A functional motor unit in the culture dish : co-culture of spinal cord explants and muscle cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing(1). These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures. Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas(2). To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium. The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context. Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscu diseases(3), and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context

Untersuchungen zur Todeskontrolle von Schlachtschweinen nach Elektrobetäubung - Einsatz eines automatisierten Heißwasser-Reiz-Verfahrens und Bewertung von Spontanbewegungen auf der Nachentblutestrecke

Moderne Schlachtsysteme tragen ein Risiko lebende Tiere weiterzuverarbeiten (SCHÜTTE und BOSTELMANN 2001, TROEGER 2005 und TROEGER und MEILER 2006). Gründe für dieses ernst zu nehmende tierschutzrelevante Problem sind eine ineffiziente Betäubung und/oder der Mangel an einer ausreichenden und schnellen Entblutung der Schweine. Die europäische Kommission hat 2009 die Verordnung (EG) Nr. 1099/2009 über den Schutz von Tieren zum Zeitpunkt der Tötung implementiert (ANON. 2009). Die Studie schafft Grundlagen um eine automatisierte Methode zu entwickeln, welche die Abwesenheit von Lebenszeichen von Schlachtschweinen verifiziert. Die Hypothese hierbei ist die Annahme, dass Schweine, die auf einen schmerzhaften Reiz wie heißes Wasser mehrere Minuten nach der Entblutung reagieren mit dem Risiko eines zumindest teilweise funktionierenden Gehirns behaftet sind. Die Studie fand an drei kommerziellen Schlachthöfen in Deutschland statt, die verschiedene elektrische Betäubungs- (Kopf-zu-Herz-Durchströmung) und Stechverfahren verwendeten. Insgesamt wurden am Schlachtband 5.301 Mastschweine im Hauptversuch untersucht und mittels Videokameras aufgezeichnet. Um die Abwesenheit von Lebenszeichen am Ende der Nachentblutestrecke, das heißt vier bis fünf Minuten nach Entblutestich, zu überprüfen wurde ein Heißwasser-Reiz mit 65 °C verwendet. Die Dauer der Reizapplikation betrug fünf bzw. 15 Sekunden. Eine automatisierte Reizapplikations-Anlage, erbaut von der Firma BANSS Schlacht- und Fördertechnik GmbH (Biedenkopf), induzierte den Stimulus vor allem im Bereich des Gesichts der Schweine. Als Referenz zu den Beobachtungen der Bewegungen während der Reiz-Applikation wurden Gehirnnerven-Reflexe (Corneal- und Lidschlussreflexe) und Reaktionen auf einen Kniff in die Nasenscheidewand klinisch untersucht. Schweine mit positiven Befunden wurden mittels Bolzenschuss nachbetäubt bzw. getötet. Die Sensitivität des Heißwasser-Tests lag bei 99 %. Eines von 75 Tieren wies positive Corneal- und Lidschlussreflexe auf, obwohl dieses Schwein auf den Heißwasser-Reiz nicht reagiert hatte. Jedoch konnten deutlich erkennbare Spontanbewegungen jenes Tieres bereits vorher beobachtet werden. Die Spezifität des Heißwasser-Tests lag bei 98 %. Beinah jedes Schwein mit negativen Gehirnnerven-Befunden blieb während der Reizapplikation unauffällig. 3,8 % (n = 199) der untersuchten Schweine zeigten eine Reaktion auf den Heißwasser-Reiz. Es war kein Unterschied zwischen dem fünf bzw. 15 Sekunden anhaltendem Reiz zu ermitteln. Neben einer ineffizienten Entblutung kann die reversible Betäubung als ein weiterer möglicher Grund für dieses Ergebnis genannt werden. Die Elektrische Betäubung ist reversibel, solange kein Herzkammerflimmern sicher ausgelöst wird (HOENDERKEN et al. 1980 und VOGEL et al. 2010). Es kann geschlussfolgert werden, dass die elektrische Kopf-zu-Herz-Durchströmung, die in den hier dargestellten Schlachtbetrieben verwendet wurde, nicht immer zum Herzkammerflimmern geführt hatte. Die Anzahl der Reaktionen der Schweine auf das heiße Wasser war begrenzt. 