Affinity purification and delivery of a p53-encoding plasmid DNA for gene mediated cancer therapy

Cancer is still one of the leading causes of death worldwide. In order to treat this scourge, gene therapy and DNA vaccination have been proposed as an alternative to the common treatments. Among the several gene abnormalities that could be responsible for the oncogenic process, the ones presented in p53 stands up. p53 is one of the most important tumour suppressor gene being considered the “genome guardian” since when occurs exposure to stressful stimuli it is activated through post-transcriptional modifications increasing its stability and activity. This gene is directly and indirectly implicated in different cellular functions, including DNA damage repair, cell cycle arrest in G1/S and apoptosis. Several studies shown that transfection of cancer cells with wild-type p53-expressing plasmids could directly drive cells into apoptosis and/or growth arrest, suggesting that a gene therapy approach for cancer treatment can be related to the re-establishment of the normal p53 function. Recently, the supercoiled (sc) conformation of a p53-encoding plasmid proved to be more efficient in cell transfection and protein expression than open circular conformation. Aiming to successfully isolate this bioactive isoform, several chromatographic techniques have been used, namely amino acids-based affinity chromatography. Concerning this chromatographic approach, in this doctoral work different amino acids like, Lmethionine, L-tyrosine, and arginine, were used to isolate the sc p53 encoding plasmid. From this work, it was achieved a better recovery yield and purity levels for O-Phospho-L-tyrosine when compared with L-methionine agarose matrix. Regarding the macroporous arginine resin, it was possible to recover the sc p53 encoding pDNA with high purity, and an increase of more than 50% in the dynamic binding capacity was achieved, when comparing with their homologous commercial agarose matrix. To understand the activity and the therapeutic effect induced by this sc isoform, different cell lines (HeLa, A549 and human dermal fibroblasts) were transfected with the pDNA purified either by the affinity purification strategy or with a commercial kit, for further in vitro evaluation. In particular, the cytotoxicity, the expression of the p53 transgene and the resulting apoptotic effect were evaluated in these in vitro cancer models. The results brought relevant information concerning the potential application of a sc p53 encoding plasmid in cancer gene therapy. To eliminate different cancer types, treatments must be applied systematically and therefore, must be targeted to cancer cells. Concerning this and, to enable an easy and safe systemic therapy, stable and non-viral gene vectors have been developed to encapsulate and deliver foreign genetic materials in specific cell types, such as cancerous cells. The use of non-viral vectors usually promotes low immune response, they are easily prepared, have a low production cost and also, they can be easily produced at large scale. Other important characteristic about these vectors is the ability to transfer different and large transgenes being also able to be stored for long periods due to their stability. Regarding this, in this doctoral work, chitosan (CH) and polyethyleneimine (PEI) were complexed with different plasmids in order to search for the suitable non-viral nanocomplex combination to be applied for gene therapy. Through the obtained results it was found that p53-encoding pDNA/PEI polyplexes demonstrate some toxicity in normal cells which could be a handicap for future therapeutic application of this nanocarriers. Also, from the track of the nanocarriers inside the cells, it was achieved a better transfection efficiency for the carriers delivering the smaller pDNA. The ability of the polyplexes to promote P53 protein expression was also evaluated using HeLa cancer cells and an increase of 54.2% and 32% of the P53 levels was achieved when CH and PEI nanocarriers were respectively applied. Overall, the scientific work performed in this thesis hopes to lead the scientific community to give more and more relevance to the use of the supercoiled pDNA isoform for gene therapy involving the reestablishment and restoration of the levels of p53. Moreover, it has been shown that the use of chromatography using specific amino acid ligands is a crucial factor in the final quality of the recovered sc pDNA sample, being this a predominant parameter for the accomplishment of the desired therapeutic results. Finally, the effort in the search and development of suitable non-viral vectors should stand up since it can guarantee the stability and activity of the sc p53 encoding plasmid during the delivery process.Introdução O cancro é uma das principais causas de morte em todo o mundo fazendo com que exista bastante investigação nesta área na tentativa de melhor compreender a doença e de desenvolver estratégias terapêuticas mais eficazes e seguras. Para o tratamento desta doença, a terapia génica e a vacinação com DNA foram propostas como alternativas às formas mais comuns de tratamento. Entre as várias alterações genéticas que podem ser