Untersuchungen zu einem tumorrelevanten, FGF-bindenden Protein (FGF-BP)

Die nahezu ubiquitär vorkommenden Wachstumsfaktoren FGF-1 und FGF-2 spielen neben ihren physiologischen Funktionen auch eine wichtige Rolle beim Wachstum vieler neoplastischer Erkrankungen. Allerdings werden FGF-1 und FGF-2 nach ihrer Sekretion aus der Zelle in der extrazellulären Matrix immobilisiert und dadurch daran gehindert, ihre Wirkung durch das Binden an spezifische extrazelluläre Rezeptoren zu entfalten. Ein sekretiertes Protein, FGF-Bindeprotein (FGF-BP), bindet reversibel und nicht-kovalent an FGF-1 und FGF-2, löst sie aus der extrazellulären Matrix und ermöglicht ihnen so, mit ihren Rezeptoren zu interagieren. Gerade bei neoplastischen Erkrankungen kommt dieser FGF-BP-vermittelten Aktivität von FGF-1 und FGF-2 eine Schalterfunktion bei der Wachstumsförderung von Tumoren, auch bedingt durch die Induktion der Angiogenese, zu. Diese zentrale regulierende Rolle von FGF-BP in malignen Erkrankungen macht es zu einem eventuell vielversprechenden therapeutischen bzw. diagnostischen Ansatzpunkt in der Krebsbehandlung. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte die biologische Aktivität von exogen zugesetztem rekombinantem FGF-BP auf Tumor- bzw. Endothel-Zelllinien näher definiert werden. Hierzu wurde rekombinantes, gereinigtes FGF-BP mittels eines Baculovirus-Expressions-System in Insektenzellen gewonnen (Bv-(FGF-BP)), die Suspensionskultur für dieses System etabliert und gezeigt, dass diese der Adhäsionskultur in Bezug auf Effizienz und Aufwand überlegen ist. Die parakrine, FGF-2-abhängige Bioaktivität des rekombinanten Bv-(FGF-BP) wurde mittels eines Softagar-Assays mit SW-13-Nebennieren-Karzinom- und DU-145-Prostata-Karzinom-Zellen nachgewiesen. Durch den Zusatz von Bv-(FGF-BP) konnte eine deutliche Steigerung der Wachstumsaktivität dieser Tumorzellen erreicht werden, welche sich durch den Zusatz von FGF-2-Antikörpern komplett blockieren ließ. Auch das Wachstum von HUVECs, humanen venösen Nabelschnur-Endothelzellen, konnte in Proliferations-Assays durch Bv-(FGF-BP) beschleunigt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass FGF-BP das Wachstum von Tumoren auf zwei verschiedene Arten anregt: direkt durch Stimulation der Tumorzellen und indirekt durch die Förderung der Blutversorgung des Tumors. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollten die abnorme Molmasse des vollständigen, rekombinanten Bv-(FGF-BP) und das Auftreten höhermolekularer kovalenter FGF-BP-Komplexe, die auch schon in anderen Arbeiten beschrieben worden waren, untersucht werden. Nachdem eine mögliche Glykosilierung als Ursache für die zu hohe Molmasse ausgeschlossen werden konnte, wurden FGF-BP und FGF-2 in Insektenzellen koexprimiert, um Hinweise auf ein eventuelle intrazelluläre Komplexbildung zu erhalten. Trotz erfolgreicher Koexpression wurde unter den gewählten Bedingungen keine Komplexbildung beobachtet. Im dritten Teil gelang es erstmals, endogen exprimiertes FGF-BP mittels Immunhistochemie auf Prostata-Karzinom-Schnitten nachzuweisen und zu quantifizieren. Hierbei wurde bei allen 129 Schnitten von 88 Patienten eine immunhistochemische Reaktion beobachtet. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben weiteren Aufschluss über die biologische Wirkung von FGF-BP, zeigen seine FGF-2-vermittelte, duale wachstumssteigernde Wirkung auf Tumoren und beweisen dessen Expression im Prostatakarzinom. Diese Erkenntnisse unterstreichen die mögliche Bedeutung dieses Proteins als therapeutisches Zielmolekül

