Unveiling the physiological and molecular basis of Mycobacterium tuberculosis complex biofilms: the potential role of Rv2488c

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016The Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) includes several closely-related pathogenic species, namely M. tuberculosis, the main etiological agent of human tuberculosis (TB), and M. bovis, the causative agent of bovine tuberculosis (bTB), one of the most relevant zoonosis in the world. The complex pathogenesis of MTC bacteria is influenced by several factors, including host and bacterial genetic backgrounds and environmental factors. On infection, a proportion of infecting bacilli is able to survive and strive among the challenging conditions present in the host’s macrophage. Current models of mycobacterial persistence invoke the presence of dormant populations of non-growing cells that reactivate during host immunosuppression. Bacterial biofilms, described as single or multispecies communities triggered by cell-density dependent Quorum-Sensing (QS) events, exhibit heterogeneous and stress-tolerant populations that thrive under inhospitable niches and display recalcitrant characters, such as increased xenobiotic tolerance and resistance to host’s immune response. M. tuberculosis infections in humans have similarities to microbial biofilms, displaying antibiotic resistance, asymptomatic latency and a persistence phenotype associated to a dormant and non-replicating state of infecting microorganisms that enables evasion from the host’s immune system. The clinical phenotype of TB thus raises the question of whether or not M. tuberculosis latent infections are associated to the biofilm phenotype in vivo and if these multicellular structures may allow persistence of infection and recalcitrance to xenobiotic through time. Biofilm formation and maturation is modulated by cell density and the accumulation of signaling molecules (autoinducers) that bind a cognate response regulator and initiate a transduction cascade, triggering QS-dependent gene expression. Contrasting with the well-studied QS circuits of many pathogenic bacterial species, mycobacterial QS mechanisms remain poorly explored. The recent bioinformatic analysis of 53 actinobacterial genomes highlighted the presence of several putative LuxR response regulator determinants in mycobacteria. Interestingly, pathogenic members of MTC exhibit three coding DNA sequences (CDS), one of which is Rv2488c, presenting an unprecedented architectural organization that simultaneously associate adenylate cyclase and LuxR domain sequences. Being coupled with adenylate cyclase activity, we hypothesized that LuxR regulators may potentially respond to a wider range of environmental signals, enabling the cell to more efficiently cope with deleterious stress. This study aimed to identify which environmental conditions favor the establishment and maturation of biofilms by MTC bacteria in vitro and to explore the microdiversity of LuxR-like Rv2488c within circulating M. tuberculosis and M. bovis strains, also evaluating Rv2488c recruitment by the cell through the assessment of its transcriptional profile under the conditions that mimic host microenvironment. The bioinformatic analyses of Rv2488c sequences from 81 MTC publicly available genomes denoted a highly heterogeneous pattern among M. tuberculosis strains, specifically through the accumulation of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and/or INDELs that were more prevalent at the DNA-binding and cyclase homology domains, while the 25 M. bovis isolates under scrutiny depicted high degree of conservation. The polymorphisms found were used to simulate three-dimensional protein models, showing that the correspondent structural architecture is altered when compared to reference M. tuberculosis H37Rv, also suggesting functional impairment of the encoded protein in several clinical M. tuberculosis strains due to frameshift-causing INDELs. The neighbor joining cladograms inferred from the analyzed M. bovis and M. tuberculosis sequences thus suggest different evolutionary pressure and microevolutionary history of Rv2488c among these two MTC ecotypes, possibly reflecting host niche adaptation. Batch culture growth of M. bovis BCG Tokyo, M. smegmatis mc2 155 and two field M. bovis strains (I and II) under in vitro environmental conditions mimicking host’s microenvironment and phagosomal maturation, including low pH, magnesium or iron starvation, reactive oxygen intermediates, acetate as alternative carbon source and toxic rifampicin challenge, was tested in modified Middlebrook 7H9 broth to disclose the associated physiological and transcriptional responses. Viable cell count, survival percentage, specific growth rate and OD590 of crystal violet-stained attached cells, were determined to compare mycobacterial physiology upon stress. Exposure to acid (pH 5.5) using sodium pyruvate as carbon source impaired M. bovis growth, leading to slower metabolism (two-fold reduction in specific growth rate) and severely affecting the final amount of biomass in suspension (reduction of viable cell count in five orders of magnitude and survival percentage to 0.00127%, as compared to control). Growth of M. bovis under the presence of rifampicin 25 μg/ml decreased survival percentage to 50%, although the observed effect in growth rate was less pronounced than the one induced by low pH. Mycobacterial cells formed reticulated pellicles at the air-medium interface and attached to the periphery of 12 well-microtitre plates under specific stresses. Considering the effect of rifampicin challenge on attached growth, although survival percentage significantly decreased for three Mb strains upon antibiotic exposure, cell attachment was similar to control, which, considering the biofilm/survival ratio, suggests that rifampicin may enhance biofilm formation by MTC bacteria as a mean to cope with stress. When cells were grown under magnesium or iron starvation, slower growth patterns and