responsáveis pelo processo oncogénico, estão incluídas as alterações relacionadas com a p53, nomeadamente em relação à sua expressão ou atividade. A p53 foi no passado considerada um oncogene no entanto, mais recentemente, provou-se que esta proteína é na realidade um supressor de tumor, muito poderoso envolvido em processos como a apoptose e a senescência. Esta “guardiã do genoma” atua sempre que as células são expostas a condições de stress, e alterações na estabilidade desta proteína podem resultar em instabilidade genómica. A p53 tem suscitado interesse em muitos grupos de investigação uma vez que está descrito que em 50% dos casos de cancro são identificadas mutações no gene que codifica a p53, enquanto os restantes 50% possuem componentes defeituosos na pós-tradução ou alterações nas vias de sinalização da p53. Diversos estudos demonstraram que a transfeção de células cancerígenas com o plasmídeo que codifica para a p53 pode direcionar as células para a apoptose e/ou para uma paragem no seu crescimento, sugerindo que uma abordagem relacionada com a terapia génica no tratamento do cancro pode promover o restabelecimento da função normal de p53. Portanto, é muito importante restabelecer a expressão e atividade da p53 em células cancerígenas. Neste sentido, a terapia génica tem já usado a possibilidade de induzir a expressão de p53, associando o gene que a codifica a vetores virais ou não-virais, nomeadamente com recurso ao DNA plasmídico (pDNA), como opção terapêutica promissora e alguns exemplos práticos já foram estudados e aplicados com sucesso. A utilização de vetores não-virais apresenta vantagens em relação ao uso de vetores virais, já que o processo de produção é mais simples, economicamente vantajoso, sendo os vetores menos imunogénicos e mais seguros. Recentemente, a isoforma superenrolada (sc) de um plasmídeo que codifica a p53 provou ser mais eficiente na transfeção celular e na expressão proteica do que a conformação circular aberta, e de facto esta isoforma tem-se destacado das outras isoformas por possuir uma estrutura extremamente compacta e funcional. Assim, o pDNA sc é considerado mais eficiente para induzir a expressão do produto alvo, quando comparado a outras variantes conformacionais, como o pDNA circular aberto (oc) e linear. A biossíntese recombinante de pDNA permite a produção de um extrato enriquecido com pDNA sc. No entanto este extrato é também composto por proteínas hospedeiras, RNA e outras estruturas de DNA, o que torna o processo de isolamento da isoforma sc do pDNA um requisito imperativo. Para atingir este objetivo, a cromatografia de afinidade usando aminoácidos como ligandos (ex.: arginina, histidina e lisina) tem vindo a ser utilizada com sucesso. No entanto, é essencial desenvolver e estudar novas matrizes com maior especificidade e robustez, permitindo maiores graus de pureza e rendimento do pDNA sc obtido. Desta forma, este trabalho prevê a produção e otimização de novas matrizes de afinidade que permitam promover interações mais específicas entre os ligandos e o pDNA sc de forma a estabelecer processos que nos permitam elevados rendimentos e também amostras com graus de pureza que se enquadrem dentro das especificações emitidas pelas entidades regulamentares tais como a Food and Drug Administration (FDA) e a European Medicines Agency (EMA). Após a obtenção de amostras altamente puras do vetor que codifica para a p53 é importante garantir uma entrega eficiente deste plasmídeo. Para tal neste trabalho foram também testadas nanopartículas tendo como finalidade não só a proteção do material genético que se pretende entregar (a isoforma sc do pDNA que codifica para a p53) mas também garantir que a máxima quantidade de pDNA chegava numa primeira fase ao interior da célula e subsequentemente ao interior do seu núcleo. Sendo assim, e como previamente referido, todos os trabalhos realizados ao longo deste projeto focam-se no estudo e desenvolvimento de metodologias que poderão contribuir para a potencial aplicação de uma estratégia de terapia génica para re-estabelecimento da função da p53 em células tumorias. O estudo envolve assim, as diferentes etapas de um processo biotecnológico, desde o processo de purificação do pDNA que codifica para a p53, até ao seu processo de entrega na célula e avaliação da expressão da proteína e do seu efeito na apoptose das células. Descrição do trabalho realizado Para a realização deste trabalho, e no sentido de alcançar a biossíntese de pDNA, foi utilizado como hospedeiro recombinante a bactéria Escherichia coli modificada com o plasmídeo que codifica para a p53 com o objetivo de se obterem extratos ricos neste pDNA. Após lise destas células foram obtidos extratos mais ou menos complexos, de forma a isolar a isoforma sc enrolada do pDNA que codifica para a p53. Estes extratos foram posteriormente purificados usando vários suportes cromatográficos de afinidade que utilizavam diferentes aminoácidos como ligandos, tais como a L-metionina, L-tirosina e arginina, para a recuperação da isoforma sc. Posteriormente, e para compreender biologicamente a atividade e o efeito terapêutico desta isoforma sc, diferentes linhas celulares (HeLa, A549 e Fibroblastos dérmicos humanos) foram transfetadas