Aspectos fisiológicos e fitossanitários na micropropagação para a obtenção de alho-semente livre de vírus

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2012Com uso intensivo de mão-de-obra, tecnologia e capital, a cultura do alho no Brasil tem viabilizado a pequena e média propriedade nas principais regiões produtoras, sendo portanto, de grande importância sócio-econômica. O alho (Allium sativum L.), por ser propagado vegetativamente, facilita a disseminação de patógenos, como vírus, favorecendo o aparecimento de doenças complexas, pelo acúmulo de diferentes espécies virais numa mesma planta, acarretando diminuição da produtividade e da qualidade do produto. Uma das técnicas mais utilizadas para limpeza clonal de alho é a cultura de meristemas. Apesar de muito utilizada para eliminação de viroses, percebe-se que há uma deficiência nos protocolos atualmente utilizados no que se refere à qualidade da semente produzida. Isto pode estar ligado aos fatores fisiológicos, fitossanitários e, principalmente, à inexistência de estudos para o desenvolvimento de protocolos de limpeza clonal mais eficientes. O presente trabalho teve como objetivos: (i) estudar o padrão de organização morfológica da bulbificação em alho, descrevendo os efeitos dos fatores envolvidos nesse processo; (ii) estudar a morfogênese de plantas de alho in vitro através de avaliações de componentes de meios de cultura e de fatores ambientais que afetam a indução de bulbos; (iii) avaliar as alterações de substâncias endógenas durante o crescimento das plantas e seus efeitos sobre o processo de bulbificação; e (iv) desenvolver um método de crioterapia para remoção do complexo viral do alho a partir do estabelecimento de um protocolo de criopreservação. No Capítulo I, além de um estudo do padrão morfológico da bulbificação, é apresentada uma revisão atualizada dos temas abordados no trabalho com o referencial teórico e as informações disponíveis até o presente. Para o estudo da morfogênese de plantas de alho in vitro foram avaliados os efeitos de tipos e concentrações de reguladores de crescimento e de carboidratos, de períodos de vernalização dos explantes, e os efeitos dos regimes de temperatura e fotoperíodo sobre a diferenciação de gemas de bulbos. As dosagens dos níveis endógenos de Ácido Absíciso e açúcares solúveis totais foram realizadas por testes imunoenzimático-ELISA e pela técnica colorimétrica fenol-sulfúrico, respectivamente. O desenvolvimento do protocolo de criopreservação foi efetuado mediante exposição de ápices caulinares nas soluções de vitrificação PVS2 e PVS3. Posteriormente, a solução com melhor desempenho foi utilizada para crioterapia. A crioterapia foi comparada com os métodos tradicionais de limpeza de vírus em alho. Os resultados aqui apresentados mostram evidências de que plantas de alho cultivadas in vitro também apresentam respostas morfogenéticas para a diferenciação e desenvolvimento de bulbilhos do tipo termo-fotoperiódico dependente. Ficou evidenciado que o tempo de exposiçaõ ao frio reduz a sensibilidade ao fotoperíodo para a indução da bulbificação. Os resultados sugerem a participação do Ácido Abscísico e dos carboidratos solúveis, respectivamente, como agentes inibidores e indutores da bulbificação, em resposta à estímulos climáticos como temperatura e fotoperíodo. Para identificar a real importância desses compostos nesse processo, sugere-se um estudo minucioso da histodiferenciação de bulbos para identificar com maior precisão o momento exato da diferenciação durante a ontogênese das plantas. A solução de vitrificação PVS3 proporcionou a maior taxa de sobrevivência de explantes criopreservados, e foi utilizada no tratamento de crioterapia para erradicação do complexo viral do alho. Entre os diferentes métodos de limpeza de vírus avaliados neste trabalho, a crioterapia de ápices caulinares, associada ou não com a termoterapia, apresentou a maior taxa de eliminação de Onion yellow dwarf virus (OYDV), Garlic common latent virus (GCLV) e, principalmente de Leek yellow stripe virus (LYSV), ausente em 100% das amostras sobreviventes. A imunolocalização de OYDV revelou a presença do vírus em quase todas as partes do ápice caulinar, incluindo a porção distal do domo meristemático e os primórdios foliares. A distribuição dessa espécie de vírus em tecidos de ápices caulinares de alho pode estar associada com o desenvolvimento de plasmodesmos e sua capacidade de dar suporte a sua circulação. Apoiado nessas observações, sugere-se que Onion yellow dwarf virus (OYDV) invade eficientemente as células de ápices caulinares de alho. Os resultados obtidos a partir desse trabalho de tese ampliam a base científica e permitem aprofundar a compreensão dos fatores associados a morfogênese de plantas de alho in vitro. O estabelecimento de um protocolo completo de criopreservação de alho se configura em uma ferramenta para erradicação de viroses em plantas de alho e, sobretudo, para o estabelecimento