92 % der Schweine, die den Kopf während der Reizapplikation geschüttelt hatten und 78 % derer, die eine aufrichtende Bewegung gezeigt hatten, wiesen mindestens einen positiven Gehirnnerven-Befund auf. Auffälligkeiten in den Vordergliedmaßen korrelierten zu 59 % und das Muster “Maul öffnen” zu 52 % mit positiven Gehirnnerven-Befunden. Bewegungen aus dem Becken bzw. den Hintergliedmaße heraus waren nur zu 21 % mit positiven Gehirnnerven-Befunden verbunden. Bei der Betrachtung der Bewegungsmusterkombinationen stellte die Autorin fest, dass nahezu keine Reaktion missachtet werden sollte. Lediglich das Muster „ausschließliche Bewegungen Becken/Hintergliedmaße“ korrelierte in keinem der 59 Fälle mit positiven Gehirnnerven-Befunden. Dieses Ergebnis deckt sich mit den Aussagen von GRANDIN (2013) und den Mitarbeitern des bsi Schwarzenbek (ANON. 2013a), die darauf hinwiesen, dass der caudale Körperabschnitt elektrisch betäubter Schlachtschweine zur Einschätzung ihres möglicherweise vorhandenen Bewusstseins keine Relevanz besitzt. Während der Untersuchungen wurden außerdem Spontanbewegungen der Schlachtschweine zwischen dem Stechen und dem Heißwasser-Test analysiert. Jedes Tier, das eine Reaktion auf die Heißwasser-Reiz-Applikation zeigte und mindestens einen positiven Befund in der Gehirnnerven-Untersuchung aufwies, hatte vorher das Spontanbewegungsmuster „Maul öffnen“ durchgeführt. Um dem Überwachungs- und Schlachthofpersonal zu vermitteln, welche Spontan-bewegungsmuster bzw. reizinduzierten Reaktionen bei der Beobachtung der Nachentblutestrecke entscheidend sind, wurden entsprechende Arbeitsanweisungen entwickelt. Bereits vorhandene Literatur wurde hierbei mit eingearbeitet (ANIL 1991, ATKINSON et al. 2012 und EFSA 2013). Als eine wirksame Lösung um den sicheren Tod von Schweinen vor weiteren Schlachtarbeiten sicherzustellen, scheint es sinnvoll entsprechende Spontanbewegungen zu beachten und die Implementierung einer abschließenden Untersuchung mittels eines Heißwasser-Reiz-Tests am Ende der Nachentblutestrecke zu verwirklichen. Selbstverständlich sollten weiterhin die Betäubung und Entblutung der Tiere möglichst sicher kontrolliert werden. Für die Nachbetäubung bzw. Tötung der betroffenen Schweine wird der Einsatz eines Bolzenschussgerätes von der EFSA (2004), dem bsi Schwarzenbek und dem Max Rubner-Institut empfohlen.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Rechtlicher Hintergrund zum Todeseintritt von Schlachtschweinen 3 2.2 Philosophische Betrachtungen zum Töten von Tieren 3 2.3 Human- und Veterinärmedizinische Definitionen des Todeseintritts 4 2.4 Kontrolle des Todeseintritts beim Menschen 5 2.5 Kontrolle des Todeseintritts bei Schlachtschweinen 6 2.5.1 Anatomische, physiologische und neuronale Grundlagen 6 2.5.2 Allgemeine Pathophysiologie des Hirntodes 7 2.5.3 Neuronale Verschaltung und muskuläre Antwort auf Schmerzreize 8 2.5.4 Einsatz verschiedener Schmerzreize 10 2.5.5 Einfluss der Betäubungsverfahren auf die Todeskontrolle 11 2.5.6 Einfluss des Entbluteverfahrens auf die Todeskontrolle 13 2.5.7 Kriterien der klinischen Untersuchung zur Todeskontrolle 14 2.5.8 Stand der Technik automatisierter Verfahren zur Todeskontrolle von Schweinen 15 3 Tiere, Material, Methoden 17 3.1 Überblick 17 3.2 Schlachtbetriebe 18 3.3 Schweine 18 3.4 Einsatz eines automatisierten Reizverfahrens 19 3.4.1 Vorversuch: Reizung mittels Heißwasser, Kaltwasser und Strom 19 3.4.2 Hauptversuch: Reizung mittels Heißwasser 20 3.4.3 Entwicklung der automatisierten Wasserreizanlage 21 3.4.4 Versuchsablauf, Aufzeichnungs- und Auswertemethodik 25 3.4.5 Untersuchung der Gehirnnerven nach Reizapplikation 27 3.5 Spontanbewegungen auf der