe Zinkkonzentrationen mit einem dramatisch erhöhten Anteil an multiresistenten E. coli einhergehen. Dies ist ein unakzeptabler Nebeneffekt, da der wesentliche Grund für das Verbot von Antibiotika als Wachstumsförderer und die daraus resultierende Nutzung von Futterzusätzen wie Zink, die Verhinderung der Anreicherung und Verbreitung von Multiresistenzen war. Falls sich die Annahme bestätigt, dass Zink eine erhöhte Plasmidaufnahme fördert, sollte die Fütterung von hohen Zinkdosen sofort gestoppt werden

Schematic diagram of the zinc feeding trial.

<p>Piglets were weaned 25±1 days after birth. N values present the number of animals per feeding group and experimental stage. Arrows indicate the sampling time points linked to the pig age and habitat of taken samples.</p

Absolute numbers of the porcine <i>E</i>. <i>coli</i> population.

<p>Quantitative data for the <i>E</i>. <i>coli</i> isolates of the zinc feeding trial in association to intestinal habitat (feces, digesta, mucosa) and age of piglets (24, 38, 52 days of age). Colonies were counted on CHROMagar Orientation plates and the cfu/g sample was determined. Significant differences are indicated by p values and could only be detected for changes between different time points but not between the two feeding groups. Outliers are displayed separately.</p

Proportion of multi-resistant porcine <i>E</i>. <i>coli</i> isolates.

<p>Piglets were weaned at 25±1 days of age and data for the multi-resistance status are shown for feces, digesta, and mucosa isolates of the three sampling time points (24, 38, 52 days of age) and for both zinc feeding groups of the trial. Phenotypic resistance against six different antimicrobial substances was determined and isolates were assigned as multi-resistant when they were resistant against at least three different antimicrobial classes. Numbers indicate the number of investigated isolates. Significant differences are indicated by p values.</p

Distribution of the phenotypic resistance patterns of the 453 feces, 174 digesta, and 158 mucosa multi-resistant <i>E</i>. <i>coli</i> isolates.

<p>Multi- resistance was defined as resistance against at last three classes of antimicrobials. The distribution was analyzed for the different habitats (feces, digesta, mucosa) and sampling time points (24, 38, 52 days of age) for both feeding groups of the zinc pig feeding trial.</p