final biomass yields were registered, while mycobacterial suspensions depicted macroscopically visible cord-like structures, suggesting that competition for oligoelements that are crucial for fundamental cellular activities stimulate cell aggregation and thus may stimulate biofilm coordinated responses. Transcriptional profiling of Rv2488c in the established stress conditions revealed differential transcriptional responses prone to variation among two M. bovis field strains and dependent on environmental cues, with pH 5.5 exerting 131-fold induction of Rv2488c. Growth under iron or magnesium starvation or upon rifampicin challenge did not affect Rv2488c expression. The construction by specialized transduction of a knock-out isogenic mutant to study Rv2488c role in mycobacteria physiology was also envisaged and advanced, but not fully completed in the scope of this work. Comparison of in vitro growth of wild-type and isogenic knock-out strains in batch assays and macrophage cell lines and, also in vivo using an animal model of infection, would enable unveiling the possible role of Rv2488c to bacilli survival inside the host, considering the mycobacteria-host axis. Altogether, findings from this work suggest that, in contrast with M. bovis, Rv2488c has accumulated several mutations in Mycobacterium tuberculosis contemporary strains, some of them damaging its regulatory domains and destroying its protein-coding potential, which suggest pseudogenization of this genomic region. However, in M. bovis, Rv2488c is transcribed and preliminary findings from our group suggest that its transcription may be articulated with global gene expression networks, suggesting that it may ensure a significant biological function to be disclosed in the future.O complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC) inclui várias espécies patogénicas, filogeneticamente próximas e com evolução clonal, que se adaptaram a nichos ecológicos e hospedeiros específicos. Neste grupo de bactérias, incluem-se M. tuberculosis, o principal agente etiológico da tuberculose humana (TB), e M. bovis, o agente da tuberculose bovina (bTB), sendo esta uma das mais importantes zoonoses a nível mundial. Permanecendo como uma das doenças infeciosas com maior impacto, tendo a Organização Mundial de Saúde estimado em 2013 que um terço da população humana estaria latentemente infetada, a tuberculose traduz-se num flagelo de saúde pública, com elevadas taxas anuais de incidência e de mortalidade, especialmente em indíviduos imunocomprometidos, nomeadamente co-infetados com o vírus da imunodeficiência adquirida (HIV), causando ainda elevados prejuízos monetários. Pensa-se que a patogenia das espécies do MTC é influenciada por numerosos fatores, tais como fatores genéticos do hospedeiro e do microrganismo, assim como por fatores ambientais. Durante a infeção, e focando apenas a tuberculose pulmonar, uma proporção de bacilos infetantes é capaz de sobreviver e multiplicar-se com sucesso na presença das condições de stresse encontradas no interior do macrófago alveolar. Os atuais modelos de persistência micobacteriana invocam a presença de populações de células dormentes que se reativam e disseminam após imunosupressão do hospedeiro. Os biofilmes são constituídos por células microbianas imersas numa matriz de exopolissacáridos que conferem proteção significativa aquando da fixação da comunidade a um ambiente desfavorável. Nestas microcomunidades distinguem-se subpopulações heterogéneas de bactérias que demonstram um caráter recalcitrante, como tolerância a xenobióticos e resistência aumentada a condições ambientais inóspitas. A comunicação intercelular (quorum sensing, QS) nestas condições, mediada por sinais químicos específicos, permite às populações bacterianas cooperar fisiologicamente e ajustar a expressão génica e os níveis metabólicos em consonância para melhor persistirem no ambiente. Do ponto de vista clínico, a formação de biofilmes está tipicamente associada a infeções crónicas, conduzindo a um aumento da resistência microbiana a antibióticos e protegendo o agente patogénico da resposta imunitária do hospedeiro, pelo que a agregação das células nestas estruturas pode ser entendida como uma estratégia de sobrevivência, persistência e resistência a stresses ambientais subversivos. Devido à sua natureza hidrofóbica, as micobactérias tendem a formar estes agregados de células in vitro, sendo ainda desconhecido se adotam in vivo um fenótipo semelhante ao dos biofilmes, estando também por identificar os determinantes genéticos que promovem uma resposta de crescimento em biofilmes. A análise comparativa de genomas de micobactérias saprófitas e bactérias do MTC sugere que o gene Rv2488c seja um presumível regulador transcricional pertencente à família LuxR, a qual inclui genes que codificam proteínas envolvidas em fenómenos de regulação da expressão genética mediados por quorum sensing. A análise, por pesquisa de homologia nas bases de dados, dos domínios funcionais subjacentes a esta sequência de DNA codificante sugere ainda a presença de uma região associada à atividade de adenilato ciclase, pelo que se presume que a proteína resultante exercerá atividade regulatória da expressão génica de forma específica em resposta a diferentes estímulos ambientais. Este trabalho teve como objetivo identificar as condições ambientais que favorecem a formação de biofilmes por bactérias do complexo M. tuberculosis e explorar a microdiversidade do gene Rv2488c nas estirpes circulantes de M. tuberculosis e M. bovis, avaliando-se ainda a sua expressão em condições semelhantes às presentes no hospedeiro e/ou que propiciam o estabelecimento e maturação de biofilmes. A análise bioinformática dos polimorfismos do gene Rv2488c em 81 estirpes do complexo M. tuberculosis cujos genomas se encontram disponíveis nas bases de dados internacionais demonstrou que a sequência desta região codificante apresenta elevado grau de conservação entre as estirpes de M. bovis, enquanto que nas estirpes de M. tuberculosis contemporâneas