Modificações genéticas em leveduras para expressão de celulases

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, 2012.A produção de etanol lignocelulósico transformou-se em um grande desafio para a indústria de energia renovável. A celulose presente nos resíduos lignocelulósicos representa uma fonte abundante de açúcares, mas estes só se tornam disponíveis para fermentação após a etapa de hidrólise enzimática. As grandes quantidades de enzimas necessárias impactam severamente a relação custo-eficácia desta tecnologia. No sentido de buscar novas alternativas, conduzimos o trabalho com o intuito de construir linhagens das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris capazes de produzir celulases (endoglicanase, celobiohidrolase e β-glicosidase). A primeira etapa para a produção de uma linhagem de S. cerevisiae produtora de celulases, foi a expressão isolada de genes celulolíticos. A expressão da endoglicanase II (eglII) de Trichoderma reesei e da celobiohidrolase I.1 (cbhI.1) de Phanerochaete chrysosporium em S. cerevisiae linhagem MFL gerou clones produtores de enzimas funcionais no sobrenadante do cultivo. Em ambos os clones selecionados para cada enzima, foi detectada atividade enzimática a partir de 24 h de cultivo, atingindo maior atividade após 96 h. Várias estratégias para expressão de β-glicosidases em S. cerevisiae foram abordadas: i) a expressão da BGL1 de Sacharomycopsis fibuligera em sua forma nativa, ii) fusionada ao C-terminal da α-aglutinina e, iii) com o peptídeo sinal do fator α de S. cerevisiae. As duas últimas estratégias também foram realizadas com a BGL4 do fungo Humicola grisea var. thermoidea. Testou-se, ainda, a co-expressão da β-glicosidase intracelular GH1-1 e do transportador de celodextrinas CDT-1 de Neurospora crassa. Dentre todos os genes e estratégia utilizados, apenas o sistema envolvendo a co-expressão da GH1-1 e do CDT-1 apresentou resultado satisfatório. O sistema provou ser eficiente permitindo que a levedura crescesse na presença de celobiose em condições aeróbicas e anaeróbicas, com produção de etanol na segunda condição. A co-expressão dos genes eglII e cbhI.1 foi em seguida testada na forma de “fusões gênicas” utilizando dois sistemas de clivagem in vivo: a sequência autoclivante 2A do vírus FMDV, e o sítio para a endoprotease Kex2p. Os dois sistemas resultaram em enzimas funcionais, no entanto as atividades foram menores do que aquelas obtidas quando as enzimas foram expressas separadamente (possivelmente devido ao saturamento da via de secreção). Finalmente, no sentindo de obter uma linhagem de S. cerevisiae que expressasse as três cellulases, foi feita a co-expressão das fusões gênicas com o sistema β-glicosidase/transportador. O clone selecionado GH1-Fus2A apresentou atividade enzimática sobre os substratos CMC e pNPC, capacidade de crescimento em celobiose e seu consumo, e produção de etanol, indicando a produção das três enzimas celulolíticas funcionais na mesma levedura. Para a obtenção de uma linhagem de P. pastoris recombinante produtora de celulases, os genes dessas enzimas foram clonados sob o controle do forte promotor induzível AOX1, em vetores integrativos. Foram utilizados os genes eglII e cbhI.1 em fusão gênica com a sequencia 2A. As atividades sobre CMC, Sigmacel e papel de filtro foram detectadas no sobrenadantes da linhagem recombinante, nas primeiras horas de indução, sendo os maiores níveis encontrados após 72 h, confirmando a atividade das enzimas EGLII e CBHI.1. A atividade sobre CMC do clone recombinante de P. pastoris foi aproximadamente 8 vezes superior àquela obtida com o clone recombinante de S. cerevisiae expressando a mesma fusão gênica. A análise do sobrenadante do cultivo por SDS-PAGE mostrou a clivagem da proteína de fusão pelo peptídeo 2A gerando proteínas independentes. Por fim, demonstrou-se a construção de linhagens de S. cerevisiae e de P. pastoris produtora de celulases necessárias para a degradação da celulose. Essas leveduras são apontadas como uma interessante plataforma para a produção de proteínas heterólogas, e com isso diminuir a quantidade de enzimas comerciais necessárias para hidrolisar o substrato, contribuindo para a redução da dependência da importação das enzimas. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACTThe production of lignocellulosic ethanol become a great challenge for the renewable energy industry. Cellulose present in the lignocellulosic residues represents an abundant source of sugars, but these are only available for the fermentation process after an enzymatic hydrolysis step. The large amount of enzymes required severely impacts the overall cost-efficacy relation of this technology. In an effort to pursue new alternatives, we performed this work aiming to construct strains of Saccharomyces cerevisae and Pichia pastoris able to produce cellulases (endoglucanase, celobiohydrolase and β-glucosidase). The first step for the production of the S. cerevisiae strain that produces cellulose was the isolated expression of cellulolitcs genes. The single expression of the endoglucanase II of Trichoderma reesei and of the cellobiohydrolase I.1 of Phanerochaete chrysosporium in S. cerevisiae MFL generated clones producing functional enzymes on the culture supernatant. In both selected clones for each enzyme, the enzymatic activity was detected after 24 h of cultivation, reaching the highest activity after 96 h. Many strategies for the expression of β-glucosidases in S. cerevisiae were performed: i) the expression of BGL1 de Sacharomycopsis fibuligera in its native form, ii) fused to C-terminal of α-aglutinin and, iii) with the signal peptide form the S. cerevisiae α-factor. The last two strategies were also performed with BGL4 from the fungus Humicola grisea var. thermoidea. It was also tested the co-expression of the intracellular β-glucosidase GH1-1 and the cellodextrins transporter CDT-1 of Neurospora crassa. Of all those strategies, only the system involving the co-expression of GH1-1 and CDT-1 showed satisfactory results. The system showed to be efficient allowing the growth of the yeast in the presence of cellobiose both in aerobic and anaerobic conditions, with ethanol production in the latter. Then, the co-expression of eglII and cbhI.1 genes was tested in the form of “gene fusions” using two in vivo cleavage systems: the auto-cleavage 2A sequence from the FMDV virus, and the cleavage site for the Kex2p protease. Both systems result in functional enzymes, however the activities were lower than those obtained when the enzymes were expressed separately, possibly due the saturation of the secretion pathway. Finally, in an effort to obtain a S. cerevisiae strain that expresses the three cellulases, it was made the co-expression of gene fusion with the β-glucosidase/transporter system. The selected clone GH1-Fus2A showed enzymatic activity with the substrates CMC and pNPC, capacity of growing in cellobiose and consumes it, and ethanol production, indicating the production of the three functional cellulolitic enzymes in the same yeast. To obtain a recombinant P. pastoris strain producing cellulases, the genes of these enzymes were cloned into an integrative vector under the control of the strong inducible promoter AOX1. It was used the eglII and cbhI.1 genes in a gene fusion with the autoclivable 2A sequence. Enzymatic activities with the substrates CMC, Sigmacel and filter paper were detected on the supernatant of the recombinant strain, confirming the enzymes activities of EGLII and CBH.1. The enzymatic activities were detected during the first hours of induction, where the highest levels occurred after 72h. The activity with CMC of the recombinant clone of P. pastoris was approximately 8-fold higher than that obtained with the recombinant clone in S. cerevisiae expressing the same gene fusion. Analysis of the culture supernatant through SDS-PAGE showed the protein fusion cleavage by the 2A peptide generating independent proteins. Finally, it was shown the construction of S. cerevisiae and P. pastoris strains producing cellulases necessary for the cellulose degradation. These yeasts are pointed out as an interesting platform for heterologous protein production and diminishing the amount of commercial enzymes needed to hydrolyze the substrate contribute to the decrease of the dependence of enzymes importation