com pDNA purificado com a metodologia desenvolvida e com kits disponíveis comercialmente, para posterior avaliação in vitro. Nesta vertente, foram realizados testes nos diferentes modelos celulares, para avaliar a citotoxicidade, a expressão do gene p53 e o efeito apoptótico resultante. Os resultados proporcionaram informações relevantes sobre a potencial aplicação desta isoforma sc do pDNA que codifica para a p53 em terapia genética aplicada ao tratamento de cancro. Principais resultados alcançados Tendo em conta uma perspetiva geral dos principais resultados obtidos durante este trabalho pode dizer-se que três matrizes cromatográficas foram utilizadas com sucesso para o isolamento da isoforma sc do pDNA que codifica para a p53. De entre as matrizes estudadas a L-metionina e a O-Phospho-L-tirosina, ambas comerciais, demonstraram seletividade mesmo quando diferentes ácidos nucleicos faziam parte da amostra aplicada. As amostras de sc recolhidas através da purificação com ambas as matrizes apresentaram uma pureza concordante com todas as especificações das agências reguladoras para este tipo de amostra. Contudo, foi a amostra proveniente da purificação com O-Phospho-L-tirosina aquela que apresentou melhor grau de pureza assim como percentagem de recuperação. Possivelmente estes bons resultados podem estar relacionados com o uso de ferramentas de desenho experimental (DoE) aplicado apenas para a otimização da estratégia de purificação com esta matriz. Neste trabalho, e com o modelo escolhido, pretendeu-se otimizar e maximizar as respostas “grau de pureza” e “percentagem de recuperação”, tendo sido possível estabelecer as melhores condições experimentais para conseguir um melhor desempenho do suporte cromatográfico de O-Phospho- L-tirosina quando comparada com a L-metionina. Numa abordagem diferente, foi também utilizado um suporte macroporoso onde foi imobilizada arginina tendo, mais uma vez, como objetivo o isolamento da isoforma sc do pDNA que codifica para a p53. Neste trabalho foi aplicada uma amostra menos complexa, contendo apenas pDNA sc+oc, sendo que mais uma vez a isoforma sc foi isolada com sucesso. A utilização de uma matriz macroporosa teve como principal objetivo explorar um possível aumento da capacidade de ligação do suporte, de forma a aumentar a quantidade de amostra purificada por ensaio, aumentando a sustentabilidade/rentabilidade do processo cromatográfico. Neste sentido, comparou-se a capacidade dinâmica de ligação desta matriz com um suporte de agarose e um monólito que apresentavam também a arginina como ligando. Através desta comparação verificou-se que a utilização do suporte macroporoso promove um aumento superior a 50 % na capacidade de ligação do pDNA quando comparada com a sua homóloga comercial, mas em suporte de agarose não macroporoso. Estes resultados podem ser de extrema relevância nomeadamente quando se pensa na industrialização do processo cromatográfico. Quando uma amostra de pDNA superenrolado que codifica para a p53 foi biologicamente avaliada e comparada com uma amostra de pDNA que contém as duas isoformas predominantes (sc+oc) verificou-se que a amostra purificada demonstrou maior resposta biológica, nomeadamente ao nível da eficiência de transfeção, expressão da proteína P53 e indução de apoptose celular. Foi também interessante observar que esta isoforma não atua de igual forma em células tumorais e não tumorais e também, que existem variações na sua atuação quando diferentes células tumorais são estudadas. Neste caso, as células HeLa foram as que demostraram maior sensibilidade à isoforma sc do plasmídeo que codifica para a p53, já que foi nestas células que se observaram maiores níveis de transfeção, expressão de proteína e apoptose. Finalmente, foram produzidos dois vetores catiónicos, formados através da complexação entre polietilenoimina (PEI) e quitosano (CH) com uma amostra nativa (sc+oc) de diferentes plasmídeos. Através dos resultados obtidos foi possível verificar que as nanopartículas de pDNA/PEI demonstraram algum efeito citotóxico em células não tumorais, o que poderá ser uma enorme desvantagem para a sua aplicação in vivo. Relativamente à entrada das nanopartículas no núcleo, foi demonstrado que poliplexos produzidos através da complexação com o pDNA mais pequeno apresentaram maior facilidade de entrada no núcleo das células estudadas. Por fim, foi avaliada a capacidade dos poliplexos estudados promoverem expressão da proteína P53 em células cancerígenas Hela. A partir dos resultados obtidos, observou-se que os níveis de P53 aumentaram 54,2% quando as células foram transfetadas com as nanopartículas de CH e 32% quando as células foram transfetadas com nanopartículas de PEI. No geral, o trabalho científico realizado no âmbito desta tese pretende levar a comunidade científica a dar cada vez mais relevância ao uso de vetores não virais e em particular da aplicação da isoforma superenrolada do pDNA em terapia génica, de forma a promover o restabelecimento dos níveis da P53, como forma de ajudar na terapia de cancro. Para isso torna-se crucial desenvolver e compreender cada vez melhor os processos biotecnológicos que podem conduzir à obtenção deste biofármaco, garantindo a sua estabilidade e atividade