e atualmente em circulação existe grande variação nucleotídica, com acumulação de polimorfismos de nucleótido único (SNPs), inserções e eliminações em regiões específicas. A acumulação de variações nucleotídicas regista particular incidência nos domínios de ligação ao DNA e de adenilato ciclase, o que, à primeira vista, sugere pressão evolutiva nestes domínios, eventualmente para refinar a resposta a diferentes estímulos ambientais, permitindo uma expressão genética mais controlada e específica. A modelação da estrutura tridimensional das proteinas resultantes visou avaliar as presumíveis consequências estruturais e funcionais decorrentes da acumulação dos polimorfismos identificados, verificando-se que as alterações mais frequentes provocam um rearranjo tridimensional distinto, com alteração espacial e posição distal dos domínios de ciclase e LuxR, o que sugere consequências funcionais na atividade da proteína, nomeadamente na sua capacidade de interação com ligandos específicos. Foram também detetadas alterações das sequências nucleotídicas de Rv2488c em estirpes clínicas de M. tuberculosis que levam à disrupção da grelha de leitura e interrupção precoce da tradução da proteina codificada, afetando drasticamente, e eventualmente inativando, a sua potencial função. A partir dos genomas disponíveis nas bases de dados de M. bovis e M. tuberculosis foram construídos cladogramas para avaliação da microevolução de Rv2488c, procedendo-se à sua análise filogenética. Os resultados obtidos sugerem diferentes padrões microevolutivos deste gene nos dois ecotipos do MTC que possivelmente refletem a adaptação específica dos dois agentes etiológicos aos respetivos hospedeiros. Realizou-se o crescimento em descontínuo de M. bovis BCG Tokyo, M. smegmatis mc2 155 e duas estirpes de campo de M. bovis (I e II) em meio Middlebrook 7H9 modificado com o objetivo de caraterizar a resposta fisiológica e transcricional destas estirpes in vitro a condições ambientais que mimetizam o microambiente do hospedeiro e a maturação do fagossoma, tais como stress ácido, a presença de intermediários reativos de oxigénio, acetato como fonte de carbono, concentrações tóxicas de rifampicina e concentrações residuais de magnésio e ferro. Para determinar e comparar a resposta fisiológica das várias estirpes após exposição às condições impostas, foram determinadas taxas específicas de crescimento, número de células viáveis, percentagens de sobrevivência e densidades ópticas a 590 nm das frações celulares aderidas a superfícies e coradas com violeta de cristal. A exposição a choque ácido (pH 5.5) usando piruvato de sódio como fonte de carbono afetou o crescimento de M. bovis, induzindo a desaceleração do metabolismo (taxa específica de crescimento reduzida em duas vezes) e afetando severamente a biomassa final em suspensão, com a redução da contagem de células viáveis em cinco ordens de magnitude e uma percentagem de sobrevivência de 0.00127%, comparando com o controlo. O crescimento de M. bovis na presença de 25 μg/ml de rifampicina levou a um decréscimo da percentagem de sobrevivência de 50%, apesar do efeito observado na taxa de crescimento ter sido menos pronunciado em comparação com o induzido pelo choque ácido. As culturas de micobactérias formaram películas reticuladas na interface entre o meio de cultura-ar e as células fixaram-se na periferia dos poços das microplacas sob stresses específicos. Considerando o efeito da rifampicina na adesão das células aos poços das microplacas, apesar da percentagem de sobrevivência após exposição ao antibiótico ter decrescido significativamente para três estirpes de M. bovis, a fração celular aderida foi similar à do controlo, o que, considerando o rácio entre biofilme/sobrevivência, sugere que a rifampicina poderá aumentar a formação de biofilmes por bactérias do MTC como mecanismo para lidar com o stress imposto. Quando as células foram expostas a concentrações residuais de magnésio ou ferro, registaram-se padrões de crescimento e rendimentos de biomassa final formada mais baixos, no entanto visualizaram-se estruturas macroscópicas semelhantes a corda em suspensão, sugerindo que a competição por nutrientes minerais essenciais a atividades celulares fundamentais estimula a agregação celular e possivelmente uma resposta coordenada através da formação de biofilmes. O perfil transcricional do gene Rv2488c em duas estirpes de campo de M. bovis nas condições de stress estabelecidas apresentou diferenças, sugerindo diferentes respostas transcricionais aos estímulos ambientais, com o stress ácido (pH 5.5) a exercer uma indução do gene alvo em 131 vezes numa das estirpes. O crescimento com concentrações residuais de nutrientes minerais ou após exposição a rifampicina não afetou a expressão do gene Rv2488c em qualquer das estirpes estudadas. A construção por transdução especializada de um mutante de eliminação para estudar o papel do gene Rv2488c na fisiologia micobacteriana foi delineada e avançada, embora não inteiramente concluida no âmbito do presente trabalho. A comparação do crescimento da estirpe selvagem e do mutante isogénico em descontínuo, em linhas celulares de macrófagos ou num modelo animal de infeção poderia permitir desvendar o possível papel do gene para a sobrevivência do bacilo no interior do hospedeiro, considerando o eixo micobactéria-hospedeiro. Em suma, os resultados deste trabalho sugerem que, em contraste com M. bovis, o gene Rv2488c tem acumulado várias mutações em estirpes clínicas atuais de Mycobacterium tuberculosis, algumas danificando os seus domínios regulatórios e destruindo o seu potencial de codificação de uma proteína funcional, o que sugere pseudogenização desta região genómica. No entanto, em M. bovis, o gene Rv2488c é transcrito e resultados preliminares do nosso grupo sugerem que a sua transcrição pode ser articulada com redes globais de expressão génica, sugerindo que este gene poderá assegurar uma função biológica importante a ser desvendada no futuro

Papel da Glicoproteína G do vírus da Raiva na Indução de Apoptose

