Cancer is still one of the leading causes of death worldwide. In order to treat this scourge, gene
therapy and DNA vaccination have been proposed as an alternative to the common treatments.
Among the several gene abnormalities that could be responsible for the oncogenic process, the
ones presented in p53 stands up. p53 is one of the most important tumour suppressor gene
being considered the “genome guardian” since when occurs exposure to stressful stimuli it is
activated through post-transcriptional modifications increasing its stability and activity. This
gene is directly and indirectly implicated in different cellular functions, including DNA damage
repair, cell cycle arrest in G1/S and apoptosis. Several studies shown that transfection of cancer
cells with wild-type p53-expressing plasmids could directly drive cells into apoptosis and/or
growth arrest, suggesting that a gene therapy approach for cancer treatment can be related to
the re-establishment of the normal p53 function. Recently, the supercoiled (sc) conformation
of a p53-encoding plasmid proved to be more efficient in cell transfection and protein
expression than open circular conformation. Aiming to successfully isolate this bioactive
isoform, several chromatographic techniques have been used, namely amino acids-based
affinity chromatography.
Concerning this chromatographic approach, in this doctoral work different amino acids like, Lmethionine,
L-tyrosine, and arginine, were used to isolate the sc p53 encoding plasmid. From
this work, it was achieved a better recovery yield and purity levels for O-Phospho-L-tyrosine
when compared with L-methionine agarose matrix. Regarding the macroporous arginine resin,
it was possible to recover the sc p53 encoding pDNA with high purity, and an increase of more
than 50% in the dynamic binding capacity was achieved, when comparing with their homologous
commercial agarose matrix.
To understand the activity and the therapeutic effect induced by this sc isoform, different cell
lines (HeLa, A549 and human dermal fibroblasts) were transfected with the pDNA purified either
by the affinity purification strategy or with a commercial kit, for further in vitro evaluation. In
particular, the cytotoxicity, the expression of the p53 transgene and the resulting apoptotic
effect were evaluated in these in vitro cancer models. The results brought relevant information
concerning the potential application of a sc p53 encoding plasmid in cancer gene therapy.
To eliminate different cancer types, treatments must be applied systematically and therefore,
must be targeted to cancer cells. Concerning this and, to enable an easy and safe systemic
therapy, stable and non-viral gene vectors have been developed to encapsulate and deliver
foreign genetic materials in specific cell types, such as cancerous cells. The use of non-viral
vectors usually promotes low immune response, they are easily prepared, have a low production
cost and also, they can be easily produced at large scale. Other important characteristic about
these vectors is the ability to transfer different and large transgenes being also able to be stored for long periods due to their stability. Regarding this, in this doctoral work, chitosan
(CH) and polyethyleneimine (PEI) were complexed with different plasmids in order to search
for the suitable non-viral nanocomplex combination to be applied for gene therapy. Through
the obtained results it was found that p53-encoding pDNA/PEI polyplexes demonstrate some
toxicity in normal cells which could be a handicap for future therapeutic application of this
nanocarriers. Also, from the track of the nanocarriers inside the cells, it was achieved a better
transfection efficiency for the carriers delivering the smaller pDNA. The ability of the
polyplexes to promote P53 protein expression was also evaluated using HeLa cancer cells and
an increase of 54.2% and 32% of the P53 levels was achieved when CH and PEI nanocarriers were
respectively applied.
Overall, the scientific work performed in this thesis hopes to lead the scientific community to
give more and more relevance to the use of the supercoiled pDNA isoform for gene therapy
involving the reestablishment and restoration of the levels of p53. Moreover, it has been shown
that the use of chromatography using specific amino acid ligands is a crucial factor in the final
quality of the recovered sc pDNA sample, being this a predominant parameter for the
accomplishment of the desired therapeutic results. Finally, the effort in the search and
development of suitable non-viral vectors should stand up since it can guarantee the stability
and activity of the sc p53 encoding plasmid during the delivery process.Introdução
O cancro é uma das principais causas de morte em todo o mundo fazendo com que exista
bastante investigação nesta área na tentativa de melhor compreender a doença e de
desenvolver estratégias terapêuticas mais eficazes e seguras. Para o tratamento desta doença,
a terapia génica e a vacinação com DNA foram propostas como alternativas às formas mais
comuns de tratamento. Entre as várias alterações genéticas que podem ser responsáveis pelo
processo oncogénico, estão incluídas as alterações relacionadas com a p53, nomeadamente em
relação à sua expressão ou atividade. A p53 foi no passado considerada um oncogene no
entanto, mais recentemente, provou-se que esta proteína é na realidade um supressor de
tumor, muito poderoso envolvido em processos como a apoptose e a senescência. Esta “guardiã
do genoma” atua sempre que as células são expostas a condições de stress, e alterações na
estabilidade desta proteína podem resultar em instabilidade genómica. A p53 tem suscitado
interesse em muitos grupos de investigação uma vez que está descrito que em 50% dos casos
de cancro são identificadas mutações no gene que codifica a p53, enquanto os restantes 50%
possuem componentes defeituosos na pós-tradução ou alterações nas vias de sinalização da
p53. Diversos estudos demonstraram que a transfeção de células cancerígenas com o plasmídeo
que codifica para a p53 pode direcionar as células para a apoptose e/ou para uma paragem no
seu crescimento, sugerindo que uma abordagem relacionada com a terapia génica no
tratamento do cancro pode promover o restabelecimento da função normal de p53. Portanto,
é muito importante restabelecer a expressão e atividade da p53 em células cancerígenas.