Synthesis of nanostructured Ni(Co)/SiO2 composites from cellulose derivatives through sol-gel approach

Tese de mestrado integrado. Engenharia Química. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 201

Editorial for Special Issue: “AdditiveManufacturing Approaches to Produce Drug Delivery Systems”

This work was supported by the Fundação para a Ciência e a Tecnologia FCT/MCTES (PIDDAC) and Centro2020 through the following Projects: UIDB/04044/2020, UIDP/04044/2020, UIDB/00709/2020, PTDC/BII-BBF/29496/2017, IC&DT Project 02/SAICT/2017 (Bone2Move), PTDC/EME-SIS/4446/2020 (OptiBioScafold), Associate Laboratory ARISE LA/P/0112/2020; PAMI-ROTEIRO/0328/2013 (No. 022158) and MATIS (CENTRO-01-0145-FEDER-000014-3362).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Aleitamento materno e peso à nascença – fatores protetores ou de risco para a obesidade infantil? - Estudo COSI Portugal 2010 .

Introdução: A obesidade continua a ser uma doenças mais prevalentes na infância e um sério desafio de saúde pública a nível mundial. Devido ao seu carácter preditivo de obesidade na idade adulta e co-morbilidades, fatores inerentes ao início da vida têm vindo a ser estudados pelo seu potencial papel determinante no risco de desenvolver obesidade na infância. Objetivos: O presente trabalho pretende estudar o aleitamento materno e o peso à nascença, como possíveis fatores protetores ou de risco para a obesidade infantil. Métodos: O estudo compreende 3637 crianças dos 6-8 anos avaliadas na 2ª fase do COSI Portugal 2010. Os dados do peso à nascença e da amamentação foram obtidos por um questionário familiar. A prevalência de obesidade e excesso de peso foi determinada aplicando o critério da Organização Mundial de Saúde. Resultados: Segundo os critérios estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde, no ano de 2010 o excesso de peso afetava 39% das crianças portuguesas, das quais 16,4% eram obesas. No que concerne ao peso à nascença, os resultados mostraram que 8,3% das crianças nasceram com baixo peso (4000g) no momento do nascimento. Cerca de 52% das crianças foram amamentadas por um período inferior a 6 meses. Nesta amostra o baixo peso à nascença não constituiu um risco do excesso de peso nas crianças portuguesas (OR = 0,74; IC95% 0,57-0,98) no entanto, as crianças com macrossomia apresentaram uma maior probabilidade de ter excesso de peso (OR = 1,41; IC95% 1,05 1,90) e as crianças com alimentação artificial exclusiva desde o nascimento, maior risco de obesidade (OR = 1,39; IC95% 1,09-1,77). Conclusões: Maior peso à nascença e a ausência de amamentação revelaram ser factores de risco para a prevalência de excesso de peso e de obesidade infantil