Injúria pulmonar relacionada ao uso de cigarro eletrônico (EVALI): uma revisão de literatura / Pulmonary injury related to electronic cigarette use (EVALI): a literature review

Os cigarros eletrônicos tornam o organismo suscetível a diversos elementos químicos que são gerados pelo próprio dispositivo e pelo processo de aquecimento (vaporização), devido a substâncias tóxicas contidas no vapor desses dispositivos). Assim em meio à crescente utilização de cigarros eletrônicos, surgem várias doenças e destaca-se, na modernidade, o surgimento da EVALI (Lesão pulmonar associada ao uso de cigarro eletrônico), uma síndrome pulmonar que pode levar à morte. Por isso, o trabalho tem como objetivo realizar uma revisão de literatura com o intuito de refletir e apresentar os principais achados sobre a doença EVALI e suas consequências atribuídas ao uso de dispositivos eletrônicos de fumar. Trata-se de uma revisão bibliográfica narrativa, desenvolvida a partir de uma pesquisa literária em artigos científicos encontrados nas plataformas: PubMed, Lilacs e Scielo, considerando o cruzamento dos descritores "EVALI" AND "cigarro eletrônico" de artigos publicados nos últimos 5 anos (de 2017 a 2022). Sabe-se que os melhores diagnósticos são aqueles que seguem alguns protocolos, a partir do relato dos principais sintomas pelo paciente, que são: tosse, dor torácica e dispneia. Exames complementares, como por exemplo exames de imagem, podem ser solicitados, para que se possa acompanhar a presença ou evolução da doença. Com relação ao tratamento, sugere-se a suspensão da utilização do cigarro eletrônico, além de acompanhamento clínico que pode incluir a utilização de oxigênio e ventilação invasiva ou não invasiva, quando necessário.Ainda que a comercialização, importação e propaganda de cigarros eletrônicas ainda sejam consideradas proibidas no Brasil, sua disposição e disseminação ocorrem de maneira desenfreada, fazendo-se necessário a discussão acerca do tema e o esclarecimento acerca dos seus principais riscos e malefícios

ANÁLISE TEMPORAL DOS CASOS DE ESQUISTOSSOMOSE EM MUNICÍPIOS ENDÊMICOS NA PARAÍBA, BRASIL

A esquistossomose é um problema de saúde pública que acomete todo o Brasil, em especial a região Nordeste. Assim sendo, objetivou-se analisar o comportamento dos casos de esquistossomose notificados pelo PCE correspondentes aos anos de 2005 a 2014 na Paraíba. Trata-se de uma análise ecológica descritiva de série temporal, de caráter quantitativo, cujos dados foram obtidos no SISPCE, disponibilizados pelo DATASUS. Para a análise dos dados foi utilizado o programa SPSS, versão 20. Observou-se que o percentual de positividade aumentou significativamente de 5,15% em 2005 para 10,20% em 2014. E o percentual de casos tratados que em 2005 correspondia a 75,66% sofreu brusca redução atingindo em 2014 o patamar mínimo de 32,20%, enquanto o percentual de casos não tratados por ausência aumentou no estado da Paraíba tendo seu maior valor em 2012 com um percentual de 41,60%. Os municípios paraibanos em que houve aumento do percentual de não tratados por ausência foram: Alhandra, Conde, João Pessoa, Lucena, Pitimbu, Rio Tinto e Sapé, nos demais, observou-se uma redução. Esses dados reforçam a necessidade de políticas públicas mais incisivas no controle da esquistossomose que enfoquem a educação em saúde como medida para erradicar a endemia

Soil chemical attributes in native and exotic forest cover in source of Batatais State Forest, São Paulo, Brazil / Atributos químicos do solo em coberturas florestais nativas e exóticas no manancial da Floresta Estadual de Batatais, São Paulo, Brasil

Este trabalho tem por objetivo analisar a homogeneidade das amostras de solo das árvores nativas plantadas há 20 anos na Floresta Estadual de Batatais em comparação com outros usos/ocupação. Ao longo da projeção da copa de oito espécies nativas foram coletadas amostras compostas de solo na profundidade 0-0,20 m, que foram avaliadas junto com o solo de outros estudos com árvores de progênies de Eucalyptus pellita, de E. tereticornis e do plantio comercial de Pinus caribaea hondurensis e P. c. bahamensis. A análise multivariada dos atributos do solo das espécies nativas restou não significativa, indicando a homogeneidade do solo na área de estudo, restando a expressão genética das espécies para outras variáveis dendrométricas e de qualidade da madeira a serem estudadas. Por outro lado, a análise multivariada das espécies nativas com as de Eucalyptus e Pinus resultaram altamente significativas, mostrando que existe diferença dos atributos do solo em relação aos diferentes usos/ocupações. Os Eucalyptus apresentam maior teor de bases que o Pinus e o Florestamento, em áreas com menor acidez potencial e maior capacidade de troca de cátions (CTC), restando à área com Florestamento maior acidez potencial e menor CTC