de um programa de conservação de germoplasma dessa espécie. Abstract : With the intensive use of labor, technology and capital, the culture of garlic in Brazil has enabled the small and medium property in the main producing regions, thus being of a high socio-economic relevance. Garlic (Allium sativum L.), due to its vegetative propagation, facilitates the spread of pathogens, such as virus, favoring the outbreak of complex diseases, due to the accumulation of different virus species in the same plant. That entails the decrease of productivity and a decrease of the quality of the product. One of the most used techniques for pathogen removal from garlic is the culture of meristems. Even though it is widely used to eliminate viruses, it is easy to perceive that there are deficiencies in the protocols involving the quality of the produced seeds. This may be related to physiological and phytosanitary factors, and also to the lack of studies developing more efficient protocols for pathogen removal. This study has the following objectives: (i) to study the pattern of the morphological organization of garlic bulbing, describing the effects of the factors involved within the process; (ii) to study the morphogenesis of in vitro garlic plants through assessments of the components of the growing medium and the environmental factors that affect bulbing induction; (iii) to assess the changes of endogenous substances during the growth of the plants and their effects on the bulbing process; and (iv) to develop a method of cryotherapy for viral complex removal in garlic, upon the establishment of a protocol for cryopreservation. In chapter I, alongside the study of the morphological pattern of bulbing, it is presented an updated review of the topics tackled within this work, with the theoretical framework and the information available up to the present. For the study of morphogenesis of in vitro garlic plants, it was carried out an assessment of the effects of different types and concentrations of growth regulators and carbohydrates, of the periods of vernalization of plantlets, and the effects of temperature regimes and photoperiods affecting the differentiation of bulb buds. The dosage of the endogenous levels of abscisic acid and total soluble sugars were carried out through immunoenzymatic-ELISA tests and through the colorimetric phenolsulfuric technique, respectively. The development of the protocol for cryopreservation was carried out through the exposure of the shoot tips to the vitrification solutions PVS2 and PVS3. Later, the solution with the best performance was used for cryotherapy. Cryotherapy were compared to the traditional methods for virus removal in garlic. The results reported here evidence that garlic plants grown in vitro also present morphogenetic answers to the differentiation and development of thermo- and photoperiod- dependent bulbils. It also became evident that the time of exposure to cold decreases the sensitivity to the photoperiod for bulbing induction. The results suggest that the abscisic acid and the soluble carbohydrates participate, respectively, as inhibiting agents and bulbing inductors, in response to climatic stimuli such as temperature and photoperiod. To identify the actual relevance of those compounds within this process, it is suggested a thorough study of bulb histodifferentiation in order to identify more precisely the exact moment of differentiation during the ontogeny of the plants. The solution of vitrification PVS3 provided a higher survival rate of cryopreserved plantlets, and it was used in the cryotherapy treatment to eradicate the viral complex from the garlic. Among the different methods for virus removal assessed in this work, the cryotherapy of garlic shoot tips, whether associated with thermotherapy or not, showed a higher frequency in the elimination of the Onion yellow dwarf Virus (OYDV), the Garlic common latent virus (GCLV) and mainly the Leek yellow stripe virus (LYSV), which was absent in 100% of the surviving samples. The immunolocalization of OYDV showed the presence of the virus in almost all parts of the shoot tip, including the distal portion of the meristematic dome and the leaf primordia. The distribution of this species of virus in shoot tip tissues of garlic may be associated with the development of plasmodesms and with its capability to give support to their circulation. Upon these observations, it is suggested that the Onion yellow dwarf virus (OYDV) efficiently invades the cells of the garlic shoot tips. The results achieved by this research project broaden the scientific basis and allow the deepening of the comprehension of the factors associated with the morphogenesis of in vitro garlic plants. The establishment of a complete protocol for the cryopreservation of garlic is a tool for the eradication of viruses in garlic plants and, above all, for the establishment of a program for preserving germplasm of this species