The Fibroblast Growth Factor-binding Protein (FGF-BP) and the Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2): functional studies on two gene products relevant in Ovarian cancer

Ovarialkarzinome gehören zu den weitverbreitetsten und lebensgefährlichsten gynäkologischen Tumoren mit bislang begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Ein besseres Verständnis der genetischen Änderungen in der Pathogenese des Ovarialkarzinoms ist von entscheidender Bedeutung. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Genprodukte analysiert: das Fibroblasten-Wachstumsfaktor-bindende Protein (FGF-BP) und der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (HER-2). FGF-BP ist ein Heparin-bindendes Protein, das mit FGFs wechselwirkt, sie von der extrazellulären Matrix freisetzt und folglich eine bedeutende Rolle in der extrazellulären FGF-Bioaktivität spielt. In dieser Doktorarbeit wurde mittels immunhistochemischer Untersuchungen an Tissue Microarrays (TMAs) erstmals gezeigt, dass FGF-BP in 40% aller Ovarialkarzinome überexprimiert ist. Da keines der normalen Ovarialgewebe eine vergleichbar starke immunhistochemische Färbung zeigte, deuten diese Daten an, dass die Überexpression von FGF-BP eine bösartige phänotypische Eigenschaft des Ovarialkarzinoms darstellen kann. Um die molekularen Mechanismen der FGF-BP-Wirkung weiter zu untersuchen, wurde konfokale Mikroskopie eingesetzt. Abhängig von der Zellinie war FGF-BP entweder im Zytoplasma lokalisiert und wurde durch einen klassischen Sekretionsweg über ERGIC sekretiert, oder es wurde, trotz eines klassischen Signalpeptides, eine nukleäre Lokalisation gefunden. Bei der Koexpression mit nukleärem FGF-2 wurde interessanterweise das zytoplasmatische FGF-BP in den Zellkern transloziert und eine nukleäre Kolokalisation von FGF-BP und FGF-2 beobachtet. Zusätzlich wurde die Abhängigkeit der zellulären Aufnahme von exogenem FGF-BP von der Expression und Interaktion mit FGF-2 demonstriert. Verschiedene Verkürzungsmutanten des FGF-BP zeigten, dass Verkürzungen am C-terminalen Ende keinen Effekt auf die subzelluläre Lokalisation und FGF-2-Wechselwirkung haben, während bei N-terminalen Verkürzungsmutanten die nukleäre Kolokalisation und Interaktion des FGF-BP mit FGF-2 nicht mehr auftrat. In Proliferationsassays wurde beobachtet, dass die biologischen Effekte von FGF-BP von der jeweiligen Zellinie abhängen. Während in SW-13-Nebennierenkarzinom-Zellen die konstitutive Expression des FGF-BP Zellproliferation induzierte, wurde in COS-7 Zellen ein Proliferations-hemmender Effekt demonstriert. Außerdem unterblieb in Soft Agar-Assays bei N-terminalen Verkürzungsmutanten in SW-13-Zellen die FGF-BP-vermittelte Stimulation der Kolonienbildung, während bei C- und N-terminalen Verkürzungsmutanten in COS-7-Zellen der hemmende Effekt des FGF-BP auf die Zellproliferation aufgehoben wurde. Die durch FGF-2 vermittelte Induktion des Zellwachstums in den FGF-Rezeptor-positiven COS-7-Zellen wurde durch endogene Expression oder exogene Zugabe des FGF-BP inhibiert. Zusätzlich zu seiner bereits beschriebenen extrazellulären Rolle entfaltet FGF-BP somit auch intrazelluläre, nukleäre Funktionen. Insbesondere zeigt FGF-BP, abhängig von der jeweiligen Zellinie, hemmende oder stimulierende Aktivitäten, die offensichtlich auf der Wechselwirkung mit FGF-2 im Zellkern