Isolierung und Charakterisierung von Zielgenen des homöotischen Transkriptionsfaktors DEFICIENS aus Antirrhinum majus

DEFICIENS (DEF) ein homöotisches MADS-Box Gen, reguliert die Organogenese der Petalen und Stamina, welche sich in zwei benachbarten Wirteln der A. majus Blüte entwickeln. Die Zielgene, durch die das regulatorische Potential von DEF während der Entwicklung der Blütenorgane realisiert wird, sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Für die korrekte Ausprägung von Petalen und Stamina ist die kontinuierliche DEF Expression von Phasen der Organinitiierung bis in späte Entwicklungsstadien hinein notwendig. Daher wird angenommen, dass DEF die Expression von unterschiedlichen Zielgenen sowohl in frühen, als auch in späten Phasen reguliert. Auf der Basis morphologischer Kriterien wurden die späten Differenzierungsphasen der Petalenentwicklung in vier definierte Stadien (P1-P4) eingeteilt. Aus den mit ihnen durchgeführten Expressionsprofil-Experimenten ging hervor, dass mindestens ein Fünftel der in Sepalen und Petalen exprimierten Gene während der Petalenentwicklung reguliert werden. Funktionelle Analysen definierter Subgruppen von ko-regulierten Genen zeigten, dass Veränderungen in der Genexpression morphologischen Differenzierungsprozessen zugeordnet werden können. Zudem unterliegt der größte Teil der Petalen-spezifisch exprimierten Gene einer hohen zeitlichen Regulation. Die frühe Petalenentwicklung bis Ende des Stadiums P1 ist Zellteilungs-geprägt. Der enorme Längenzuwachs der späten Petalenstadien P3 und P4 wird dagegen durch Zellstreckungsprozesse realisiert. Das Petalenstadium P3 wurde aufgrund der dort festgestellten hohen Regulationsaktivität von DEF zur Isolierung von Zielgenen ausgewählt. Mittels der konditionellen def-101 Mutante wurden in weiteren Expressionsprofil-Experimenten 108 ESTs ermittelt, deren Expression in Folge einer reduzierten DEF-Funktion reguliert wird. Dabei zeigte sich, dass DEF zu gleichen Teilen als Aktivator und Repressor agiert. In unabhängigen Expressions-Studien konnten von einer Auswahl dieser Gene über 80% als differentiell exprimiert bestätigt werden. Funktionelle Analysen dieser DEF-Zielgene zeigten, dass DEF in dem untersuchten Petalenstadium P3 hauptsächlich Prozesse des Zellwandmetabolismus aktiviert und notwendig ist, um die Expression von Genen die an der Photosynthese beteiligt sind, zu reprimieren. Darüber hinaus wurde die Expression von sechs ausgewählten dieser über 100 DEF-Zielgene detailliert charakterisiert. Neben semiquantitativen RT-PCR-Analysen in WT Organen, wurde die durch DEF vermittelte Transkriptionsregulation der aus Petalen P3 isolierten Gene auch in Stamina des gleichen Stadiums und jungen Infloreszenzen untersucht. Abschließend wurde eine in vivo Interaktion des DEF Proteins mit isolierten Promotorfragmenten der ausgewählten DEF-Zielgene mittels X-ChIP-PCR-Analysen überprüft. Dabei konnte für das Extensin-ähnliche Gen DEFTup 1, dessen Transkription nachweislich durch die DEF-Funktion reguliert wird gezeigt werden, dass DEF direkt oder als Bestandteil eines Proteinkomplexes mit dem Promotor des Zielgens interagiert. In dieser Arbeit wurde somit ein System kombinierter Methoden zur Isolierung von DEF-Zielgenen etabliert, mit dem über 100 neue, unter der Kontrolle des homöotischen Transkriptionsfaktors stehende Gene isoliert wurden. Abgesehen von der autoregulativen Transkriptionskontrolle von DEF und GLO durch das Heterodimer ihrer eigenen Proteine, konnte mit DEFTup 1 das erste direkte Zielgen von DEFICIENS nachgewiesen werden

Characterization of Antirrhinum Petal Development and Identification of Target Genes of the Class B MADS Box Gene DEFICIENS

The class B MADS box transcription factors DEFICIENS (DEF) and GLOBOSA (GLO) of Antirrhinum majus together control the organogenesis of petals and stamens. Toward an understanding of how the downstream molecular mechanisms controlled by DEF contribute to petal organogenesis, we conducted expression profiling experiments using macroarrays comprising >11,600 annotated Antirrhinum unigenes. First, four late petal developmental stages were compared with sepals. More than 500 ESTs were identified that comprise a large number of stage-specifically regulated genes and reveal a highly dynamic transcriptional regulation. For identification of DEF target genes that might be directly controlled by DEF, we took advantage of the temperature-sensitive def-101 mutant. To enhance the sensitivity of the profiling experiments, one petal developmental stage was selected, characterized by increased transcriptome changes that reflect the onset of cell elongation processes replacing cell division processes. Upon reduction of the DEF function, 49 upregulated and 52 downregulated petal target genes were recovered. Eight target genes were further characterized in detail by RT-PCR and in situ studies. Expression of genes responding rapidly toward an altered DEF activity is confined to different petal tissues, demonstrating the complexity of the DEF function regulating diverse basic processes throughout petal morphogenesis

Eur Radiol.