Caracterização genética dos acessos do banco ativo de germoplasma de alho (Allium sativum L.) de Santa Catarina

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais.A organização da variabilidade genética de acessos de alhos mantidos em Bancos de Germoplasma tem sido bastante investigada com marcadores morfológicos e isoenzimáticos. Porém, a informação obtida com esses marcadores tem sido considerada inadequada, devido ao pequeno número de marcadores disponíveis e a pequena porção genômica acessada, respectivamente. Os marcadores genéticos baseados na análise direta da molécula de DNA, como RAPDs e AFLPs, permitem acesso a uma ampla região, distribuída ao acaso, devido sua capacidade multiplex e alto nível de polimorfismo detectado. O presente trabalho apresenta os resultados referentes (i) a avanços metodológicos e adequação de protocolos que possibilitaram o uso de descritores morfológicos e marcadores isoenzimáticos, RAPD e AFLP, (ii) e a caracterização da diversidade genética acompanhada da análise de agrupamento dos acessos do Banco Ativo de Germoplasma de Allium sativum L. de Santa Catarina. Constatou-se através de análise multivariada que 10 descritores morfológicos, dos 17 utilizados, foram de grande importância para caracterização dos 96 acessos de alho. A análise isoenzimática revelou que as cultivares comerciais apresentaram cinco padrões diferenciados. Entre as 20 cultivares avaliadas o percentual de locos polimórficos (P) variou de 0 a 57,1, sendo o valor médio 13,6%. No protocolo otimizado para a técnica RAPD, 16% dos iniciadores testados amplificaram um total de 47 bandas sendo que dessas, 25 revelaram polimorfismo. O maior avanço obtido na adaptação de protocolo da técnica AFLP foi a identificação de três novas combinações de iniciadores, e sua utilização pela primeira vez na análise de Alium sativum. Do grupo de 76 acessos de alho crioulo, apenas 25 foram considerados inequivocadamente como genótipos distintos. Em todas as análises, as 20 cultivares comerciais foram separadas em sete grupos de similaridade, sendo detectado apenas duas cultivares potencialmente duplicadas, uma de origem nacional e a outra de origem Chinesa. Assim, as principais conclusões deste trabalho foram: a) apesar da espécie em foco ser de propagação praticamente assexuada, os valores de heterozigosidade encontrados na análise de isoenzimas, sugerem que existe uma quantidade razoável de variabilidade genética entre os acessos; b) a utilização das técnicas moleculares mais modernas, pode possibilitar maior grau de segurança na discriminação, e conseqüentemente na recomendação desses genótipos, para atender as diversas regiões climáticas e c) o uso de marcadores moleculares se mostrou adequado neste estudo e, a possibilidade de obtenção de sementes botânicas de alho, abre espaço para o uso dessa técnica como suporte para a ampliação das atividades dos programas de melhoramento através de cruzamentos, aproveitando a variabilidade das linhagens segregantes