Nachentblutestrecke 28 3.6 Bewegungen beim Anschlingen 28 3.7 Elektrische Nachbetäubung auf der Nachentblutestrecke 28 3.8 Statistische Analysen 29 4 Ergebnisse 31 4.1 Vorversuch: Reizung mittels Heißwasser, Kaltwasser und Strom 31 4.2 Hauptversuch: Reizapplikation mittels Heißwasser 32 4.2.1 Vorkommen von Bewegung während der Heißwasser-Reizapplikation 33 4.2.2 Befunde der Gehirnnerven-Untersuchung 34 4.2.3 Gehirnnerven-Befunde der Schweinen in Korrelation mit Reaktionen auf den Heißwasser-Reiz 36 4.2.4 Erkennbarkeit der Bewegungen während der Heißwasser-Reizapplikation 37 4.2.5 Neugestaltung des Auswerteschemas der Bewegungsmuster während der Heißwasser-Reizapplikation 39 4.2.6 Vorkommen von Bewegungsmustern während der Heißwasser-Reizapplikation 40 4.2.7 Erkennbarkeit der Bewegungsmuster während der Heißwasser-Reizapplikation 42 4.2.8 Zusammenhang zwischen den Bewegungsmustern und den Gehirnnerven-Befunden 44 4.2.9 Häufigkeit der Bewegungsmuster während der Heißwasser-Reizapplikation 47 4.2.10 Vorkommen von Bewegungsmuster-Kombinationen während der Heißwasser-Reizapplikation 49 4.2.11 Zusammenhang zwischen Bewegungsmuster-Kombinationen und den Gehirnnerven-Befunden 53 4.2.12 Schweine mit steif veränderter Körperhaltung am Ende der Nachentblutestrecke 54 4.2.13 Abschließende Bewertung des Reizes „Heißwasser“ 55 4.3 Spontanbewegungen auf der Nachentblutestrecke 57 4.3.1 Vorkommen von Spontanbewegungen 57 4.3.2 Vorkommen von Spontanbewegungen im Zusammenhang mit den Reiz- und Gehirnnerven-Befunden 58 4.3.3 Neugestaltung des Auswerteschemas der Spontanbewegungsmuster 59 4.3.4 Spontanbewegungsmustern von Schweinen mit Reaktion auf den Heißwasser-Reiz und positivem Gehirnnerven-Befund 60 4.3.5 Spontanbewegungsmuster-Kombinationen von Schweinen mit Reaktion auf den Heißwasser-Reiz und positivem Gehirnnerven-Befund 61 4.3.6 Spontanbewegungen von Schweinen ohne Reaktion auf den Heißwasser-Reiz und mit negativem Gehirnnerven-Befund 62 4.3.7 Spontane Maulöffnungs-Bewegungen zwischen Entblutestich und Reizapplikation 63 4.4 Bewegungen beim Anschlingen in Abhängigkeit vom Reizergebnis 68 4.5 Elektrische Nachbetäubung in Abhängigkeit vom Reizergebnis 68 4.6 Schlussfolgerungen und Lösungsvorschläge für die Praxis 69 5 Diskussion 71 5.1 Vorversuch: Reizung mittels Heißwasser, Kaltwasser und Strom 71 5.2 Hauptversuch: Reizapplikation mittels Heißwasser 73 5.2.1 Vorkommen von Bewegung während der Heißwasser-Reizapplikation 74 5.2.2 Befunde der Gehirnnerven-Untersuchung 75 5.2.3 Gehirnnerven-Befunde der Schweine in Korrelation mit Reaktionen auf den Heißwasser-Reiz 77 5.2.4 Erkennbarkeit der Bewegungen während der Heißwasser-Reizapplikation 78 5.2.5 Neugestaltung des Auswerteschemas der Bewegungsmuster während der Heißwasser-Reizapplikation 78 5.2.6 Vorkommen von Bewegungsmustern während der Heißwasser-Reizapplikation 79 5.2.7 Erkennbarkeit der Bewegungsmuster während der Heißwasser-Reizapplikation 80 5.2.8 Zusammenhang zwischen den Bewegungsmustern und den Gehirnnerven-Befunden 80 5.2.9 Häufigkeit der Bewegungsmuster während der Heißwasser-Reizapplikation 81 5.2.10 Vorkommen von Bewegungsmuster-Kombinationen während der Heißwasser-Reizapplikation 82 5.2.11 Zusammenhang zwischen den Bewegungsmuster-Kombinationen und den Gehirnnerven-Befunden 82 5.2.12 Schweine mit steif veränderter Körperhaltung am Ende der Nachentblutestrecke 84 5.2.13 Abschließende Bewertung des Reizes „Heißwasser“ 85 5.3 Spontanbewegungen auf der Nachentblutestrecke 86 5.3.1 Vorkommen von Spontanbewegungen 86 5.3.2 Vorkommen von Spontanbewegungen im Zusammenhang mit den Reiz- und Gehirnnerven-Befunden 87 5.3.3 Neugestaltung des Auswerteschemas der Spontanbewegungsmuster 88 5.3.4 Spontanbewegungsmuster von Schweinen mit