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019A Raiva é uma zoonose causada por um vírus neurotrópico pertencente ao género Lyssavirus, família Rhabdoviridae, ordem Mononegavirales. Este vírus infecta todas as espécies de animais de sangue quente. Este trabalho teve como principal objectivo avaliar a influência da glicoproteína G do vírus da raiva na replicação em células de neuroblastoma murino Neuro2a cultivadas in vitro, assim como na indução da apoptose. Foram comparados dois genótipos distintos, genótipo 1 (CVS-11, estirpe fixa, atenuada in vitro por passagens seriadas em culturas celulares BHK-21, e CVS-27, estirpe fixa, atenuada in vivo por passagens seriadas em cérebro de ratinho lactante) e genótipo 5 (EBLV-1, estirpe selvagem de quirópteros isolada em células de neuroblastoma). A cinética de replicação dos vírus em estudo foi avaliada por transcrição reversa seguida de PCR quantitativo (RTqPCR), e expressão das proteínas N (precoce) e G (tardia) por imunofluorescência. A apoptose foi avaliada através da visualização em gel das alterações do DNA celular sujeito a electroforese. Foram encontradas diferenças significativas na expressão das proteínas N e G, quer entre as duas estirpes fixas estudadas, quer entre as estirpes fixas e a estirpe isolada a partir de morcegos. A expressão de proteína N mostrou-se mais precoce em CVS-27 que em CVS-11, sugerindo que o ciclo replicativo da primeira estirpe seja mais curto que o da última. A expressão de G foi observada mais tardiamente, estando em conformidade com o facto de que a sua expressão só ocorre no final do ciclo replicativo. A expressão das proteínas N e G de EBLV-1 foi observada apenas às 24 h p.i., com fraca intensidade de fluorescência e com um número mais reduzido de células infectadas, o que evidencia uma evolução de infecção mais lenta e gradual desta estirpe na linha celular utilizada neste trabalho quando comparada com as estirpes fixas. No seu todo, estes resultados sugerem que a duração do ciclo replicativo depende da susceptibilidade e permissibilidade do sistema celular à infecção pelas diferentes estirpes de vírus da raiva. Os ensaios de apoptose induzida pela infecção destes Lyssavírus, embora preliminares, sugerem que a estirpe EBLV-1 seja a mais apoptótica das estirpes estudadas.Rabies is a zoonosis caused by a neurotropic virus belonging to the genus Lyssavirus, family Rhabdoviridae, order Mononegavirales. This virus infects all species of warmblooded animals. This study aimed to evaluate the influence of rabies virus glycoprotein G on the viral replication in in vitro cultured murine neuroblastoma cells, as well as on the induction of apoptosis. Two distinct genotypes were compared, genotype 1 (CVS-11, fixed strain, attenuated by serial passages in BHK-21 cell cultures, and CVS-27, fixed strain, attenuated in vivo by serial passages in lactating mouse brain) and genotype 5 (EBLV-1, wild chiropteran strain isolated on neuroblastoma cells). The replication kinetics of the studied viruses were evaluated by reverse transcription followed by quantitative PCR (RT-qPCR), and expression of N (early) and G (late) proteins by immunofluorescence. Apoptosis was assessed by gel visualization of cell DNA changes. Significant differences were found in the expression of N and G proteins, both between the two fixed strains studied and between the fixed strains and the strain isolated from bats. Protein N expression was earlier in CVS-27 than in CVS-11, suggesting that the replicative cycle of the first strain is shorter than the last. G expression was observed later, in line with the fact that its expression only occurs at the end of the replicative cycle. The expression of EBLV-1 N and G proteins was observed only at 24 h pi, with low fluorescence intensity and with a smaller number of infected cells, which shows a slower and more gradual evolution of this strain in the cell line used in this work when compared to fixed strains. Overall, these results suggest that the duration of the replicative cycle depends on the susceptibility and permissibility of the cellular system to infection by different strains of rabies virus. Apoptosis assays induced by infection of these Lyssaviruses, although preliminary, suggest that the EBLV-1 strain is the most apoptotic of the studied strains

Predictors of acute kidney injury associated with cardiopulmonary bypass

To study the incidence of acute kidney injury (AKI) in the postoperative period of cardiac surgery in patients without preoperative renal insufficiency who underwent cardiac surgery with cardiopulmonary bypass (CPB), and to explore the association between the incidence of AKI and predictors related to CPB. Observational, cross-sectional study. Participants were divided in two groups, those who developed AKI in the postoperative period and those who did not develop AKI. Kidney Disease: Improving Global Outcomes - Clinical Practice Guideline for Acute Kidney Injury (KDIGO) classification was used to characterize AKI. The analysis included preoperative variables (anthropometric data, cardiovascular risk factors and blood parameters), as well as the type of surgery, intraoperative variables related to CPB, and postoperative creatinine variation. Association between variables was studied with binary logistic regression. We have included 329 patients, of which 62 (19%), developed AKI. There were statistically significant differences between the groups in age (p<0.001; OR (95%)-1.075 (1.037-1.114)), duration of CPB (p=0.011; 1.008 (1.002-1.014)), urine output during CPB (p=0.038; 0.998 (0.996-0.999)), mannitol and furosemide administration during CPB, (respectively, p=0.032; 2.293 (1.075-4.890) and p=0.013; 2.535 (1.214-5.296)). A significant number of patients developed AKI in the postoperative period of cardiac surgery and this incidence was influenced by factors related to CPB, namely: age, duration of CPB, urine output during CPB, mannitol and furosemide administration during CPB.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Incidence of atrial fibrillation after cardiac surgery: Influence of the type of surgery, cardiopulmonary bypass and preoperative and perioperative predictive factors

