Mechanistic characterization of the late steps of mitochondrial iron-sulfur cluster protein maturation.

Eisen-Schwefel (Fe/S) Cluster gehören zu den ältesten Co-Faktoren und sind unabdingbar für die Funktion vieler Proteine. Die Synthese von Fe/S Clustern und deren Insertion in Apoproteine sind komplexe biochemische Vorgänge. In Mitochondrien wird die Biogenese von Fe/S Proteinen durch die ISC Assemblierungsmaschinerie (Iron-Sulfur Cluster Assembly) in drei Stufen durchgeführt. Im ersten Schritt wird ein Fe/S Cluster de novo aus Eisenionen und Sulfid, das durch eine Cysteindesulfurase bereitgestellt wird, auf dem Gerüstprotein Isu1 assembliert. In einem zweiten Schritt wird der Isu1-gebundene Fe/S Cluster mittels eines spezifischen Chaperonsystems dissoziiert, um dann schließlich durch spezielle Reifungsfaktoren auf die verschiedenen Zielproteine übertragen zu werden. Obwohl bereits einige Faktoren identifiziert wurden, die am Transfer von Fe/S Clustern auf Zielproteine beteiligt sind, ist über deren Zusammenspiel und ihre jeweilige spezifische Funktion wenig bekannt. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Rolle des Monothiol Glutaredoxin Grx5, der BolA-ähnlichen Proteine Aim1 und Yal044W sowie des Nfu1 in den späten Phasen der Fe/S Proteinbiogenese. Mutationen im humanen GLRX5 wurden mit mikrozytischer Anämie in Verbindung gebracht und eine Deletion im Zebrafisch ist embryonisch letal. In der Hefe S. cerevisiae ist Grx5 nicht essentiell, jedoch zeigen Zellen ohne Grx5 niedrige Enzymaktivitäten von Fe/S Proteinen, eine Akkumulation von mitochondrialem Eisen und oxidativen Stress. Es wurde bereits gezeigt, dass die Depletion von Grx5 eine Akkumulation von Fe/S Clustern auf Isu1 hervorruft, und diese nicht auf Zielproteine übertragen werden können. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Grx5 einen Fe/S Cluster in vivo bindet, der für die Reifung aller zellulärer Fe/S Proteine benötigt wird, unabhängig vom Typ des gebundenen Fe/S Co-Faktors und deren subzellulärer Lokalisation. Grx5 und Isu1 interagieren gleichzeitig mit dem Hsp70 Chaperon Ssq1 an unterschiedlichen Bindungsstellen. Grx5 stimuliert dabei nicht die ATPase Aktivität von Ssq1 und bindet bevorzugt an die ADP-Form von Ssq1. Die räumliche Nähe von Isu1 und Grx5 am Chaperon erleichtert den schnellen Fe/S Cluster Transfer von Isu1 auf Grx5. Somit verbindet Grx5 den Prozess der de novo Fe/S Clusterbiosynthese auf Isu1 mit dem Transfer des fertigen Fe/S Clusters auf entsprechende Zielproteine. BolA-ähnliche Proteine sind mit den Monothiol Glutaredoxinen über bioinformatische und experimentelle Ansätze in Zusammenhang gebracht worden. Um die Funktion der mitochondrialen BolA-ähnlichen Proteine zu studieren, wurden Hefezellen untersucht, in denen die Gene für Aim1 und Yal044W deletiert wurden. Während die Rolle der Yal044W in der Fe/S Proteinbiogenese unklar blieb, zeigten aim1Δ Zellen eine 50%-ige Abnahme der Enzym-Aktivitäten der Succinatdehydrogenase und der Lipoat-abhängigen Enzyme Pyruvat- und α-Ketoglutarat-Dehydrogenase. Die Aktivitäten der letzteren Enzyme sind abhängig von der Lipoat-Synthase Lip5, einem Fe/S Protein. Aim1 scheint für die katalytische Aktivierung, aber nicht für die de novo Insertion von Fe/S Clustern in Lip5 benötigt zu werden. Der Phänotyp von aim1Δ Zellen in Hefe ist kompatibel mit dem humaner Zellen aus Patienten mit fataler infantiler Enzephalopathie und/oder pulmonaler Hypertonie. Diese Erkrankung wird u.a. durch Mutationen im humanen Aim1 Homolog BOLA3 verursacht. Offensichtlich ist die Rolle der Aim1 Proteine als spezialisierte ISC Überträger-Proteine, die bei der Reifung einer Unterklasse mitochondrialer [4Fe-4S]-Proteine benötigt werden, in Eukaryoten konserviert. Mutationen im humanen NFU1 wurden ebenfalls mit fataler infantiler Enzephalopathie und/ oder pulmonaler Hypertonie in Verbindung gebracht. NFU1 wird für die Reifung der Fe/S Cluster der Atmungskettenkomplexe I und II und der Lipoat-Synthase in humanen Zellen benötigt. Nfu1-ähnliche Proteine binden Fe/S Cluster in vitro, woraus geschlossen wurde, dass Nfu1 ein Gerüstprotein ist, dass parallel zu Isu1 arbeitet. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Deletion von NFU1 in Hefe eine bis zu 5-fache Abnahme der Aktivitäten der Succinat-dehydrogenase und Lipoat-abhängiger Enzyme hervorruft. Dies stimmt mit den Befunden an NFU1 Patientenzellen überein. Hefe Nfu1, das eine Patienten-analoge Mutation trägt (Gly194Cys), bindet einen Fe/S Cluster wesentlich stabiler als das Wildtyp-Protein, und erlaubte somit erstmals den Nachweis einer Fe/S Cluster Bindung auf Nfu1 in vivo. Die Fe/S Cluster Bindung auf Nfu1 war abhängig von der ISC Assemblierungsmaschinerie einschließlich Isu1, was ausschließt, dass Nfu1 ein zu Isu1 alternatives Gerüstprotein ist. Aufgrund der verminderten Labilität des gebundenen Fe/S Clusters in Nfu1-Gly194Cys konnte dieses die Defekte der nfu1∆-Zellen in Hefe nur unvollständig retten, womit ein Einblick in die Krankheitsentstehung in menschlichen Patienten gegeben wurde. Die vorliegende Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis bei, wie Fe/S Cluster nach ihrer de novo Synthese auf dem Gerüstprotein Isu1 in den Mitochondrien weiter transferiert werden. Die hier gezeigte gleichzeitige Interaktion von Isu1 und Grx5 auf dem spezialisierten Hsp70 Chaperon Ssq1 ermöglicht einen effizienten Transfer der Fe/S Cluster von Isu1 zu Grx5, das wiederum als wichtiger ISC Faktor für die Reifung aller zellulärer Fe/S Proteine charakterisiert werden konnte. Weiterhin konnte eine unterstützende Funktion der Hefeproteine Nfu1 und Aim1 als spezialisierte Reifungsfaktoren nachgewiesen werden. Diese Erkenntnisse erlauben einen besseren Einblick in das mechanistische Zusammenspiel der späten Komponenten der mitochondrialen ISC Assemblierungsmaschinerie