Reaktion auf den Heißwasser-Reiz und positivem Gehirnnerven-Befund 88 5.3.5 Spontanbewegungsmuster-Kombinationen von Schweinen mit Reaktion auf den Heißwasser-Reiz und positivem Gehirnnerven-Befund 88 5.3.6 Spontanbewegungen von Schweinen ohne Reaktion auf den Heißwasser-Reiz und mit negativem Gehirnnerven-Befund 89 5.3.7 Spontane Maulöffnungs-Bewegungen zwischen Entblutestich und Reizapplikation 90 5.4 Bewegungen beim Anschlingen in Abhängigkeit vom Reizergebnis 91 5.5 Elektrische Nachbetäubung in Abhängigkeit vom Reizergebnis 91 5.6 Schlussfolgerungen und Lösungsvorschläge für die Praxis 92 6 Ausblick 94 7 Zusammenfassung 96 8 Summary 98 9 Literaturverzeichnis 100 10 Anhang 112Modern slaughter regimes carry a risk of live animals being further processed (SCHÜTTE and BOSTELMANN 2001, TROEGER 2005 and TROEGER and MEILER 2006). This serious animal welfare problem may result from inefficient stunning and/or lack of complete and fast exsanguination of the pigs. In 2009, the European Commission implemented Council Regulation (EC) No. 1099/2009 on the protection of animals at the time of killing (ANON. 2009). The study lays groundwork for developing an automated method to verify the absence of signs of life in slaughter pigs. The hypothesis is that pigs that react to a painful stimulus, like hot water, several minutes after debleeding have the risk of a partly functional brains. The study took place at three commercial abattoirs in Germany using different electrical stunning (head-to-body) and bleeding methods. In the main part of the study a total of 5,301 finishing pigs was examined and videotaped on line. As a stimulus to check the absence of signs of life right before further processing, namely four to five minutes after sticking, a hot-water-stimulus at 65 °C was utilized. The residence time of the stimulus amounted either five or 15 seconds. An automated construction, built by the company BANSS Schlacht- und Fördertechnik GmbH (Biedenkopf/Germany), implemented the stimulus mainly within the faces of the pigs. As a reference to the observation of movements during the stimulation, brain stem reflexes (corneal and palpebral) and reactions to a nasal septum pinch were clinically examined. Pigs with any positive result were restunned or killed using a captive bolt device. The sensitivity of the hot-water-test was determined at 99 %. One out of 75 animals exhibited positive corneal- and palpebral-reflexes although this one pig did not show any reaction to the hot water stimulation. However, obvious spontaneous movements of this animal could be observed beforehand. The specificity of the hot-water-test was determined at 98 %. Almost every pig with negative brain stem results remained motionless during the stimulation. A share of 3.8 % (n = 199) of pigs showed movements during the hot water exposure. Es war kein Unterschied zwischen dem fünf bzw. 15 Sekunden anhaltendem Reiz zu ermitteln. No difference was estimated between the residence times of five versus 15 seconds. Besides inefficient bleeding one possible reason for this result is reversible stunning. Electrical stunning is reversible, unless effective cardiac arrest is caused (HOENDERKEN et al. 1980 and VOGEL et al. 2010). It may be assumed that after head-to-body electrical stunning used by the abattoirs displayed in this study cardiac arrest was not always achieved. The number of individual responses was limited. 