beruhen. HER-2 gehört zur Familie der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren und spielt eine wichtige Rolle in menschlichen Tumoren. Die klinischen und experimentellen Daten bezüglich der Effekte der HER-2-Überexpression auf die zelluläre Sensitivität von Tumoren gegenüber Chemotherapie sind jedoch widersprüchlich, insbesondere, ob eine erhöhte HER-2-Expression zu einer höheren Resistenz oder einer erhöhten Sensitivität von Tumoren führt. Dies gilt besonders für Ovarialkarzinome und Ovarialkarzinom-Zellinien, in denen HER-2-Überexpression zu einem hohen Prozentsatz gefunden wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle der HER-2-Expression und HER-2-vermittelten Signaltransduktion in der zellulären Resistenz gegenüber Paclitaxel und rViscumin untersucht. Die Behandlung von SKOV-3-Zellen mit zwei neu entwickelten niedermolekularen HER-2-Tyrosinkinase-Inhibitoren führte zu erhöhter zellulärer Resistenz gegenüber Paclitaxel. Diese Daten bestätigten vorherige Ergebnisse bezüglich der Behandlung mit Anti-HER-2 Antikörpern (Herceptin), die in der Tumortherapie etabliert sind. Anhand verschiedener SKOV-3-Zellinien mit ribozymbedingt verminderter HER-2-Expression wurde ein „HER-2-Gen-Dosis-Effekt“ etabliert, während Doxorubicin- und Cisplatin-Zytotoxitäten unverändert blieben. Zur näheren molekularen Charakterisierung der zugrundeliegenden Mechanismen dieses Effektes wurden Paclitaxel- oder HER-2-vermittelte Veränderungen in der Phosphorylierung der MAP-Kinasen p42/p44, der stress-activated protein kinase/Jun-terminal kinase SAPK/JNK und der p38 MAP-Kinase, sowie des Effekts auf die Aktivierung von Caspase-3 und Caspase-7 und bcl-2 analysiert. Die Aktivierung der MAP-Kinasen war abhängig von der HER-2-Expressions, aber änderte sich nicht unter Paclitaxel-Behandlung. Eine beobachtete Paclitaxel-induzierte bcl-2-Phosphorylierung und -Hyperphosphorylierung war HER-2-unabhängig. Schließlich wurde gezeigt, dass Paclitaxel in SKOV-3 Zellen über einen Caspase-unabhängigen Weg Apoptose induziert. Die selektive HER-2-Reduktion durch Ribozyme-Targeting führte in SKOV-3-Zellen auch zur Verminderung der Sensitivität gegenüber dem rekombinanten zytostatischen Mistellektin rViscumin. Wiederum wurde eine „HER-2-Gen-Dosis“-abhängige Sensitivität der Zellen gegenüber rViscumin beobachtet, die nicht durch eine geänderte zelluläre rViscumin-Bindung oder -Internalisierung vermittelt wird. Die Analyse der zugrundeliegenden molekularen Effekte zeigte, dass die Mitglieder der MAPK-Familie p42/p44, SAPK/JNK und p38 in HER-2- und rViscumin-konzentrationsabhängiger Weise aktiviert werden. Während keine rViscumin-vermittelte Aktivierung der Caspasen-3 und -7 beobachtet wurde, zeigte sich eine HER-2-abhängige Herunterregulation des antiapoptotischen Moleküls bcl-2. Zusammenfassend konzentriert sich diese Arbeit auf zwei Krebs-relevante Gene. FGF-BP wird als neues mögliches Zielmolekül in Ovarialkarzinom-Therapie etabliert und bezüglich seiner intrazellulären Wirkmechanismen analysiert. Die hier vorgestellten Untersuchungen zeigen ferner neue Daten zur Rolle der HER-2-Expression bezüglich der Sensitivität von Ovarialkarzinomen gegenüber Zytostatika wie Paclitaxel oder rViscumin, was für die Bewertung der Wirksamkeit dieser Chemotherapeutika in der klinischen Verwendung relevant sein könnte