A Relação entre Direito Interno e Direito Internacional: Os Impactos no Cotidiano Jurídico Brasileiro sob a Perspectiva da Ampliação do Bloco de Constitucionalidade

The relationship between domestic law and international law, carried out by court decisions, is a recurring theme of both international human rights law and constitutional law. This article aims to portray the interactions between domestic law and international law, with emphasis on Brazil, taking into account the internal rules and judicial practice. Therefore, we will use the dogmatic method, which involves analyzing the rules on the subject in the international and domestic front, with empirical perspective, with a view to analysis of cases in which the issue was raised, in particular the possible existence constitu- tionality block and its growth because human rights treaties ratified by Brazil.A relação entre direito interno e direito internacional, efetivada por decisões judiciais, é um tema recorrente tanto do direito internacional dos direitos humanos quanto do direito constitucional. O presente artigo tem como finalidade retratar as interações entre o direito interno e o direito internacional, com ênfase no caso brasileiro, levando em consideração as normas internas e a prática judicial. Para tanto, será utilizado o método dogmático, que envolve a análise das normas relativas ao tema no cenário internacional e interno, com perspectiva empírica, tendo em vista a análise de casos em que a questão foi levantada. Neste tocante, será dada especial ênfase à temática do bloco de constitucionalidade e à sua ampliação derivada da inclusão dos tratados de direitos humanos ratificados pelo Brasil

Efeito da limpeza de vírus sobre a produtividade de alho em Caçador , SC

Objetivou-se com este trabalho determinar para as condições do Planalto Catarinense o efeito na produtividade total e comercial de bulbos em seis cultivares de alho livre de vírus, provenientes da cultura de meristema

Características distintas de isolados de Pepper yellow mosaic virus de tomate e pimentão

ABSTRACT: Determination of virus diversity in the field is vital to support a sustainable breeding program for virus resistance of horticultural crops. The present study aimed to characterize four field potyvirus isolates found naturally infecting sweet pepper (Capsicum annuum) (Sa66 and Sa115) and tomato (Lycopersicon esculentum) (IAC3 and Sa21) plants. Their biological characteristics revealed differences among the isolates in their ability to infect distinct Capsicum spp. and tomato genotypes, and in the severity of symptoms caused by these isolates compared to the infection caused by an isolate of Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). Absence of cross-reaction was found among the studied isolates with antiserum against Potato virus Y (PVY). However, all isolates reacted, at different intensities, with antiserum against PepYMV. All isolates showed high identity percentage (97 to 99%) of the amino acid sequence of the coat protein with PepYMV (accession AF348610) and low (69 to 80%) with other potyvirus species. The comparison of the 3' untranslated region also confirmed this finding with 97 to 98% identity with PepYMV, and of 47 to 71% with other potyviruses. The results showed that PepYMV isolates were easily differentiated from PVY by serology and that the host response of each isolate could be variable. In addition, the nucleotide sequence of the coat protein and 3' untranslated region was highly conserved among the isolates. __________________________________________________________________________________ RESUMOA determinação da diversidade de vírus no campo é vital para dar suporte a programas sustentáveis de melhoramento de hortaliças visando a obtenção de resistência genética a esses patógenos. Este estudo objetivou caracterizar quatro isolados de potyvírus encontrados infetando naturalmente plantas de pimentão (Capsicum annuum) Sa66 e Sa115, e tomateiro (Lycopersicon esculentum) IAC3 e Sa21. As características biológicas revelaram diferenças entre os isolados na abilidade de infetar diferentes genótipos de pimentão e tomateiro e na severidade de sintomas causados por estes isolados em comparação com a infecção resultante de um isolado de Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). Estudos sorológicos mostraram ausência de reação cruzada dos isolados estudados com anti-soro para Potato virus Y (PVY). Entretanto, todos os isolados reagiram, em intensidades diferentes, com anti-soro para PepYMV. Todos os isolados mostraram alta percentagem de identidade (97 a 99%) de sequência de amino ácidos da capa proteica com PepYMV (accesso AF348610) e baixa (69 a 80%) com outras espécies de potyvírus. A comparação da região 3' não traduzida também confirmou esta similaridade, com identidade de 97 a 98% com PepYMV e de 47 a 71% com outros potyvírus. Os resultados mostraram que os isolados de PepYMV foram facilmente diferenciados de PVY por sorologia, a resposta de hospedeiros a cada isolado pode ser variável e a sequência de nucletídeos da região terminal 3' foi altamente conservada entre os isolados