Neste sentido, a terapia génica tem já usado a possibilidade de induzir a expressão de p53,
associando o gene que a codifica a vetores virais ou não-virais, nomeadamente com recurso ao
DNA plasmídico (pDNA), como opção terapêutica promissora e alguns exemplos práticos já
foram estudados e aplicados com sucesso. A utilização de vetores não-virais apresenta
vantagens em relação ao uso de vetores virais, já que o processo de produção é mais simples,
economicamente vantajoso, sendo os vetores menos imunogénicos e mais seguros.
Recentemente, a isoforma superenrolada (sc) de um plasmídeo que codifica a p53 provou ser
mais eficiente na transfeção celular e na expressão proteica do que a conformação circular
aberta, e de facto esta isoforma tem-se destacado das outras isoformas por possuir uma
estrutura extremamente compacta e funcional. Assim, o pDNA sc é considerado mais eficiente
para induzir a expressão do produto alvo, quando comparado a outras variantes
conformacionais, como o pDNA circular aberto (oc) e linear.
A biossíntese recombinante de pDNA permite a produção de um extrato enriquecido com pDNA
sc. No entanto este extrato é também composto por proteínas hospedeiras, RNA e outras
estruturas de DNA, o que torna o processo de isolamento da isoforma sc do pDNA um requisito imperativo. Para atingir este objetivo, a cromatografia de afinidade usando aminoácidos como
ligandos (ex.: arginina, histidina e lisina) tem vindo a ser utilizada com sucesso. No entanto, é
essencial desenvolver e estudar novas matrizes com maior especificidade e robustez,
permitindo maiores graus de pureza e rendimento do pDNA sc obtido. Desta forma, este
trabalho prevê a produção e otimização de novas matrizes de afinidade que permitam promover
interações mais específicas entre os ligandos e o pDNA sc de forma a estabelecer processos que
nos permitam elevados rendimentos e também amostras com graus de pureza que se
enquadrem dentro das especificações emitidas pelas entidades regulamentares tais como a
Food and Drug Administration (FDA) e a European Medicines Agency (EMA).
Após a obtenção de amostras altamente puras do vetor que codifica para a p53 é importante
garantir uma entrega eficiente deste plasmídeo. Para tal neste trabalho foram também testadas
nanopartículas tendo como finalidade não só a proteção do material genético que se pretende
entregar (a isoforma sc do pDNA que codifica para a p53) mas também garantir que a máxima
quantidade de pDNA chegava numa primeira fase ao interior da célula e subsequentemente ao
interior do seu núcleo.
Sendo assim, e como previamente referido, todos os trabalhos realizados ao longo deste projeto
focam-se no estudo e desenvolvimento de metodologias que poderão contribuir para a potencial
aplicação de uma estratégia de terapia génica para re-estabelecimento da função da p53 em
células tumorias. O estudo envolve assim, as diferentes etapas de um processo biotecnológico,
desde o processo de purificação do pDNA que codifica para a p53, até ao seu processo de
entrega na célula e avaliação da expressão da proteína e do seu efeito na apoptose das células.
Descrição do trabalho realizado
Para a realização deste trabalho, e no sentido de alcançar a biossíntese de pDNA, foi utilizado
como hospedeiro recombinante a bactéria Escherichia coli modificada com o plasmídeo que
codifica para a p53 com o objetivo de se obterem extratos ricos neste pDNA. Após lise destas
células foram obtidos extratos mais ou menos complexos, de forma a isolar a isoforma sc
enrolada do pDNA que codifica para a p53. Estes extratos foram posteriormente purificados
usando vários suportes cromatográficos de afinidade que utilizavam diferentes aminoácidos
como ligandos, tais como a L-metionina, L-tirosina e arginina, para a recuperação da isoforma
sc. Posteriormente, e para compreender biologicamente a atividade e o efeito terapêutico
desta isoforma sc, diferentes linhas celulares (HeLa, A549 e Fibroblastos dérmicos humanos)
foram transfetadas com pDNA purificado com a metodologia desenvolvida e com kits disponíveis
comercialmente, para posterior avaliação in vitro. Nesta vertente, foram realizados testes nos
diferentes modelos celulares, para avaliar a citotoxicidade, a expressão do gene p53 e o efeito apoptótico resultante. Os resultados proporcionaram informações relevantes sobre a potencial
aplicação desta isoforma sc do pDNA que codifica para a p53 em terapia genética aplicada ao
tratamento de cancro.