Auswirkung der intrazerebrovenrikulären Baclofenapplikation auf den arteriellen Blutdruck der Ratte

Einleitung: In dieser Arbeit sollte die Auswirkung der intrazerebroventrikulären Baclofenapplikation auf den arteriellen Blutdruck der Ratte untersucht werden. Methoden: Männliche Wistar-Ratten wurden mit Chloralhydrat anästhesiert. Die Arteria femoralis wurde punktiert, die Versuchstiere in ein Stereotaxiegestell eingespannt und eine Injektionskanüle in den lateralen Ventrikel positioniert. In einem 2-stündigen Vorlauf wurde der Blutdruck kontinuierlich registriert. Nach der Injektion von 1,5 µg Baclofen bzw. dem äquivalenten Volumen an Ringerlösung wurden die Blutdruckveränderungen erneut ca. 2 Stunden aufgezeichnet. Ergebnisse: Baclofen bewirkt in den ersten 10-15 min. einen nicht signifikanten systolischen und diastolischen Blutdruckabfall. Die max. Senkung des systolischen Blutdruckes war um 10%, die des diastolischen Blutdruckes um 9% höher als in der Kontrollgruppe. Zusätzlich konnte auch eine Stabilisierung des arteriellen Blutdruckes in der Baclofengruppe festgestellt werden. Schlussfolgerung: Baclofen bewirkt eine nicht signifikante Senkung des systolischen und diastolischen Blutdruckes. Nebenbei waren die Versuchstiere in der Baclofengruppe weniger Blutdruckoszillationen ausgesetzt

Resistenz von Brust- und Ovarialkarzinom-Zellen gegenüber Chemotherapeutika in Abhängigkeit von der Expression des HER-2 neu-Rezeptors