A fibrilação auricular (FA) é a arritmia com maior incidência no pós-operatório da cirurgia cardíaca. Na cirurgia de substituição valvular (CSV) ela ocorre em cerca de 64% dos indivíduos e na cirurgia de revascularização do miocárdio (CRM) ela pode desencadear-se em 30-40% dos indivíduos. A sua incidência no pós-operatório pode ainda ser influenciada por fatores de risco pré e intraoperatórios. Estudar a incidência de FA após cirurgia cardíaca, a sua associação com o tipo de cirurgia, com a realização de circulação extracorporal (CEC), e com fatores de risco/preditores pré e intraoperatórios. Métodos: Estudo observacional retrospetivo longitudinal realizado com os indivíduos submetidos a CRM e CSV em 2014, num hospital central da região norte. Foi avaliado o ritmo cardíaco em quatro momentos do pós-operatório (saída de CEC, Unidade de Cuidados Intensivos (UCI)/internamento, pré-alta e follow-up). Foi explorada a associação entre este ritmo e fatores de risco/preditores pré-operatórios (dimensão das aurículas, cardiomegalia, hipertrofia ventricular esquerda (HVE)) e intraoperatórios (tipo de cirurgia, realização de CEC, duração da CEC, tempo de clampagem aórtica e administração de cardioplegia), através do Odds ratio (OR). Foram estudados 416 indivíduos, 73.6% do sexo masculino, idade média 66.8±10.5 anos. Nas CSV ocorreu incidência de FA nos quatro momentos de avaliação, e na CRM apenas na UCI/internamento e na pré-alta. Em todos os tipos de cirurgia essa incidência foi mais elevada na UCI/internamento, variando entre 3.7% na CRM com CEC e 71.4% na CSV mitral. Os fatores preditores pré-operatórios com OR>1 foram idade superior a 65 anos (2.51 saída de CEC, 10.62 pré-alta), dilatação da aurícula direita (AD) (1.08 follow-up, 3.41 pré-alta), e HVE (1.68 saída de CEC, 2.78 pré-alta). Relativamente aos fatores preditores intraoperatórios, a CEC (2.74 CI/internamento, 3.37 pré-alta) e a cardioplegia (2.93 UCI/internamento, 5.40 pré--alta) foram os que apresentaram OR>1, no pós-operatório. As CSV foram o tipo de cirurgia com maior incidência de FA. Na CRM esta incidência foi superior nas cirurgias sem CEC. A idade superior a 65 anos, a dilatação da AD e a HVE foram os fatores preditores pré-operatórios com associação positiva à incidência de FA, em todos os momentos de avaliação.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Show your beaks and we tell you what you eat: Different ecology in sympatric Antarctic benthic octopods under a climate change context

Sympatry can lead to higher competition under climate change and other environmental pressures, including in South Georgia, Antarctica, where the two most common octopod species, Adelieledone polymorpha and Pareledone turqueti, occur side by side. Since cephalopods are typically elusive animals, the ecology of both species is poorly known. As beaks of cephalopods are recurrently found in top predator's stomachs, we studied the feeding ecology of both octopods through the evaluation of niche overlapping and specific beak adaptations that both species present. A multidisciplinary approach combining carbon (δ13C) and nitrogen (δ15N) stable isotope signatures, mercury (Hg) analysis and biomaterials' engineering techniques was applied to investigate the beaks. An isotopic niche overlap of 95.6% was recorded for the juvenile stages of both octopod species, dropping to 19.2% for the adult stages. Both A. polymorpha and P. turqueti inhabit benthic ecosystems around South Georgia throughout their lifecycles (δ13C: −19.21 ± 1.87‰, mean ± SD for both species) but explore trophic niches partially different during adult life stages (δ15N: 7.01 ± 0.40‰, in A. polymorpha, and 7.84 ± 0.65‰, in P. turqueti). The beaks of A. polymorpha are less dense and significantly less stiff than in P. turqueti. Beaks showed lower mercury concentration relative to muscle (A. polymorpha - beaks: 0.052 ± 0.009  μg g−1, muscle: 0.322 ± 0.088  μg g−1; P. turqueti - beaks: 0.038 ± 0.009  μg g−1; muscle: 0.434 ± 0.128  μg g−1). Overall, both octopods exhibit similar habitats but different trophic niches, related to morphology/function of beaks. The high Hg concentrations in both octopods can have negative consequences on their top predators and may increase under the present climate change context.British Antarctic Survey for assisting in the collection of the specimens for this work. Many thanks to 3B's Research Group (University of Minho) and MAREFOZ who were responsible for analysing the physical properties of beaks and stable isotope signatures. A special thank you to our colleague José Queirós from MARE-UC (Coimbra, Portugal) for his suggestions and guidance. A debt of gratitude is also owed to Dr. A. Louise Allcock (NUI Galway) for her useful guidelines. This work is an international effort under the Scientific Committee on Antarctic Research (SCAR) associated programs, expert and action groups, namely SCAR AnT-ERA, SCAR EGBAMM and ICED. J.C. Xavier was supported by the Investigator Programme (IF/00616/2013) of the Foundation for Science and Technology (FCT-Portugal) and PROPOLAR, and F.R. Ceia was supported by a postdoctoral fellowship (SFRH/BPD/95372/2013) attributed by FCT-Portugal and the European Social Fund (POPH, EU). This study benefited from the strategic program of MARE, financed by FCT-Portugal (MARE- UID/MAR/04292/2019). We also acknowledge FCT-Portugal through a PhD grant to J. Seco (SRFH/PD/BD/113487

Regulated activity of a bacterial transenvelope machinery : the LPS Transport System