Principais resultados alcançados
Tendo em conta uma perspetiva geral dos principais resultados obtidos durante este trabalho
pode dizer-se que três matrizes cromatográficas foram utilizadas com sucesso para o isolamento
da isoforma sc do pDNA que codifica para a p53. De entre as matrizes estudadas a L-metionina
e a O-Phospho-L-tirosina, ambas comerciais, demonstraram seletividade mesmo quando
diferentes ácidos nucleicos faziam parte da amostra aplicada. As amostras de sc recolhidas
através da purificação com ambas as matrizes apresentaram uma pureza concordante com
todas as especificações das agências reguladoras para este tipo de amostra. Contudo, foi a
amostra proveniente da purificação com O-Phospho-L-tirosina aquela que apresentou melhor
grau de pureza assim como percentagem de recuperação. Possivelmente estes bons resultados
podem estar relacionados com o uso de ferramentas de desenho experimental (DoE) aplicado
apenas para a otimização da estratégia de purificação com esta matriz. Neste trabalho, e com
o modelo escolhido, pretendeu-se otimizar e maximizar as respostas “grau de pureza” e
“percentagem de recuperação”, tendo sido possível estabelecer as melhores condições
experimentais para conseguir um melhor desempenho do suporte cromatográfico de O-Phospho-
L-tirosina quando comparada com a L-metionina.
Numa abordagem diferente, foi também utilizado um suporte macroporoso onde foi imobilizada
arginina tendo, mais uma vez, como objetivo o isolamento da isoforma sc do pDNA que codifica
para a p53. Neste trabalho foi aplicada uma amostra menos complexa, contendo apenas pDNA
sc+oc, sendo que mais uma vez a isoforma sc foi isolada com sucesso. A utilização de uma
matriz macroporosa teve como principal objetivo explorar um possível aumento da capacidade
de ligação do suporte, de forma a aumentar a quantidade de amostra purificada por ensaio,
aumentando a sustentabilidade/rentabilidade do processo cromatográfico. Neste sentido,
comparou-se a capacidade dinâmica de ligação desta matriz com um suporte de agarose e um
monólito que apresentavam também a arginina como ligando. Através desta comparação
verificou-se que a utilização do suporte macroporoso promove um aumento superior a 50 % na
capacidade de ligação do pDNA quando comparada com a sua homóloga comercial, mas em
suporte de agarose não macroporoso. Estes resultados podem ser de extrema relevância
nomeadamente quando se pensa na industrialização do processo cromatográfico.
Quando uma amostra de pDNA superenrolado que codifica para a p53 foi biologicamente
avaliada e comparada com uma amostra de pDNA que contém as duas isoformas predominantes
(sc+oc) verificou-se que a amostra purificada demonstrou maior resposta biológica, nomeadamente ao nível da eficiência de transfeção, expressão da proteína P53 e indução de
apoptose celular. Foi também interessante observar que esta isoforma não atua de igual forma
em células tumorais e não tumorais e também, que existem variações na sua atuação quando
diferentes células tumorais são estudadas. Neste caso, as células HeLa foram as que
demostraram maior sensibilidade à isoforma sc do plasmídeo que codifica para a p53, já que
foi nestas células que se observaram maiores níveis de transfeção, expressão de proteína e
apoptose.
Finalmente, foram produzidos dois vetores catiónicos, formados através da complexação entre
polietilenoimina (PEI) e quitosano (CH) com uma amostra nativa (sc+oc) de diferentes
plasmídeos. Através dos resultados obtidos foi possível verificar que as nanopartículas de
pDNA/PEI demonstraram algum efeito citotóxico em células não tumorais, o que poderá ser
uma enorme desvantagem para a sua aplicação in vivo. Relativamente à entrada das
nanopartículas no núcleo, foi demonstrado que poliplexos produzidos através da complexação
com o pDNA mais pequeno apresentaram maior facilidade de entrada no núcleo das células
estudadas. Por fim, foi avaliada a capacidade dos poliplexos estudados promoverem expressão
da proteína P53 em células cancerígenas Hela. A partir dos resultados obtidos, observou-se que
os níveis de P53 aumentaram 54,2% quando as células foram transfetadas com as nanopartículas
de CH e 32% quando as células foram transfetadas com nanopartículas de PEI.
No geral, o trabalho científico realizado no âmbito desta tese pretende levar a comunidade
científica a dar cada vez mais relevância ao uso de vetores não virais e em particular da
aplicação da isoforma superenrolada do pDNA em terapia génica, de forma a promover o
restabelecimento dos níveis da P53, como forma de ajudar na terapia de cancro. Para isso
torna-se crucial desenvolver e compreender cada vez melhor os processos biotecnológicos que
podem conduzir à obtenção deste biofármaco, garantindo a sua estabilidade e atividade