Der HER-2-Rezeptor, ein Tyrosinkinase-Rezeptor aus der ”Epidermal Growth Factor Receptor” (EGFR)-Familie, gilt in Brustkarzinomen als wichtiger Marker für ein aggressiveres Tumorwachstum, ein erhöhtes Metastasierungs-Potential und eine gesteigerte Chemoresistenz gegenüber verschiedenen Zytostatika. Ovarialkarzinome, in denen sich ebenfalls häufig eine Überexpression des HER-2-Rezeptors findet, sind sehr schlecht chemotherapeutisch zu behandeln, da sie schnell Resistenzen gegenüber Zytostatika entwickeln. Über den Einfluss des HER-2-Rezeptors auf die Chemoresistenz von Ovarialkarzinom-Zellen gibt es widersprüchliche Daten. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der HER-2-Expression auf die Resistenz gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika in Brust- und Ovarialkarzinomzellen untersucht. Hierzu wurde in SKOV-3-Ovarialkarzinom-Zellen die Expression des HER-2-Rezeptors mittels Ribozym-Targeting und klonaler Selektion inhibiert, und in MCF-7-Brustkarzinom-Zellen, zur Antagonisierung des HER-2-Rezeptors, eine dominant-negative HER-2-Rezeptormutante (HER-2-ECD) überexprimiert. Es konnte für MCF-7-Mammakarzinom-Zellen eine Abhängigkeit der Sensitivität gegenüber Paclitaxel und Topotekan von dem Expressionslevel der HER-2-ECD gezeigt werden. Diese war bei der Behandlung mit Paclitaxel auf Veränderungen im Zellzyklus zurückzuführen. Bei SKOV-3-Ovarialkarzinom-Zellen wurde anhand der unterschiedlich stark HER-2-exprimierenden Zellklone eine HER-2-Gendosis-Abhängigkeit der Chemoresistenz gegenüber Taxol und Topotekan demonstriert, die sich aber interessanterweise zu der von Mammakarzinom-Zellen gegenläufig verhält. Als ursächlich für diese Abhängigkeit der Chemoresistenz in SKOV-3-Ovarialkarzinom-Zellen vom HER-2-Expressionslevel und für den gegensätzlichen Verlauf, im Vergleich zu den Mammakarzinom-Zellen, konnten entscheidende Veränderungen in Apoptose-Induktion und Zellzyklus bestimmt werden. Bei der Behandlung der Ovarialkarzinom-Zellen mit Doxorubicin und Cisplatin und der Mammakarzinom-Zellen mit Vinblastin und Cisplatin konnte nachgewiesen werden, dass keinerlei Einfluss der HER-2-Rezeptor-Expression auf die Chemoresistenz gegenüber diesen Zytostatika besteht. Daher wurde weitergehend der Frage nachgegangen, ob eventuell dem Wirkmechanismus des Zytostatikums eine entscheidende Bedeutung bei der HER-2-Abhängigkeit der Resistenz zukommt. Hierbei zeigte sich, dass rViscumin, welches sich im Wirkmechansismus völlig von den anderen untersuchten Zytostatika unterscheidet, durch die Veränderung der HER-2-Expressionslevel deutlich in seiner zytostatischen Potenz auf SKOV3-Ovarialkarzinom-Zellen beeinflusst wurde. Es konnte auch hier die Abhängigkeit der Chemoresistenz der Zellen von der HER-2-Expression auf Veränderungen in der Apoptose-Induktion zurückgeführt werden. Die Untersuchungen dieser Arbeit ergaben somit, dass die Chemoresistenz von MCF-7-Mammakarzinom-Zellen und SKOV-3-Ovarialkarzinom-Zellen bei einigen Zytostatika von der HER-2-Expression abhängig ist. Sie führten aber zu der Schlussfolgerung, dass dies offensichtlich nicht auf alle Zytostatika verallgemeinert werden kann, sondern für jedes Zytostatikum individuell und außerdem tumorzellspezifisch gesehen werden muss. Dem Wirkmechanismus der Zytostatika kommt, wie diese Ergebnisse hier zeigen, keine entscheidende Bedeutung zu

Bericht des Präsidiums 2000 - 2001

The measurement of grain boundary migration in pure Al bicrystals by X-ray continuous interface tracking is introduced. This method provides information on the mobility of specific grain boundaries without interfering with the process of migration. Moreover, the effect of hydrostatic pressure on grain boundary migration was investigated. Several topics of grain boundary motion relevant to microstructure and texture evolution by recrystallization and grain growth were addressed. It was found that the maximum growth rate misorientation changes with temperature from the exact ∑7 orientation relationship to a 40.50°<111> rotation. This behavior is of concern for recrystallization texture evolution. The effect of material purity on grain boundary migration is shown not to be confined to drag effects but also to involve changes of grain boundary structure. From the activation volume of grain boundary mobility it has to be concluded that at least <110> tilt boundaries move by cooperative motion (group mechanism) of atoms in the boundary

Dopamine-modulated dynamic cell assemblies generated by the GABAergic striatal microcircuit