Remodeling the paradigm in patients with ocular pathology

Vascular Endothelium Growth Factors (VEGFs) are important regulators of endothelium cell proliferation, migration, and permeability not only during embryonic vasculogenesis but also in physiological and pathological angiogenesis. The VEGF family comprises seven members, including VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, and Placental Growth Factor (PIGF); each one has a unique expression, specificity, and function. These members with different physical and biological properties act through three specific receptor tyrosine kinases, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, and two semaphorins receptors neuropilin-1 (NRP-1) and NRP-2. Almost 80% of the volume of the eye is made up of a clear gel-like substance called vitreous humor that fills the center of the eye and is in continuous contact with the retina. It consists of water (~99%), hyalocytes, hyaluronic acid, ascorbic acid, inorganic salts, glucose, and a network of collagen fibrils. In the present study, three cytokines (VEGF-A, VEGF-B and PIGF) were investigated in vitreous humor and serum of patients with ocular pathology, measured by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). To compare and characterize the quantitative results obtained by ELISA, the patients were categorized into two groups: 1. Patients with neovascular ocular diseases were categorized into the following subgroups: age-related macular degeneration (AMD), retinal vein occlusion (RVO), and diabetic retinopathy (DR) patients and 2. Patients with non-neovascular ocular diseases: vitreomacular traction syndrome patients of idiopathic etiology or rhegmatogenous retinal detachment patients. Additionally, the growth factors were compared or correlated between: 1. The studied groups of patients; 2. The different ocular pathologies; 3. With patient baseline clinical characteristics such as naïve vs. non-naive patients, previous treatments, the presence of glaucoma, and stage of diabetic retinopathy (non-proliferative diabetic retinopathy vs. proliferative diabetic retinopathy). For further investigation, serum and vitreous concentration levels of VEGF-A, VEGF-B, and PIGF were correlated between each other and between changes assessed by optical coherence tomography (OCT) and visual acuity (VA) measurements. The major conclusions of this study were as follows: 1. VEGF-A, VEGF-B, and PIGF vitreous levels are overexpressed in patients with neovascular ocular diseases in comparison with patients with non-neovascular ocular diseases; 2. In diabetic patients the vitreous vascular endothelial growth factors levels increase with the progression of the disease, being lower in non-proliferative diabetic retinopathy patients and higher in proliferative diabetic retinopathy patients. However, serum levels of VEGF-A, VEGF-B and PIGF were higher in non-proliferative diabetic retinopathy patients in comparison with proliferative diabetic retinopathy patients; 3. There were no statistical differences between the concentration values of serum VEGF-A, VEGF-B or PIGF between neovascular and non-neovascular diseases; 4. There was a positive and strong correlation between vitreous and serum VEGF-A and VEGF-B, suggesting a simultaneous pathological increase in those cytokines; 5. There was no correlation between serum levels and vitreous levels of all growth factors: VEGF-A, VEGF-B and PIGF; 6. There was a correlation between VEGF A or VEGF-B and macular volume; 7. Through the descriptive analysis of previous treatments as well as the comparative analysis between naïve and non-naïve patients, the existence of patients with insufficient response to the current therapies was confirmed, and therefore, there is an unmet need for the research of new drugs to treat neovascular ocular diseases. Taken altogether, these results suggest an overexpression of vitreous levels for the three studied cytokines. The correlations between VEGF-A and VEGF-B growth factors confirmed they may be simultaneously increased in neovascular eye pathologies. The correlations with diabetic retinopathy stage as well with structural and functional characteristics of studied neovascular disorders demonstrated the action of these cytokines in the progression of the disease. Targeting VEGF-A or VEGF-B or PIGF inhibition may have beneficial and impactful implications in the treatment of neovascular diseases, not only in terms of better outcomes but also in the regression of disease (in the case of diabetes). The identification of serum markers or other disease characteristics is easily measurable. Their correlation with vitreous levels will also lead to early intervention in disease prevention through the detention of ocular neovascularization before the appearance of clinical symptoms, subsequently leading to the prevention of blindness.Os fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) são importantes reguladores da proliferação, da migração e da permeabilidade das células endoteliais, não só durante a fase embrionária e vasculogénese, mas também na angiogénese fisiológica e patológica. A família VEGF