Factores asociados con infecciones de transmisión sexual en cortadores de caña de azúcar: contribuciones para el cuidado

Objective: to estimate the prevalence of Sexually Transmitted Infections (STIs) and associated factors in sugarcane cutters. Method: a cross-sectional, analytical study with 937 sugarcane cutters from Paraíba and Goiás, states of Brazil, respectively. An outcome variable was the positive results in some rapid tests for HIV, syphilis, hepatitis B and C. Bivariate and multiple analyses were performed to identify the association between these infections and sociodemographic and behavioral variables. Results: all participants were male, most were young adults and had low schooling. Prevalence of STI was estimated at 4.1% (95% CI: 3.0-5.5). According to multiple regression analysis, the variables age over 40 years (OR 5.0; CI 95%: 1.8-14), alcohol consumption (OR 3.9; CI 95%: 1.3-11.9), and illicit drugs (OR 2.9; CI 95%: 1.3-6.3) were factors associated with the STIs investigated. On the other hand, having some religion (OR 0.4; CI 95%: 0.2-0.8), and work in the Midwest Region (OR 0.4; CI 95%: 0.2-0.9) were factors negatively associated with these infections. Conclusion: presence of risk behaviors for STI among sugarcane cutters. Screening for these infections in groups of rural workers is essential for early diagnosis and breaking the chain of transmission.Objetivo: estimar la prevalencia de infecciones de transmisión sexual (ITS) y factores asociados en cortadores de caña de azúcar. Método: estudio analítico transversal con 937 cortadores de caña de azúcar de los estados de Paraíba y Goiás, en Brasil. Se consideró como variable el resultado positivo en algunas pruebas rápidas para VIH, sífilis, hepatitis B y C. Se realizaron análisis bivariados y múltiples para identificar una asociación entre estas infecciones y las variables sociodemográficas y de comportamiento. Resultados: todos los participantes eran hombres, la mayoría eran adultos jóvenes con bajo índice de escolaridad. Se estimó una prevalencia de ITS de 4.1% (IC 95%: 3.0-5.5). Según el análisis de regresión múltiple, variables como edad superior a 40 años (OR 5.0; IC 95%: 1.8-14), consumo de alcohol (OR 3.9; IC 95%: 1.3- 11.9) y drogas ilícitas (OR 2.9; IC 95%: 1.3-6.3) fueron factores asociados a las ITS investigadas. Por otro lado, factores como tener alguna religión (OR 0.4; IC 95%: 0.2-0.8) y trabajar en la región Centro-Oeste (OR 0.4; IC 95%: 0.2-0.9) tuvieron una asociación negativa en relación a estas infecciones. Conclusión: se advirtió la presencia de comportamientos de riesgo para ITS entre cortadores de caña de azúcar. La detección de estas infecciones en grupos de trabajadores rurales es esencial para la detección temprana de diagnóstico y para romper la cadena de transmisión.Objetivo: estimar a prevalência de Infecções Sexualmente Transmissíveis (IST) e fatores associados em cortadores de cana-de-açúcar. Método: estudo transversal, analítico, com 937 cortadores de cana-de-açúcar dos estados da Paraíba e de Goiás, no Brasil. Considerou-se como variável de desfecho a positividade em algum teste rápido para HIV, sífilis, hepatite B e C. Análises bivariada e múltipla foram realizadas para identificar associação entre essas infecções e variáveis sociodemográficas e comportamentais. Resultados: todos os participantes eram do sexo masculino, a maioria eram adultos jovens e possuíam baixa escolaridade. Estimou-se uma prevalência para IST de 4,1%(IC 95%: 3,0-5,5). De acordo com a análise de regressão múltipla, variáveis como idade acima de 40 anos (OR 5,0; IC 95%: 1,8-14), consumo de álcool (OR 3,9; IC 95%: 1,3-11,9) e de drogas ilícitas (OR 2,9; IC 95%: 1,3-6,3) foram fatores associados às IST investigadas. Por outro lado, ter alguma religião (OR 0,4; IC 95%: 0,2-0,8) e trabalhar na Região Centro-Oeste (OR 0,4; IC 95%: 0,2-0,9) foram fatores associados negativamente a essas infecções. Conclusão: presença de comportamentos de risco para as IST entre os cortadores de cana-de-açúcar. O rastreio destas infecções em grupos de trabalhadores rurais é fundamental para diagnóstico precoce e quebra da cadeia de transmissão