92 % of pigs that shook their heads during the stimulation and 78 % that showed a righting reflex exhibited at least one positive brain stem result. Noticeable front leg activity correlated to 59 % and the movement “opening of the mouth” to 52 % with positive brain stem results. Hips or hind leg movements were only associated with positive brain stem results in 21 % of the cases. By looking at the combinations of movements the author found that nearly no reaction should be ignored. Merely exclusive hips or hind leg movements in none of the 59 cases correlated with brain stem results. This finding is supported by the statements made by GRANDIN (2013) and the staff of the bsi Schwarzenbek (ANON. 2013a), pointing out that the caudal body part of electrically stunned slaughter pigs possesses no relevance to evaluating possible consciousness. During the study additionally spontaneous movements of the slaughter pigs were analyzed between sticking and the hot water device. Every animal that eventually showed a reaction to the hot water stimulation and exhibited at least one positive result during the brain stem examination had shown spontaneous mouth opening. Appropriate working instructions for the monitoring personnel and the slaughter staff, in order for them to realize which spontaneous movements or stimulus induced reactions during the observations of the debleeding line are relevant, were designed. For this available expertise has additionally been taken into account (ANIL 1991, ATKINSON et al. 2012 and EFSA 2013). As a suitable solution for ascertaining death before further processing, the idea of paying attention to slaughter pigs that obviously show signs of recovery and the implementation of a “last check” by using a hot water test right before further processing seems reasonable. Of course the stunning and exsanguination should still be safely monitored. The use of a captive bolt device to restun or kill “suspicious” pigs is recommended by the EFSA (2004), the bsi Schwarzenbek and the Max Rubner-Institute.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Rechtlicher Hintergrund zum Todeseintritt von Schlachtschweinen 3 2.2 Philosophische Betrachtungen zum Töten von Tieren 3 2.3 Human- und Veterinärmedizinische Definitionen des Todeseintritts 4 2.4 Kontrolle des Todeseintritts beim Menschen 5 2.5 Kontrolle des Todeseintritts bei Schlachtschweinen 6 2.5.1 Anatomische, physiologische und neuronale Grundlagen 6 2.5.2 Allgemeine Pathophysiologie des Hirntodes 7 2.5.3 Neuronale Verschaltung und muskuläre Antwort auf Schmerzreize 8 2.5.4 Einsatz verschiedener Schmerzreize 10 2.5.5 Einfluss der Betäubungsverfahren auf die Todeskontrolle 11 2.5.6 Einfluss des Entbluteverfahrens auf die Todeskontrolle 13 2.5.7 Kriterien der klinischen Untersuchung zur Todeskontrolle 14 2.5.8 Stand der Technik automatisierter Verfahren zur Todeskontrolle von Schweinen 15 3 Tiere, Material, Methoden 17 3.1 Überblick 17 3.2 Schlachtbetriebe 18 3.3 Schweine 18 3.4 Einsatz eines automatisierten Reizverfahrens 19 3.4.1 Vorversuch: Reizung mittels Heißwasser, Kaltwasser und Strom 19 3.4.2 Hauptversuch: Reizung mittels Heißwasser 20 3.4.3 Entwicklung der automatisierten Wasserreizanlage 21 3.4.4 Versuchsablauf, Aufzeichnungs- und Auswertemethodik 25 3.4.5 Untersuchung der Gehirnnerven nach Reizapplikation 27 3.5 Spontanbewegungen auf der Nachentblutestrecke 28 3.6 Bewegungen beim Anschlingen 28 3.7 Elektrische Nachbetäubung auf der Nachentblutestrecke 28 3.8 Statistische Analysen 29 4 Ergebnisse 31 4.1 Vorversuch: Reizung mittels Heißwasser, Kaltwasser und Strom 31 4.2 Hauptversuch: Reizapplikation mittels Heißwasser 32 4.2.1 Vorkommen von Bewegung während der Heißwasser-Reizapplikation 33 4.2.2 Befunde der Gehirnnerven-Untersuchung 34 4.2.3 Gehirnnerven-Befunde der Schweinen in Korrelation mit Reaktionen auf den Heißwasser-Reiz 36 4.2.4 Erkennbarkeit der Bewegungen während der Heißwasser-Reizapplikation 37 4.2.5 Neugestaltung des Auswerteschemas der Bewegungsmuster während der Heißwasser-Reizapplikation 39 4.2.6 