é constituída por sete membros, os quais incluem o VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F e o factor de crescimento placentário (PlGF), cada um com uma expressão única, especificidade e função. Estes membros com diferentes propriedades físicas e biológicas específicas, atuam através de três receptores tirosina quinase, VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3, e dois receptores de sinalização neuropilina-1 (NRP-1) e NRP-2. Quase 80% do globo ocular é constituído por uma substância clara, semelhante a um gel, designada por humor vítreo, que preenche o centro do olho e está em contacto contínuo com a retina. O humor vítreo é constituído por água (~ 99%), hialócitos, ácido hialurónico, ácido ascórbico, sais inorgânicos, glucose e uma rede de fibrilhas de colagénio. No presente estudo, foram investigadas três citoquinas (VEGF-A, VEGF-B e PIGF) no humor vítreo e soro de doentes com patologia ocular através da quantificação por ELISA (“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”). Para comparar e caracterizar os achados quantitativos destes fatores de crescimento, os doentes foram divididos em 2 grupos: 1. Doentes com doenças oculares neovasculares classificados posteriormente nos seguintes subgrupos de doentes: degenerescência macular da idade (DMI), oclusão da veia da retina (OVR) e retinopatia diabética (RD); 2. Doentes com doenças oculares não-neovasculares, ou seja, doentes com síndroma de tracção vitreomacular de etiologia idiopática ou doentes com descolamento retiniano regmatogénio. Além disso, os fatores de crescimento foram comparados ou correlacionados entre: 1. Os grupos de doentes estudados (neovascular vs. não neovascular); 2. As diferentes patologias oculares; 3. As características clínicas de “baseline” do doente, como por exemplo, doentes naïve versus doentes não-naïve, tratamentos efetuados antes de serem submetidos a vitrectomia, presença de glaucoma e estadio de retinopatia diabética (retinopatia diabética não proliferativa vs. retinopatia diabética proliferativa). Para uma investigação mais aprofundada, os valores médios das concentrações séricas e vítreas de VEGF-A, VEGF-B e PIGF foram correlacionadas entre si e entre as alterações estruturais ocorridas nestes doentes, avaliadas por tomografia de coerência óptica (OCT) e medições da acuidade visual (AV). As principais conclusões deste estudo foram as seguintes: 1. Os níveis vítreos de VEGF-A, VEGF-B e PIGF encontram-se sobre-expressos em doentes com doença ocular neovascular em comparação com os doentes sem doença ocular neovascular; 2. Nos doentes diabéticos, os níveis de fatores de crescimento endotelial vascular no humor vítreo aumentaram com a progressão da doença, sendo as concentrações obtidas de VEGF-A, VEGF-B e PIGF, menores em doentes com retinopatia diabética não proliferativa e maiores em doentes com retinopatia diabética proliferativa. Contudo, os níveis séricos de VEGF-A, VEGF-B e PIGF apresentaram valores maiores em doentes com retinopatia diabética não proliferativa em comparação com os doentes com retinopatia diabética proliferativa; 3. Não se observaram diferenças estatisticamente significativas entre valores de concentração de VEGF-A, VEGF-B ou PIGF sérico entre doenças neovasculares e não neovasculares; 4. Observou-se uma correlação positiva e forte entre VEGF-A e VEGF-B, tanto no vítreo como no soro analisado, sugerindo um aumento patológico em simultâneo dessas citoquinas; 5. Não foram reportadas correlações entre os níveis séricos e os níveis vítreos para todos os factores de crescimento endotelial vascular: VEGF-A, VEGF-B e PIGF; 6. Foi encontrada uma correlação positiva entre VEGF-A ou VEGF-B e volume macular; 7. Através da análise descritiva de terapêuticas prévias administradas aos doentes com doença ocular neovascular, e das análises comparativas entre doentes naïve e não-naïve, confirmou-se a existência provável de doentes com resposta insuficiente às terapêuticas actualmente aprovadas, reconhecendo-se assim a necessidade de investigação de novos fármacos para o tratamento de doenças neovasculares. Em resumo, todos os resultados sugeriram uma sobre-expressão dos níveis vítreos para as três citoquinas estudadas; as correlações entre fatores de crescimento de VEGF-A e VEGF-B, confirmaram o seu aumento em simultâneo em patologias neovasculares oculares; e as correlações com o estadio da retinopatia diabética e características funcionais e estruturais das doenças neovasculares, demonstraram a ação destas citoquinas na progressão da doença. O enfoque na inibição de VEGF-A ou VEGF-B ou PIGF pode ter implicações benéficas e um grande impacto no tratamento das doenças neovasculares, não apenas em termos de melhor eficácia, mas também em termos de regressão da doença (no caso da diabetes). A identificação de biomarcadores ou outras características da doença quantificáveis e a sua correlação com os níveis de VEGF-A, VEGF-B e PIGF no vítreo poderá conduzir a uma intervenção precoce na prevenção destas doenças, através da detenção da neovascularização ocular antes do aparecimento de sintomas clínicos, conduzindo assim à prevenção da cegueira