Avaliação do crescimento de plantas micropropagadas do porta-enxerto de macieira Marubakaido microbiolizadas com Pantoea agglomerans

This research aimed to evaluate the effect of the bacteria Pantoea agglomerans to promote growth ofmicropropagated apple rootstocks. The bacteria was multiplied in culture media 523 of Kado & Heskett and 24 hours later the bacterial suspension was prepared in NaCl 0.85% and adjusted in OD550 = 0.5, while for control, only saline solution was used. Micropropagated apple roostocks were microbiolized during 1 hour and transplantedin polystyrene trays containing substratum mixture Plantmax® and vegetable ash at the rate of 1:1 (v/v), plus 0.5ml of bacterial suspension applied in the soil for each seedling. After 30 days an increase of 29.61% in the survival of microbiolized seedlings, and an increment of 50% in the height was observed, when compared to the control. Regarding the fresh and dry weight, in the aerial part, the bacteria provided an increase of 53.09% and 52.94% and an increment of 103.28% and 66% for the root system, respectively. The bacteria Pantoea agglomeranspromotes growth of seedlings of Marubakaido micropropagated apple rootstock and may be indicated to inoculate plants produced by micropropagation.O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da bactéria Pantoea agglomerans sobre o crescimento de plantas micropropagadas do porta-enxerto de macieira Marubakaido. A bactéria foi multiplicada em meio decultura 523 de Kado & Heskett e após 24 horas preparou-se suspensão bacteriana em NaCl 0,85% ajustada em OD 550=0,5, enquanto para controle foi utilizada somente solução salina. Plantas micropropagadas foram microbiolizadas durante 1 hora e após foram transplantadas em bandejas de isopor contendo mistura de substrato Plantmaxâ e cinza vegetal na relação 1:1 (v/v), mais 0,5ml de suspensão bacteriana aplicada no colo da plântula. Aos 30 dias, após a transferência para o substrato, observou-se um aumento de 29,62% na porcentagem desobrevivência nas plantas microbiolizadas, além de um incremento de 50% na altura de plantas. Com relação à massa fresca e seca, a bactéria proporcionou aumento de 53,09% e 52,94% na parte aérea e um incremento de 103,28% e 66% no sistema radicular, respectivamente. A bactéria Pantoea agglomerans promove o crescimento deplantas do porta-enxerto de macieira Marubakaido micropropagadas

Migração de clipe “Hem-o-lok” após esofagectomia e reconstrução digestiva com tubo gástrico: relato de complicação pós-operatória rara / Hem-o-lok" clip migration after esophagectomy and gastric tube reconstruction: report of a rare postoperative complication

Clipes de hemostasia, como o “Hem-o-lok”, são utilizados em operações laparoscópicas, para ligadura de vasos e ductos. Eles apresentam vasta aplicabilidade e sua migração no pós-operatório é raramente observada. Relata-se caso de  paciente do sexo masculino, 64 anos, tabagista, submetido à radioquimioterapia, seguida de esofagectomia subtotal com reconstrução com tubo gástrico, no tratamento de carcinoma de células escamosas. Dois anos após cirurgia, paciente retornou com odinofagia e sensação de corpo estranho no esôfago. Endoscopia digestiva alta foi o método que diagnosticou a presença do clipe “Hem-o-lok”, utilizado no procedimento cirúrgico prévio. A retirada do clipe foi exitosa, sem complicações

Indução e desenvolvimento de bulbos de alho in vitro por meio da vernalização de bulbilhos e da variação do fotoperíodo