Vorkommen von Bewegungsmustern während der Heißwasser-Reizapplikation 40 4.2.7 Erkennbarkeit der Bewegungsmuster während der Heißwasser-Reizapplikation 42 4.2.8 Zusammenhang zwischen den Bewegungsmustern und den Gehirnnerven-Befunden 44 4.2.9 Häufigkeit der Bewegungsmuster während der Heißwasser-Reizapplikation 47 4.2.10 Vorkommen von Bewegungsmuster-Kombinationen während der Heißwasser-Reizapplikation 49 4.2.11 Zusammenhang zwischen Bewegungsmuster-Kombinationen und den Gehirnnerven-Befunden 53 4.2.12 Schweine mit steif veränderter Körperhaltung am Ende der Nachentblutestrecke 54 4.2.13 Abschließende Bewertung des Reizes „Heißwasser“ 55 4.3 Spontanbewegungen auf der Nachentblutestrecke 57 4.3.1 Vorkommen von Spontanbewegungen 57 4.3.2 Vorkommen von Spontanbewegungen im Zusammenhang mit den Reiz- und Gehirnnerven-Befunden 58 4.3.3 Neugestaltung des Auswerteschemas der Spontanbewegungsmuster 59 4.3.4 Spontanbewegungsmustern von Schweinen mit Reaktion auf den Heißwasser-Reiz und positivem Gehirnnerven-Befund 60 4.3.5 Spontanbewegungsmuster-Kombinationen von Schweinen mit Reaktion auf den Heißwasser-Reiz und positivem Gehirnnerven-Befund 61 4.3.6 Spontanbewegungen von Schweinen ohne Reaktion auf den Heißwasser-Reiz und mit negativem Gehirnnerven-Befund 62 4.3.7 Spontane Maulöffnungs-Bewegungen zwischen Entblutestich und Reizapplikation 63 4.4 Bewegungen beim Anschlingen in Abhängigkeit vom Reizergebnis 68 4.5 Elektrische Nachbetäubung in Abhängigkeit vom Reizergebnis 68 4.6 Schlussfolgerungen und Lösungsvorschläge für die Praxis 69 5 Diskussion 71 5.1 Vorversuch: Reizung mittels Heißwasser, Kaltwasser und Strom 71 5.2 Hauptversuch: Reizapplikation mittels Heißwasser 73 5.2.1 Vorkommen von Bewegung während der Heißwasser-Reizapplikation 74 5.2.2 Befunde der Gehirnnerven-Untersuchung 75 5.2.3 Gehirnnerven-Befunde der Schweine in Korrelation mit Reaktionen auf den Heißwasser-Reiz 77 5.2.4 Erkennbarkeit der Bewegungen während der Heißwasser-Reizapplikation 78 5.2.5 Neugestaltung des Auswerteschemas der Bewegungsmuster während der Heißwasser-Reizapplikation 78 5.2.6 Vorkommen von Bewegungsmustern während der Heißwasser-Reizapplikation 79 5.2.7 Erkennbarkeit der Bewegungsmuster während der Heißwasser-Reizapplikation 80 5.2.8 Zusammenhang zwischen den Bewegungsmustern und den Gehirnnerven-Befunden 80 5.2.9 Häufigkeit der Bewegungsmuster während der Heißwasser-Reizapplikation 81 5.2.10 Vorkommen von Bewegungsmuster-Kombinationen während der Heißwasser-Reizapplikation 82 5.2.11 Zusammenhang zwischen den Bewegungsmuster-Kombinationen und den Gehirnnerven-Befunden 82 5.2.12 Schweine mit steif veränderter Körperhaltung am Ende der Nachentblutestrecke 84 5.2.13 Abschließende Bewertung des Reizes „Heißwasser“ 85 5.3 Spontanbewegungen auf der Nachentblutestrecke 86 5.3.1 Vorkommen von Spontanbewegungen 86 5.3.2 Vorkommen von Spontanbewegungen im Zusammenhang mit den Reiz- und Gehirnnerven-Befunden 87 5.3.3 Neugestaltung des Auswerteschemas der Spontanbewegungsmuster 88 5.3.4 Spontanbewegungsmuster von Schweinen mit Reaktion auf den Heißwasser-Reiz und positivem Gehirnnerven-Befund 88 5.3.5 Spontanbewegungsmuster-Kombinationen von Schweinen mit Reaktion auf den Heißwasser-Reiz und positivem Gehirnnerven-Befund 88 5.3.6 Spontanbewegungen von Schweinen ohne Reaktion auf den Heißwasser-Reiz und mit negativem Gehirnnerven-Befund 89 5.3.7 Spontane Maulöffnungs-Bewegungen zwischen Entblutestich und Reizapplikation 90 5.4 Bewegungen beim Anschlingen in Abhängigkeit vom Reizergebnis 91 5.5 Elektrische Nachbetäubung in Abhängigkeit vom Reizergebnis 91 5.6 Schlussfolgerungen und Lösungsvorschläge für die Praxis 92 6 Ausblick 94 7 Zusammenfassung 96 8 Summary 98 9 Literaturverzeichnis 100 10 Anhang 11