Les bactéries présentent plusieurs mécanismes qui leur confèrent la capacité de faire face à des situations difficiles.Dans un contexte global de résistance aux antibiotiques, les bactéries à Gram négatif présentent des mécanismes de résistance intrinsèque. L'enveloppe multicouche complexe et dynamique, enrobée de lipopolysaccharides (LPS), confère à ces bactéries une capacité de survie accrue. La biosynthèse de ces glycolipides est initiée dans le cytoplasme et son transport se déroule depuis la membrane interne jusqu'à la membrane externe, avec une voie de biosynthèse/transport dédiée.La machinerie de transport des lipopolysaccharides (Lpt) comprend sept protéines fondamentales (LptA à LptG) qui couvrent toute l'enveloppe. Au niveau de la membrane interne, le transporteur LptB2FG couple l'hydrolyse de l'ATP avec l'extraction du LPS. LptB2 est directement en charge de l’hydrolyse de l’ATP tandis que LptF/G interagit avec le LPS et le transporte vers LptC/LptA dans le périplasme.Cette machinerie utilise une architecture conservée avec des domaines de jellyroll dédiés présents sur LptF/G/C/A qui s'assemblent en un pont permettant au LPS de s'écouler vers la membrane externe.Les molécules qui seraient capables de perturber les interactions entre protéines et les différents domaines jellyroll du système, pourraient devenir de puissants inhibiteurs de la construction de la paroi cellulaire. La thanatine, un peptide antimicrobien naturel, a été décrite comme ciblant les domaines jellyroll de la machinerie. Nous avons examiné son effet dans la perturbation du complexe LptC/A. La thanatine se lie pas à LptC mais uniquement à LptA et inhibe l'assemblage du complexe à faible concentration (de l’ordre du nao molaire), démontrant ainsi le potentiel des interactions entre les jellyrolls du système LptC.Le réseau d'interactions entre LptB2FG et LptC/A n'est pas entièrement compris. Le LptB2FG a été produit dans des micelles de détergents et dans des particules de type nanodisque, pour sonder les interactions avec LptC et LptA à l'échelle atomique, à l'aide de diverses techniques biophysiques.Dans l'assemblage du pont LptB2FGCA, LptC/F interagissent principalement à travers les domaines jellyroll. Une mutation dans le résidu R212 de LptF a rendu la présence de la protéine LptC facultative in vivo.La caractérisation biophysique/biochimique a montré une interaction inchangée du mutant LptB2FG avec LptC et LptA, tandis que l'activité ATPase a montré un manque de régulation par la présence de ses partenaires. Cela nous a conduit à proposer que R212 soit un point de contrôle dans LptF pour que LptB2FG détecte le bon assemblage de la machinerie.Lorsque le complexe LptB2FGCA est assemblé in vitro, LptB2 s'est avérée capable de catalyser le phosphotransfert entre deux molécules d'ADP, générant de l'ATP et de l'AMP, et représentant une nouvelle activité (Adenylate Kinase) jusqu'alors non décrite pour cette protéine. Étant un sujet très récent dans la littérature, le rôle des transporteurs à double fonction n'est pas encore bien compris. Pour caractériser l'équilibre entre ATPase et Adenylate Kinase, nous avons muté LptB2 sur des motifs ABC clés pour sonder l'emplacement de l'activité Adenylate Kinase. L’étude du complexe LptB2FG préparé dans des particules de nanodisques, suggère que l'équilibre entre les activités dépend de l'assemblage dynamique de LptB2FGCA. La caractérisation structurale de LptB2 dans sa forme apo et lié aux nucléotides a été initiée.Ce projet, axé sur le système Lpt essentiel pour la survie bactérienne, met en lumière l'importance des interactions protéine-protéine comme cibles pour la conception de futurs composés antimicrobiens. L’intérêt de cibler des transporteurs à double fonction, à la fois impliqués dans la synthèse de la paroi cellulaire et l'exportation de médicaments, pourrait aussi représenter une piste prometteuse pour la recherche future de nouvelles drogues.Bacteria display several intrinsic mechanisms which confers them the ability to cope with disadvantageous situations, such as nutrient deprivation, environmental inter/intra-species competition, managing adaptation to detrimental conditions, and handling effects of antibacterial compounds.In a global context of antibiotic resistance accelerated by anthropogenic activities, gram negative bacteria display intrinsic resistance mechanisms. The complex and dynamic multilayered envelope, coated with lipopolysaccharides (LPS), confers these bacteria increased survivability. Biosynthesis of these complex glycolipids is initiated in the cytoplasm, and its transport proceeds along the inner membrane, periplasm, until reaching the outer membrane, with a dedicated biosynthetic pathway and transport machinery.The Lipopolysaccharide Transport (Lpt) machinery comprises 7 fundamental proteins (LptA to LptG) that span the entire envelope. More specifically, at the inner membrane, LptB2FG ABC transporter couples ATP hydrolysis with LPS extraction. LptB2 cycles ATP while LptF/G interact with LPS and carry it towards LptC and LptA in the periplasm.This machinery uses a conserved architecture with dedicated jellyroll domains present on LptF, LptG, LptC and LptA that assemble into a bridge that allow LPS flow to the outer membrane.Molecules that would disrupt protein-protein interactions between the different jellyroll domains of the Lpt system could become potent cell wall inhibitors. Thanatin, a natural occurring antimicrobial peptide, has been described as targeting the jellyroll domains of the machinery. We screened its effect in the disruption of LptC-LptA complex. Thanatin binds to LptA but not LptC and inhibits the assembly of the complex at low nM concentrations, showing the potential of targeting Lpt Jellyroll-jellyroll interactions.The network of interactions between the Inner membrane complex, LptB2FG and periplasmic LptC and LptA is not fully understood. LptB2FG was produced in detergent micelles and within nanodisc particles, to probe interactions with LptC and LptA at an atomic scale, using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and biophysical techniques.In the assembly of the LptB2FGCA bridge, LptC and LptF interact mostly through the jellyroll domains. A mutation in the LptF jellyroll (R212 residue) rendered LptC presence facultative in vivo.Biophysical and biochemical characterization showed unaltered