In vitro morphogenesis of garlic plants (Allium sativum L.) is controlled by substances added to culture media and by environmental factors. The objective of this study was to assess the effects of vernalization of bulbils and of photoperiod on the process of in vitro induction of garlic bulbs. Shoot meristems were excised from bulbils vernalized for periods of 0, 30, 60 and 90 days and cultivated in vitro either under conditions of short photoperiod (11h) or long photoperiod (16h). Regardless of the photoperiod they were exposed to, plants micropropagated from meristems extracted from those bulbils vernalized for 30 or 60 days showed a rate of bulbing of 100%. Interaction between photoperiod and temperature was detected only in bulb fresh weight and plant height, thus showing the dependence between these environmental factors in the micropropagation of garlic. The time of exposure of plants to cold decreases the sensitivity to photoperiod for bulbing induction. Garlic plants grown in vitro present morphogenetic answers to the induction and development of thermo and photoperiod-dependent bulbils.A morfogênese de plantas de alho (Allium satvum L.) in vitro é controlada por substâncias adicionadas ao meio de cultivo e por fatores ambientais. Este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da vernalização de bulbilhos e do fotoperíodo no processo de indução de bulbos de alho in vitro. Meristemas caulinares foram excisados de bulbilhos vernalizados por períodos de zero, 30, 60 e 90 dias e submetdos ao cultvo in vitro sob condições de fotoperíodo curto (11h) ou longo (16h). Independentemente do fotoperíodo a que foram expostas, as plantas micropropagadas a partr de meristemas extraídos de bulbilhos vernalizados por 30 a 60 dias apresentaram 100% de taxa de bulbifcação. Detectou-se interação entre fotoperíodo e temperatura apenas para massa fresca de bulbo e para altura de plantas, indicando, portanto, que há dependência entre essesfatores ambientais na micropropagação do alho. O tempo de exposição das plantas ao frio reduz a sensibilidade ao fotoperíodo para a indução da bulbifcação. As plantas de alho cultvadas in vitro apresentam respostas morfogenétcas positvas para a indução e o desenvolvimento de bulbos do tpo dependende de termofotoperíodo

The relative importance of forest cover and patch-level drivers for phyllostomid bat communities in the Amazonian Savannas

Context: Analyze the multiple dimensions of biodiversity under a local and landscape lens in natural habitats, such as Amazonian savannas, is fundamental for the conservation of species and ecosystems. Objectives: We aim to explore how landscape forest cover and patch-level variables affect the patterns of species abundance, functional traits, and taxonomic, functional and phylogenetic α-diversity of Phyllostomid bats in forest patches of the Savannas of Amapá, in both the wet and dry seasons. Methods: We used mist nets to survey bats in 26 forest patches. We also quantified forest cover in buffers of 500, 1000, 1500, 2000 and 2500 m around each patch, and tree height, basal area, canopy cover, and vegetation clutter in the understorey at the patch level. We used hierarchical partitioning to relate the different indices with our predictor variables. Results: Taxonomic, functional and phylogenetic diversity in the wet season increased with the proportion of forest cover in the 2500 m buffer. Vegetation clutter was negatively related to taxonomic and functional diversity in the wet season. In the dry season, average tree height positively affected taxonomic and functional diversity. Patch-level variables were more important than forest cover in explaining the average functional traits in both seasons. Conclusion: We found seasonal variation in the relationships between components of bat diversity and different drivers. Since both forest cover in the landscape and patch-level variables are important for Phyllostomid bat diversity, conservation plans should consider forest conservation at the landscape level and maintenance of forest patch qualityOpen Access funding provided thanks to the CRUE-CSIC agreement with Springer Nature. Part of the data used in this study was supported by Neotropical Grassland Conservancy (01098803-5), National Geographic Society (EC59186R-19 and NGS-83254R-20), Bat Conservation International (2434131) and Ruford Foundation (25585-1