He or She: Reporting court cases of trans-identified defendants in the UK

Reporting of court cases with trans-identified defendants has become both more common and more difficult due to changing guidance to court officials, and a lack of regulatory guidance to media organisations. This has resulted in confusing articles and abuse of journalists. This research examined 138 media reports of 39 UK court cases concerning defendants who claimed to be transgender. The results showed great variation in journalistic practice regarding pronouns, use of names and terminology. Journalists were asked for the reasoning behind editorial decisions. Stakeholders were also invited to give their opinions on current and ideal reporting practice. Current legal and regulatory guidelines in the UK were reviewed. Guidance is given to enable journalists to report these cases safely and accurately

Prognostic factors for recurrent idiopathic clubfoot deformity:a systematic literature review and meta-analysis

Background and purpose — After initial clubfoot correction through Ponseti treatment, recurrence rates range from 26% to 48%. Even though various factors have been associated with increased recurrence risk, systematic assessments of the prognostic capacity of recurrence risk factors and their clinical relevance are lacking. Therefore we assessed clinically relevant prognostic factors for recurrent idiopathic clubfoot deformity after initial correction through Ponseti treatment. Methods — PubMed, Embase, Cinahl, and Web of Science were systematically searched for studies investigating the association between clinically relevant factors and recurrence rates. Prognostic factors were qualitatively assessed and included in the meta-analysis if ≥ 2 studies investigated the same factor and methods were comparable. Results — 34 articles were included in the qualitative synthesis, of which 22 were also included in the meta-analysis. Meta-analysis revealed that poor evertor muscle activity (OR = 255, 95% CI 30–2,190), brace non-compliance (OR = 10, CI 5–21), no additional stretching (OR = 31, CI 10–101), more casts (OR = 3.5, CI 1.6–7.8), lower education level of parents (OR = 1.8, CI 1.2–2.6), non-marital status of parents (OR = 1.8, CI 1.1–3.0), and higher Dimeglio scores (OR = 1.9, CI 1.2–3.3) were associated with higher recurrence rates. Interpretation — Brace non-compliance and poor evertor muscle activity have been identified as main recurrence risk factors and are therefore important to be closely monitored during clinical follow-up of clubfoot patients. Adding additional stretching during the bracing protocol might be promising in the quest to prevent relapse, but scientific evidence for clear clinical treatment recommendations is still limited

Functional Characterization of Colon-Cancer-Associated Variants in ADAM17 Affecting the Catalytic Domain

Although extensively investigated, cancer is still one of the most devastating and lethal diseases in the modern world. Among different types, colorectal cancer (CRC) is most prevalent and mortal, making it an important subject of research. The metalloprotease ADAM17 has been implicated in the development of CRC due to its involvement in signaling pathways related to inflammation and cell proliferation. ADAM17 is capable of releasing membrane-bound proteins from the cell surface in a process called shedding. A deficiency of ADAM17 activity has been previously shown to have protective effects against CRC in mice, while an upregulation of ADAM17 activity is suspected to facilitate tumor development. In this study, we characterize ADAM17 variants found in tissue samples of cancer patients in overexpression studies. We here focus on point mutations identified within the catalytic domain of ADAM17 and could show a functional dysregulation of the CRC-associated variants. Since the catalytic domain of ADAM17 is the only region structurally determined by crystallography, we study the effect of each point mutation not only to learn more about the role of ADAM17 in cancer, but also to investigate the structure-function relationships of the metalloprotease

Preparation, characterization, and safety evaluation of poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles for protein delivery into macrophages.

International audienceFollowing infection, HIV establishes reservoirs within tissues that are inaccessible to optimal levels of antiviral drugs or within cells where HIV lies latent, thus escaping the action of anti-HIV drugs. Macrophages are a persistent reservoir for HIV and may contribute to the rebound viremia observed after antiretroviral treatment is stopped. In this study, we further investigate the potential of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based nanocarriers as a new strategy to enhance penetration of therapeutic molecules into macrophages. We have prepared stable PLGA nanoparticles (NPs) and evaluated their capacity to transport an active molecule into the human monocyte/macrophage cell line THP-1 using bovine serum albumin (BSA) as a proof-of-concept compound. Intracellular localization of fluorescent BSA molecules encapsulated into PLGA NPs was monitored in live cells using confocal microscopy, and cellular uptake was quantified by flow cytometry. In vitro and in vivo toxicological studies were performed to further determine the safety profile of PLGA NPs including inflammatory effects. The size of the PLGA NPs carrying BSA (PLGA-BSA) in culture medium containing 10% serum was ~126 nm in diameter, and they were negatively charged at their surface (zeta potential =-5.6 mV). Our confocal microscopy studies and flow cytometry data showed that these PLGA-BSA NPs are rapidly and efficiently taken up by THP-1 monocyte-derived macrophages (MDMs) at low doses. We found that PLGA-BSA NPs increased cellular uptake and internalization of the protein in vitro. PLGA NPs were not cytotoxic for THP-1 MDM cells, did not modulate neutrophil apoptosis in vitro, and did not show inflammatory effect in vivo in the murine air pouch model of acute inflammation. In contrast to BSA alone, BSA encapsulated into PLGA NPs increased leukocyte infiltration in vivo, suggesting the in vivo enhanced delivery and protection of the protein by the polymer nanocarrier. We demonstrated that PLGA-based nanopolymer carriers are good candidates to efficiently and safely enhance the transport of active molecules into human MDMs. In addition, we further investigated their inflammatory profile and showed that PLGA NPs have low inflammatory effects in vitro and in vivo. Thus, PLGA nanocarriers are promising as a drug delivery strategy in macrophages for prevention and eradication of intracellular pathogens such as HIV and Mycobacterium tuberculosis

Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) predicts response to neoadjuvant chemotherapy and clinical outcome in primary human breast cancer

In our previous work we showed that NGAL, a protein involved in the regulation of proliferation and differentiation, is overexpressed in human breast cancer (BC) and predicts poor prognosis. In neoadjuvant chemotherapy (NACT) pathological complete response (pCR) is a predictor for outcome. The aim of this study was to evaluate NGAL as a predictor of response to NACT and to validate NGAL as a prognostic factor for clinical outcome in patients with primary BC. Immunohistochemistry was performed on tissue microarrays from 652 core biopsies from BC patients, who underwent NACT in the GeparTrio trial. NGAL expression and intensity was evaluated separately. NGAL was detected in 42.2% of the breast carcinomas in the cytoplasm. NGAL expression correlated with negative hormone receptor (HR) status, but not with other baseline parameters. NGAL expression did not correlate with pCR in the full population, however, NGAL expression and staining intensity were significantly associated with higher pCR rates in patients with positive HR status. In addition, strong NGAL expression correlated with higher pCR rates in node negative patients, patients with histological grade 1 or 2 tumors and a tumor size <40 mm. In univariate survival analysis, positive NGAL expression and strong staining intensity correlated with decreased disease-free survival (DFS) in the entire cohort and different subgroups, including HR positive patients. Similar correlations were found for intense staining and decreased overall survival (OS). In multivariate analysis, NGAL expression remained an independent prognostic factor for DFS. The results show that in low-risk subgroups, NGAL was found to be a predictive marker for pCR after NACT. Furthermore, NGAL could be validated as an independent prognostic factor for decreased DFS in primary human BC

Adherence to the Mediterranean Diet and Incidence of Pre-Frailty and Frailty in Community-Dwelling Adults 70+: The 3-Year DO-HEALTH Study

The Mediterranean diet has been associated with many health benefits. Therefore, we investigated whether the degree of adherence to the Mediterranean diet at baseline, or changes in adherence over time, were associated with the incidence of pre-frailty or frailty in generally healthy older adults. This study used the DO-HEALTH trial data. We evaluated Mediterranean diet adherence with Panagiotakos’ MedDietScore at baseline and at 3-year follow-up; frailty was assessed annually with the Fried frailty phenotype. We used minimally and fully adjusted mixed logistic regression models to estimate the exposure–disease relationship. We included 1811 participants without frailty at baseline (mean age 74.7 years; 59.4% women). Baseline adherence, as reflected by the MedDietScore, was not associated with becoming pre-frail [OR(95%CI) = 0.93 (0.83–1.03) for five-point greater adherence] or frail [OR(95%CI) = 0.90 (0.73–1.12) for five points]. However, a five-point increase in the MedDietScore over three years was associated with lower odds of becoming pre-frail [OR(95%CI) = 0.77 (0.68–0.88)] and frail [OR(95%CI) = 0.77 (0.64–0.92)]. In generally healthy and active older adults, baseline adherence to the Mediterranean diet was not associated with the incidence of pre-frailty or frailty over a 3-year follow-up. However, improved adherence to the Mediterranean diet over time was associated with significantly lower odds of becoming pre-frail or frail

Refinement Modal Logic

In this paper we present {\em refinement modal logic}. A refinement is like a bisimulation, except that from the three relational requirements only `atoms' and `back' need to be satisfied. Our logic contains a new operator 'all' in addition to the standard modalities 'box' for each agent. The operator 'all' acts as a quantifier over the set of all refinements of a given model. As a variation on a bisimulation quantifier, this refinement operator or refinement quantifier 'all' can be seen as quantifying over a variable not occurring in the formula bound by it. The logic combines the simplicity of multi-agent modal logic with some powers of monadic second-order quantification. We present a sound and complete axiomatization of multi-agent refinement modal logic. We also present an extension of the logic to the modal mu-calculus, and an axiomatization for the single-agent version of this logic. Examples and applications are also discussed: to software verification and design (the set of agents can also be seen as a set of actions), and to dynamic epistemic logic. We further give detailed results on the complexity of satisfiability, and on succinctness