interaction of mutant LptB2FG with LptC and LptA, whereas ATPase activity showed lack of regulation by presence of its partners. This led us to propose that R212 is a checkpoint in the LptF jellyroll, acting as a hub for LptB2FG to sense proper assembly of the machinery.When LptB2FGCA complex is assembled in vitro, LptB2 was found capable of catalyzing phosphotransfer between ADP molecules, generating ATP and AMP, a novel activity (Adenylate Kinase) previously undescribed for this protein. Being a topic of very recent interest in the literature, the role of dual-function transporters is not understood. To characterize the balance between ATPase and AK, we mutated LptB2 on key ABC motifs to probe possible location for AK activity. LptB2FG studied in nanodisc particles, suggests that balance between activities depends on the dynamic assembly of LptB2FGCA, with regulatory mechanisms possibly not being shared between both activities. Structural characterization of LptB2 in apo and nucleotide bound-state was initiated .This project, focused on the essential Lpt system, sheds light on the importance of protein-protein interactions as targets for designing future antimicrobial compounds. It could also be worth evaluating if dual-function transporters, involved in cell wall synthesis and drug export, are valid targets for future drug screenings

Activité régulée d'une machinerie de transenveloppe bactérienne : le système de transport du LPS

Bacteria display several intrinsic mechanisms which confers them the ability to cope with disadvantageous situations, such as nutrient deprivation, environmental inter/intra-species competition, managing adaptation to detrimental conditions, and handling effects of antibacterial compounds.In a global context of antibiotic resistance accelerated by anthropogenic activities, gram negative bacteria display intrinsic resistance mechanisms. The complex and dynamic multilayered envelope, coated with lipopolysaccharides (LPS), confers these bacteria increased survivability. Biosynthesis of these complex glycolipids is initiated in the cytoplasm, and its transport proceeds along the inner membrane, periplasm, until reaching the outer membrane, with a dedicated biosynthetic pathway and transport machinery.The Lipopolysaccharide Transport (Lpt) machinery comprises 7 fundamental proteins (LptA to LptG) that span the entire envelope. More specifically, at the inner membrane, LptB2FG ABC transporter couples ATP hydrolysis with LPS extraction. LptB2 cycles ATP while LptF/G interact with LPS and carry it towards LptC and LptA in the periplasm.This machinery uses a conserved architecture with dedicated jellyroll domains present on LptF, LptG, LptC and LptA that assemble into a bridge that allow LPS flow to the outer membrane.Molecules that would disrupt protein-protein interactions between the different jellyroll domains of the Lpt system could become potent cell wall inhibitors. Thanatin, a natural occurring antimicrobial peptide, has been described as targeting the jellyroll domains of the machinery. We screened its effect in the disruption of LptC-LptA complex. Thanatin binds to LptA but not LptC and inhibits the assembly of the complex at low nM concentrations, showing the potential of targeting Lpt Jellyroll-jellyroll interactions.The network of interactions between the Inner membrane complex, LptB2FG and periplasmic LptC and LptA is not fully understood. LptB2FG was produced in detergent micelles and within nanodisc particles, to probe interactions with LptC and LptA at an atomic scale, using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and biophysical techniques.In the assembly of the LptB2FGCA bridge, LptC and LptF interact mostly through the jellyroll domains. A mutation in the LptF jellyroll (R212 residue) rendered LptC presence facultative in vivo.Biophysical and biochemical characterization showed unaltered interaction of mutant LptB2FG with LptC and LptA, whereas ATPase activity showed lack of regulation by presence of its partners. This led us to propose that R212 is a checkpoint in the LptF jellyroll, acting as a hub for LptB2FG to sense proper assembly of the machinery.When LptB2FGCA complex is assembled in vitro, LptB2 was found capable of catalyzing phosphotransfer between ADP molecules, generating ATP and AMP, a novel activity (Adenylate Kinase) previously undescribed for this protein. Being a topic of very recent interest in the literature, the role of dual-function transporters is not understood. To characterize the balance between ATPase and AK, we mutated LptB2 on key ABC motifs to probe possible location for AK activity. LptB2FG studied in nanodisc particles, suggests that balance between activities depends on the dynamic assembly of LptB2FGCA, with regulatory mechanisms possibly not being shared between both activities. Structural characterization of LptB2 in apo and nucleotide bound-state was initiated .This project, focused on the essential Lpt system, sheds light on the importance of protein-protein interactions as targets for designing future antimicrobial compounds. It could also be worth evaluating if dual-function transporters, involved in cell wall synthesis and drug export, are valid targets for future drug screenings.Les bactéries présentent plusieurs mécanismes qui leur confèrent la capacité de faire face à des situations difficiles.Dans un contexte global de résistance aux antibiotiques, les bactéries à Gram négatif présentent des mécanismes de résistance intrinsèque. L'enveloppe multicouche complexe et dynamique, enrobée de lipopolysaccharides (LPS), confère à ces bactéries une capacité de survie accrue. La biosynthèse de ces glycolipides est initiée dans le cytoplasme et son transport se déroule depuis la membrane interne jusqu'à la membrane externe, avec une voie de biosynthèse/transport dédiée.La machinerie de transport des lipopolysaccharides (Lpt) comprend sept protéines fondamentales (LptA à LptG) qui couvrent toute l'enveloppe. Au niveau de la membrane interne, le transporteur LptB2FG