Glaucoma E Depressão: Uma Mini-Revisão De Literatura

Inúmeros são os estudos que confirmam que há uma relação entre glaucoma, comprometimento da qualidade de vida e depressão. Na grande maioria deles, dados confirmam que indivíduos acometidos com glaucoma têm qualidade de vida reduzida e estão mais propensos a desenvolver depressão, considerada causa importante de incapacidade. O objetivo desse estudo é determinar a associação entre Glaucoma e qualidade de vida, com enfoque em quadros clínicos de Depressão. Foi realizada uma minirevisão de literatura tendo como referência as bases de dados PubMed e Scielo, utilizando como descritores os termos "glaucoma", "depressão", "qualidade de vida" e "comorbidades". Foi utilizado o booleano “AND” para a pesquisa dos artigos e foram selecionados cinco artigos ao todo. Os escolhidos devem ser datados dos últimos 8 anos e tratar da temática de forma integrada, foram excluídos aqueles que abordavam os descritores isoladamente. Os resultados demonstram uma relação entre a perda de acuidade visual e a diminuição da qualidade de vida, além disso o glaucoma também esteve associado com o desenvolvimento de depressão. A idade avançada, o sexo feminino, a baixa renda, o uso abusivo de substâncias e morar sozinho foram outros fatores de risco para o desenvolvimento de depressão, enquanto o uso de colírios betabloqueadores não foi considerado fator de risco. Conclui-se que o glaucoma afeta consideravelmente a qualidade de vida, seja pela dificuldade adquirida por conta da diminuição da acuidade visual, seja pelo aumento da probabilidade de desenvolver comorbidades como a depressão, por isso é imprescindível o diagnóstico e tratamento precoce para evitar a progressão da doença

Spontaneous perirenal hematoma in a lupic patient on haemodialysis treatment and with renal cysts

The spontaneous perirenal hemorrhage usually presents as sudden pain in the side ipsilateral, no history of trauma. Acquired cystic kidney disease is a common finding in chronic hemodialysis patients. However, spontaneous bleeding from the rupture of the cyst is a rare clinical entity. We describe the case of a female patient, 45 years old, with controlled hypertension for 8 years, chronic renal failure for 15 years and lupus nephritis 2 years ago, undergoing hemodialysis three times a week since 2006, and who presented concurrently acquired cystic kidney disease. She was admitted to the emergency department complaining of sudden onset of pain in the thoraco-abdominal left. Perirenal hematoma was diagnosed by ultrasound and computed tomography of the abdomen. The patient underwent embolization of left renal artery, with good evolution.A hemorragia perirrenal espontânea apresenta-se mais comumente como dor súbita no flanco ipsilateral, sem história de trauma. A doença renal cística adquirida é um achado frequente em pacientes sob tratamento hemodialítico crônico. Entretanto, a hemorragia espontânea proveniente da ruptura dos cistos é uma entidade clínica rara. Descrevemos o caso de uma paciente do sexo feminino, 45 anos, portadora de hipertensão arterial sistêmica controlada há 8 anos, de insuficiência renal crônica por 15 anos e de nefrite lúpica há 2 anos, em tratamento hemodialítico três vezes por semana desde 2006, e que apresentava concomitantemente doença renal cística adquirida. Foi admitida no setor de emergência queixando-se de aparecimento súbito de dor em região toracoabdominal esquerda. Diagnosticou-se hematoma perirrenal por meio de ultrassonografia e tomografia computadorizada de abdômen. A paciente foi submetida à embolização da artéria renal esquerda, com boa evolução.Escola Paulista de MedicinaUNIFESP, EPMSciEL