The striatum, the principal input structure of the basal ganglia, is crucial to both motor control and learning. It receives convergent input from all over the neocortex, hippocampal formation, amygdala and thalamus, and is the primary recipient of dopamine in the brain. Within the striatum is a GABAergic microcircuit that acts upon these inputs, formed by the dominant medium-spiny projection neurons (MSNs) and fast-spiking interneurons (FSIs). There has been little progress in understanding the computations it performs, hampered by the non-laminar structure that prevents identification of a repeating canonical microcircuit. We here begin the identification of potential dynamically-defined computational elements within the striatum. We construct a new three-dimensional model of the striatal microcircuit's connectivity, and instantiate this with our dopamine-modulated neuron models of the MSNs and FSIs. A new model of gap junctions between the FSIs is introduced and tuned to experimental data. We introduce a novel multiple spike-train analysis method, and apply this to the outputs of the model to find groups of synchronised neurons at multiple time-scales. We find that, with realistic in vivo background input, small assemblies of synchronised MSNs spontaneously appear, consistent with experimental observations, and that the number of assemblies and the time-scale of synchronisation is strongly dependent on the simulated concentration of dopamine. We also show that feed-forward inhibition from the FSIs counter-intuitively increases the firing rate of the MSNs. Such small cell assemblies forming spontaneously only in the absence of dopamine may contribute to motor control problems seen in humans and animals following a loss of dopamine cells. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved

Capability Driven Development: An Approach to Designing Digital Enterprises

The need for organizations to operate in changing environments is addressed by proposing an approach that integrates organizational development with information system (IS) development taking into account changes in the application context of the solution. This is referred to as Capability Driven Development (CDD). A meta-model representing business and IS designs consisting of goals, key performance indicators, capabilities, context and capability delivery patterns, is being proposed. The use of the meta-model is validated in three industrial case studies as part of an ongoing collaboration project, whereas one case is presented in the paper. Issues related to the use of the CDD approach, namely, CDD methodology and tool support are also discussed

The synthetic peptide P111-136 derived from the C-terminal domain of heparin affin regulatory peptide inhibits tumour growth of prostate cancer PC-3 cells

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Heparin affin regulatory peptide (HARP), also called pleiotrophin, is a heparin-binding, secreted factor that is overexpressed in several tumours and associated to tumour growth, angiogenesis and metastasis. The C-terminus part of HARP composed of amino acids 111 to 136 is particularly involved in its biological activities and we previously established that a synthetic peptide composed of the same amino acids (P111-136) was capable of inhibiting the biological activities of HARP. Here we evaluate the ability of P111-136 to inhibit <it>in vitro </it>and <it>in vivo </it>the growth of a human tumour cell line PC-3 which possess an HARP autocrine loop.</p> <p>Methods</p> <p>A total lysate of PC-3 cells was incubated with biotinylated P111-136 and pulled down for the presence of the HARP receptors in Western blot. <it>In vitro</it>, the P111-136 effect on HARP autocrine loop in PC-3 cells was determined by colony formation in soft agar. <it>In vivo</it>, PC-3 cells were inoculated in the flank of athymic nude mice. Animals were treated with P111-136 (5 mg/kg/day) for 25 days. Tumour volume was evaluated during the treatment. After the animal sacrifice, the tumour apoptosis and associated angiogenesis were evaluated by immunohistochemistry. <it>In vivo </it>anti-angiogenic effect was confirmed using a mouse Matrigel™ plug assay.</p> <p>Results</p> <p>Using pull down experiments, we identified the HARP receptors RPTPβ/ζ, ALK and nucleolin as P111-136 binding proteins. <it>In vitro</it>, P111-136 inhibits dose-dependently PC-3 cell colony formation. Treatment with P111-136 inhibits significantly the PC-3 tumour growth in the xenograft model as well as tumour angiogenesis. The angiostatic effect of P111-136 on HARP was also confirmed using an <it>in vivo </it>Matrigel™ plug assay in mice</p> <p>Conclusions</p> <p>Our results demonstrate that P111-136 strongly inhibits the mitogenic effect of HARP on <it>in vitro </it>and <it>in vivo </it>growth of PC-3 cells. This inhibition could be linked to a direct or indirect binding of this peptide to the HARP receptors (ALK, RPTPβ/ζ, nucleolin). <it>In vivo</it>, the P111-136 treatment significantly inhibits both the PC-3 tumour growth and the associated angiogenesis. Thus, P111-136 may be considered as an interesting pharmacological tool to interfere with tumour growth that has now to be evaluated in other cancer types.</p