couple l'hydrolyse de l'ATP avec l'extraction du LPS. LptB2 est directement en charge de l’hydrolyse de l’ATP tandis que LptF/G interagit avec le LPS et le transporte vers LptC/LptA dans le périplasme.Cette machinerie utilise une architecture conservée avec des domaines de jellyroll dédiés présents sur LptF/G/C/A qui s'assemblent en un pont permettant au LPS de s'écouler vers la membrane externe.Les molécules qui seraient capables de perturber les interactions entre protéines et les différents domaines jellyroll du système, pourraient devenir de puissants inhibiteurs de la construction de la paroi cellulaire. La thanatine, un peptide antimicrobien naturel, a été décrite comme ciblant les domaines jellyroll de la machinerie. Nous avons examiné son effet dans la perturbation du complexe LptC/A. La thanatine se lie pas à LptC mais uniquement à LptA et inhibe l'assemblage du complexe à faible concentration (de l’ordre du nao molaire), démontrant ainsi le potentiel des interactions entre les jellyrolls du système LptC.Le réseau d'interactions entre LptB2FG et LptC/A n'est pas entièrement compris. Le LptB2FG a été produit dans des micelles de détergents et dans des particules de type nanodisque, pour sonder les interactions avec LptC et LptA à l'échelle atomique, à l'aide de diverses techniques biophysiques.Dans l'assemblage du pont LptB2FGCA, LptC/F interagissent principalement à travers les domaines jellyroll. Une mutation dans le résidu R212 de LptF a rendu la présence de la protéine LptC facultative in vivo.La caractérisation biophysique/biochimique a montré une interaction inchangée du mutant LptB2FG avec LptC et LptA, tandis que l'activité ATPase a montré un manque de régulation par la présence de ses partenaires. Cela nous a conduit à proposer que R212 soit un point de contrôle dans LptF pour que LptB2FG détecte le bon assemblage de la machinerie.Lorsque le complexe LptB2FGCA est assemblé in vitro, LptB2 s'est avérée capable de catalyser le phosphotransfert entre deux molécules d'ADP, générant de l'ATP et de l'AMP, et représentant une nouvelle activité (Adenylate Kinase) jusqu'alors non décrite pour cette protéine. Étant un sujet très récent dans la littérature, le rôle des transporteurs à double fonction n'est pas encore bien compris. Pour caractériser l'équilibre entre ATPase et Adenylate Kinase, nous avons muté LptB2 sur des motifs ABC clés pour sonder l'emplacement de l'activité Adenylate Kinase. L’étude du complexe LptB2FG préparé dans des particules de nanodisques, suggère que l'équilibre entre les activités dépend de l'assemblage dynamique de LptB2FGCA. La caractérisation structurale de LptB2 dans sa forme apo et lié aux nucléotides a été initiée.Ce projet, axé sur le système Lpt essentiel pour la survie bactérienne, met en lumière l'importance des interactions protéine-protéine comme cibles pour la conception de futurs composés antimicrobiens. L’intérêt de cibler des transporteurs à double fonction, à la fois impliqués dans la synthèse de la paroi cellulaire et l'exportation de médicaments, pourrait aussi représenter une piste prometteuse pour la recherche future de nouvelles drogues

Avaliação do músculo digástrico na administração experimental de Sinvastatina

Trabalho final do 5º ano com vista à atribuição do grau de mestre no âmbito do ciclo de estudos de Mestrado Integrado em Medicina Dentária apresentado à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra.A sinvastatina é um fármaco utilizado no tratamento das deslipidémias, com benefícios na melhoria da mortalidade e mortalidade cardiovascular. Estão documentados casos de rabdomiólise associados à utilização de fármacos da família das estatinas. O músculo digástrico tem um importante papel na cinética mandibular e no equilíbrio do aparelho estomatognático, fundamental para a sua boa função. A contracção deste músculo provoca a abertura mandibular e a elevação do osso hióide. A rabdomiólise define-se como a lesão do músculo esquelético provocada por factores físicos, químicos ou biológicos, que pode, potencialmente afectar os músculos mastigadores. Esta destruição das fibras musculares conduz à libertação de produtos das celulares na corrente sanguínea. A mioglobina, uma proteína libertada durante este processo, é lesiva para os rins, podendo causar um quadro agudo de insuficiência renal. O objectivo do presente trabalho é avaliar o efeito da sinvastatina sobre o músculo digástrico. Neste estudo foram utilizados dez ratos da estirpe Wistar com dois meses de idade no início do ensaio. Os animais foram distribuídos aleatoriamente por dois grupos com igual número de elementos: o grupo controlo (Grupo CTRL 1) e o grupo teste (Grupo TST 2), cada um dos quais com cinco animais. Os animais do grupo teste foram submetidos à administração diária de 5mg/kg de sinvastatina em solução aquosa, por gavagem. Todos os animais do estudo foram mantidos nas condições padrão, com livre acesso a água e comida, e foram sacrificados ao fim de quatro semanas de ensaio. Todos os fragmentos colhidos durante a necrópsia foram fixados em solução de formaldeído neutro tamponado a 10%. Foram colhidos fragmentos de músculo digástrico para fixação em álcool etílico a 70%. A análise morfométrica foi realizada com o auxílio do programa Image J, em fotografias de lâminas de músculo digástrico coradas com Hematoxilina e Eosina, em corte transversal. Não foram observados quaisquer sinais morfológicos, à observação histológica, que indicassem a presença de focos de rabdomiólise, no músculo observado, para a dose de sinvastatina utilizada. Para um intervalo de confiança a 95%, observa-se que a área média das fibras musculares em corte transversal varia entre 2106 px e 2139 px, no grupo controlo; e 2188 e 2252 px no grupo teste. Não se observaram quaisquer sinais de lesão morfológica do músculo digástrico, em animais expostos à dose de 5mg/kg de sinvastatina. A análise morfométrica deste músculo revelou não existirem diferenças estatisticamente significativas na área das fibras musculares em corte transversal