Relato de experiencia: promoción a la lactancia materna

Nos últimos anos, o Brasil tem progredido em relação às ações de promoção, proteção e apoio ao aleitamento materno exclusivo, tendo em vista seus crescentes índices no país e redução do desmame precoce. A extensão universitária pode atuar como importante instrumento na busca de melhores condições de saúde e alimentação materno-infantil. Este trabalho objetivou relatar as experiências de um projeto de extensão voltado à promoção do aleitamento materno desenvolvido a partir de uma formação, preparo teórico e prático na temática aleitamento materno, com posterior inserção de alunos em uma maternidade pública. Buscou-se a escuta ativa, multidisciplinar e humanística, além de possibilitar uma formação diferenciada desses alunos.   In recent years, Brazil has made progress in terms of actions to promote, protect, and support exclusive breastfeeding, as evidenced by the growing rates in the country and the reduction of early weaning. University extension can act as an important instrument in the search for better health conditions and mother-child feeding. The present work reports the experiences of an extension project to promote breastfeeding, involving preparatory theoretical and practical training on the theme of breastfeeding, with subsequent placement of students in a public maternity hospital. The work aimed to promote active, multidisciplinary, and humanistic interactions, in addition to enabling the provision of differentiated training for the students.  En los últimos años, Brasil ha avanzado en las acciones de promoción, protección y apoyo a la lactancia materna exclusiva, en vista de las tasas de crecimiento en el país y la reducción del destete temprano. La extensión universitaria puede actuar como un instrumento importante en la búsqueda de mejores condiciones de salud y alimentación materno-infantil. Este trabajo tuvo como objetivo relatar las experiencias de un proyecto de extensión orientado a promover la lactancia materna desarrollado a partir de la formación, preparación teórica y práctica en el tema de la lactancia materna, con posterior inclusión de estudiantes en una maternidad pública. Se buscó la escucha activa, multidisciplinar y humanística, además de posibilitar una formación diferenciada para estos estudiantes.

Planta de hidrotratamento de gasóleos diesel S10

Trabalho de Conclusão de Curso (graduação)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2019.O projeto em questão consiste numa planta de dessulfurização de gasóleo obtido por destilação atmosférica de petróleo. A planta foi projetada com o intuito de ser anexada a uma refinaria já operante, com foco em atender a legislação ambiental, reduzindo o teor de compostos sulfurados a 10 ppm e nitrogenados a 200 ppm. A planta consiste resumidamente em três partes: uma unidade de dessulfurização a partir do hidrotratamento de Gasóleo com reciclo de gás rico em Hidrogênio, uma unidade de reaproveitamento de gás rico em gás Hidrogênio e outra unidade de destilação do gasóleo (stripping), a fim de separá-lo dos componentes leves que estavam a ele misturados

Associação entre a ooforectomia bilateral precoce e o desenvolvimento do parkinsonismo e Doença de Parkinson em mulheres na pré-menopausa

O parkinsonismo é um distúrbio do sistema nervoso de maior incidência masculina do que feminina, visto que, por mecanismos fisiológicos, o estrogênio possui efeitos neuroprotetores, com funções como aumento da dopamina, um neurotransmissor essencial para o controle das funções motoras. Além disso, previne a formação dos corpúsculos de Lewy e da agregação da α-sinucleína, responsáveis pela progressão da Doença de Parkinson. Por isso, a doença se apresenta diferentemente nas mulheres. A remoção cirúrgica de ambos os ovários em mulheres na pré-menopausa para a prevenção do câncer de ovário parece favorecer o surgimento da doença, tendo em vista a perda da produção do hormônio protetor. Assim, o objetivo do estudo é analisar a associação entre a ooforectomia bilateral precoce e o desenvolvimento de parkinsonismo e Doença de Parkinson em mulheres na pré-menopausa. Trata-se de uma revisão bibliográfica sistemática, do tipo quantitativa, que utilizou as plataformas do PubMed, SciELO e Cochrane Library como bases de dados para seleção dos artigos, todos na língua inglesa. Foram utilizadas literaturas publicadas com recorte temporal de 2017 a 2022. De acordo com as literaturas analisadas, a ooforectomia bilateral precoce em mulheres na pré-menopausa aumenta o risco do desenvolvimento de parkinsonismo. Desse modo, a diminuição dos procedimentos cirúrgicos profiláticos para câncer de ovário nas pacientes com risco médio de malignidade reduziria o risco dessa condição