Desenvolvimento morfossintático em crianças com quatro anos de idade : 4;00-4;05

A morfossintaxe constitui uma das áreas da linguagem que estuda a organização das palavras na frase, bem como a estrutura interna de cada palavra. Em termos de estudos de desenvolvimento, há poucos valores de referência para o Português Europeu, pelo que foi desenvolvido este projeto, que envolve a análise de discurso espontâneo de crianças com 4 anos. O objetivo principal é a caracterização morfossintática do discurso de crianças dentro da faixa-etária de 4;00 a 4;05 anos de idade. Pretende-se também verificar se o género das crianças e a escolaridade dos pais influencia os resultados. Os discursos analisados pertenceram a um corpus linguístico anteriormente recolhido, sendo a amostra utilizada na presente dissertação de 29 crianças. O discurso das crianças foi transcrito para o programa ELAN (EUDICO Linguistic Annotator; www.lat-mpi.eu/tools/elan) e posteriormente analisado. Os resultados obtidos revelaram que as crianças, dentro desta faixa-etária, já têm um discurso em que utilizam todas as classes gramaticais, havendo uma preferência pela utilização de verbos, não havendo diferença entre os discursos das crianças do género feminino e as do género masculino. É na concordância verbal que mais erros se verificam, e mais precisamente relativamente à conjugação de verbos em pessoa. Com esta investigação foi possível concluir que as crianças da faixa-etária estudada têm um discurso com características morfossintáticas já bastante próximas do discurso dos adultos, havendo apenas ainda algumas características mais complexas e de aquisição tardia que se encontram ainda em fase de estabilizaçãoThe morphosyntax is one of the areas of language which studies the organization of words in the sentence as well as the internal structure of each word. In terms of development studies, there are few benchmarks for European Portuguese, which was developed by this project, which involves the analysis of spontaneous speech of children aged 4 years . The main objective is the morphosyntactic characterization of the speech of children within the age group of 4 , 00-4 ; 05 years of age . Another aim is to verify whether the gender of the children and the parents' education influences the results. The speeches analyzed previously belonged to a linguistic corpus collected, the sample used in this dissertation 29 children. The speech of children was transcribed for ELAN (EUDICO Linguistic Annotator; www.lat-mpi.eu/tools/elan) program and subsequently analyzed. The results revealed that children within this age group already have a speech using all parts of speech, with a preference for the use of verbs, with no difference between the discourses of children were female and male gender. It is the verbal agreement that more errors occur, and more precisely in relation to the verb conjugation in person. This investigation was concluded that children of age group studied have a discourse with morphosyntactic features already quite close to the speech of adults , with only a few still more complex and late acquisition features that are still in the stabilization phase

Brazilian social work

The authors analyse three aspects of Brazilian social work. First, they provide an overview of Brazil, a country marked by extreme inequality that permeates the economic and social relationships of its population, including rapid contradictory economic growth and the preservation of inequality. Second, they examine the main challenges faced by the country’s social workers. Third, they explore whether Brazil’s undergraduate and postgraduate programs are oriented toward professional training that fosters a critical, creative, and propositional perspective.Los autores analizan tres aspectos del trabajo social brasileño: en primer lugar, se ofrece una visión general del Brasil, un país marcado por la desigualdad extrema que impregna las relaciones económicas y sociales de su población, incluyendo un rápido crecimiento económico y el mantenimiento de la desigualdad; en segundo lugar, se examinan los principales retos que afrontan los trabajadores sociales del país; y en tercer lugar, se explora si los programas de pregrado y postgrado de Brasil están orientados hacia la formación profesional que fomente una perspectiva crítica y creativa.Le autrici analizzano tre aspetti del servizio sociale brasiliano. In primo luogo propongono una panoramica sul Brasile, un paese caratterizzato da un'estrema disuguaglianza che permea i rapporti economici e sociali della popolazione, in presenza di una rapida e contraddittoria crescita economica accompagnata dalla conservazione delle disuguaglianze. In seconda battuta esaminano le principali sfide affrontate dagli assistenti sociali nel contesto socio-economico delineato. In terza istanza cercano di capire se i corsi di laurea e post-laurea in Brasile siano orientati ver-so una formazione professionale atta a favorire una prospettiva critica, creativa e propositiva

A utilização do vídeo para a divulgação de atividades de I&D&I

Tese de Mestrado. Multimédia. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 201

Padrões na creche e no jardim de infância: a emergência do pensamento algébrico e do raciocínio matemático