Objectives: We aimed to define brain iron distribution patterns in subtypes of early-onset Alzheimer’s disease (EOAD) by the use of quantitative susceptibility mapping (QSM). Methods: EOAD patients prospectively underwent MRI on a 3-T scanner and concomitant clinical and neuropsychological evaluation, between 2016 and 2019. An age-matched control group was constituted of cognitively healthy participants at risk of developing AD. Volumetry of the hippocampus and cerebral cortex was performed on 3DT1 images. EOAD subtypes were defined according to the hippocampal to cortical volume ratio (HV:CTV). Limbic-predominant atrophy (LPMRI) is referred to HV:CTV ratios below the 25th percentile, hippocampal-sparing (HpSpMRI) above the 75th percentile, and typical-AD between the 25th and 75th percentile. Brain iron was estimated using QSM. QSM analyses were made voxel-wise and in 7 regions of interest within deep gray nuclei and limbic structures. Iron distribution in EOAD subtypes and controls was compared using an ANOVA. Results: Sixty-eight EOAD patients and 43 controls were evaluated. QSM values were significantly higher in deep gray nuclei (p < 0.001) and limbic structures (p = 0.04) of EOAD patients compared to controls. Among EOAD subtypes, HpSpMRI had the highest QSM values in deep gray nuclei (p < 0.001) whereas the highest QSM values in limbic structures were observed in LPMRI (p = 0.005). QSM in deep gray nuclei had an AUC = 0.92 in discriminating HpSpMRI and controls. Conclusions: In early-onset Alzheimer’s disease patients, we observed significant variations of iron distribution reflecting the pattern of brain atrophy. Iron overload in deep gray nuclei could help to identify patients with atypical presentation of Alzheimer’s disease. Key Points: • In early-onset AD patients, QSM indicated a significant brain iron overload in comparison with age-matched controls. • Iron load in limbic structures was higher in participants with limbic-predominant subtype. • Iron load in deep nuclei was more important in participants with hippocampal-sparing subtype. © 2022, The Author(s), under exclusive licence to European Society of Radiology

Treatment of an infant with X-linked severe combined immunodeficiency (SCID-X1) by gene therapy in Australia

OBJECTIVE: To report the outcome of gene therapy in an infant with X-linked severe combined immunodeficiency (SCID-X1), which typically causes a lack of T and natural killer (NK) cells. DESIGN AND SETTING: Ex-vivo culture and gene transfer procedures were performed at The Children\u27s Hospital at Westmead, Sydney, NSW, in March 2002. Follow-up to March 2005 (36 months) is available. PATIENT: A 9-month-old male infant with confirmed SCID-X1 (including complete absence of T cells) with an NK+ phenotype (a less common variant of SCID-X1), and no HLA-identical sibling donor available for conventional bone marrow transplantation. PROCEDURE: CD34+ haemopoietic progenitor cells were isolated from harvested bone marrow and cultured with cytokines to stimulate cellular replication. Cells were then genetically modified by exposure to a retrovirus vector encoding human gamma c (the common gamma chain of several interleukin receptors; mutations affecting the gamma c gene cause SCID-X1). Gene-modified cells (equivalent to 1.3 x 10(6) CD34+/gamma c+ cells/kg) were returned to the infant via a central line. RESULTS: T cells were observed in peripheral blood 75 days after treatment, and levels increased rapidly to 0.46 x 10(9) CD3+ cells/L at 5 months. Within 2 weeks of the appearance of T cells, there was a distinct clinical improvement, with early weight gain and clearance of rotavirus from the gut. However, T-cell levels did not reach the reference range, and immune reconstitution remained incomplete. The infant failed to thrive and developed weakness, hypertonia and hyperreflexia in the legs, possibly the result of immune dysregulation. He went on to receive a bone marrow transplant from a matched unrelated donor 26 months after gene therapy. CONCLUSIONS: This is the first occasion that gene therapy has been used to treat a genetic disease in Australia. Only partial immunological reconstitution was achieved, most likely because of the relatively low dose of gene-corrected CD34+ cells re-infused, although viral infection during the early phase of T-cell reconstitution and the infant\u27s NK+ phenotype may also have exerted an effect