O presente estudo surgiu no âmbito do Mestrado em Educação Pré-escolar e aborda os padrões e o modo como a sua exploração contribui para a emergência do pensamento algébrico e do raciocínio matemático, nos contextos de creche e jardim de infância. Identifiquei como principal objetivo da investigação compreender e analisar o modo como crianças de creche e de jardim de infância evidenciam aspetos da emergência do pensamento algébrico e do raciocínio matemático no contexto de atividades com padrões. Deste objetivo decorreram as seguintes questões que orientaram todo o trabalho desenvolvido: (i) Que aspetos associados à emergência do pensamento algébrico se identificam em atividades com padrões realizadas por crianças da creche e do jardim de infância?; (ii) Que aspetos do raciocínio matemático associado ao pensamento algébrico se destacam em atividades com padrões realizadas por crianças da creche e do jardim de infância? A fundamentação teórica inclui a discussão e aprofundamento de temáticas essenciais, tais como: o pensamento algébrico e a sua relação com o trabalho com padrões; os padrões nas orientações curriculares para a educação de infância: o raciocínio matemático e o raciocínio matemático nos primeiros anos. Do ponto de vista metodológico, o estudo enquadra-se no paradigma interpretativo e segue uma abordagem qualitativa de investigação-ação. Os participantes foram três crianças de creche e doze de jardim de infância, que se envolveram na realização de um conjunto de tarefas espontâneas e/ou selecionadas, para potenciar a temática em estudo. Os principais métodos de recolha de dados foram a observação participante, incluindo notas de campo, conversas informais e registos multimédia (vídeos e fotografias) e a pesquisa documental. Ainda na metodologia descrevo os contextos educativos, incluindo uma breve apresentação de cada instituição, as rotinas implementadas pelas educadoras e a caracterização das crianças envolvidas. A análise dos dados permitiu realçar que é possível envolver crianças de creche e de jardim de infância em tarefas de exploração de padrões, algumas espontâneas, outras propostas por mim. As crianças de creche evidenciaram ser capazes de lidar com padrões de repetição do tipo AB, destacando-se o inventar e continuar um padrão, e identificar a unidade de repetição de um padrão. No jardim de infância, todas as crianças envolvidas no estudo foram capazes de inventar e continuar um padrão, de identificar a unidade de repetição e de quantas vezes esta se repetia numa sequência. Por fim, uma criança do jardim de infância evidenciou ainda compreender o que é um padrão de crescimento e como continuá-lo. Relativamente ao raciocínio matemático, durante a exploração de padrões, as crianças evidenciaram utilizar processos, ainda emergentes, nomeadamente a generalização e a justificação. Em síntese, este estudo possibilitou perceber que o trabalho com padrões permite às crianças da creche e do jardim de infância desenvolver o seu pensamento algébrico e, simultaneamente, o raciocínio matemático.The present study emerges in the scope of the Preschool Master’s Degree whose subject is the patterns and the way them contribute to the emergency of algebraic thinking and mathematical reasoning in the nursery and kindergarten context. I identified as the investigation main goal to understand and to analyse the way how nursery and kindergarten children point different aspects of the emergency of algebraic thinking and mathematical reasoning in the context of pattern activities. From this objective occurs the follow questions which orientate all the developed work: (i) What aspects associated to the emergency of algebraic thinking can be identified in the pattern activities carried out by nursery and kindergarten children? (ii) What aspects of the mathematical reasoning associated to the algebraic thinking stand out in activities with patterns carried out by nursery and kindergarten children? The theoretical substantiation includes the discussion and deepening of the essential topics, such as: the algebraic thinking and its relationship with the pattern work; the patterns in the curricular orientations for the childhood education: the mathematical reasoning and the mathematical reasoning in the first years. In the methodologic point of view, the study fits in interpretative paradigm and it follows a qualitative approach of investigation-action. Three nursery children and twelve kindergarten children underwent a set of spontaneous and/or selected tasks to potentiate the study´s topic. The main data collection methods were the participant observation, including field notes, informal conversations, multimedia records (videos and photography’s) and documental research. Additionally, I describe the educational context, including a brief presentation of each institution, the routines implemented by the educators and the characterization of the involved children. The data analysis allowed to emphasize that is possible to involve nursery and kindergarten children in pattern exploration tasks, some spontaneous, other proposed by me. The nursery children evince to be capable to deal with type AB repeating patterns, highlighting the capacity to invent and to continue a pattern, and to identify the repetition unit of the pattern. In the other side, in the kindergarten, all children involved in the study were capable of inventing and continuing a pattern, and of identifying the repetition unit of the pattern, as well as quantify the number of times each sequence repeats. Ultimately, one kindergarten children show to understand what a growth pattern is and how to continue it. Relatively to the mathematical reasoning, during the pattern exploration, the children demonstrate to use processes, still emerging, namely the generalization and the justification. In summary, this study enabled to understand that the work with patterns allows nursery and kindergarten children to develop your algebraic thinking and, simultaneously, the mathematical reasoning