Mitochondrial Bol1 and Bol3 function as assembly factors for specific iron-sulfur proteins

Assembly of mitochondrial iron-sulfur (Fe/S) proteins is a key process of cells, and defects cause many rare diseases. In the first phase of this pathway, ten Fe/S cluster (ISC) assembly components synthesize and insert [2Fe-2S] clusters. The second phase is dedicated to the assembly of [4Fe-4S] proteins, yet this part is poorly understood. Here, we characterize the BOLA family proteins Bol1 and Bol3 as specific mitochondrial ISC assembly factors that facilitate [4Fe-4S] cluster insertion into a subset of mitochondrial proteins such as lipoate synthase and succinate dehydrogenase. Bol1-Bol3 perform largely overlapping functions, yet cannot replace the ISC protein Nfu1 that also participates in this phase of Fe/S protein biogenesis. Bol1 and Bol3 form dimeric complexes with both monothiol glutaredoxin Grx5 and Nfu1. Complex formation differentially influences the stability of the Grx5-Bol-shared Fe/S clusters. Our findings provide the biochemical basis for explaining the pathological phenotypes of patients with mutations in BOLA3. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16673.00

Cytosolic monothiol glutaredoxins function in intracellular iron sensing and trafficking via their bound iron-sulfur cluster

Iron is an essential nutrient for cells. It is unknown how iron, after its import into the cytosol, is specifically delivered to iron-dependent processes in various cellular compartments. Here, we identify an essential function of the conserved cytosolic monothiol glutaredoxins Grx3 and Grx4 in intracellular iron trafficking and sensing. Depletion of Grx3/4 specifically impaired all iron-requiring reactions in the cytosol, mitochondria, and nucleus, including the synthesis of Fe/S clusters, heme, and di-iron centers. These defects were caused by impairment of iron insertion into proteins and iron transfer to mitochondria, indicating that intracellular iron is not bioavailable, despite highly elevated cytosolic levels. The crucial task of Grx3/4 is mediated by a bridging, glutathione-containing Fe/S center that functions both as an iron sensor and in intracellular iron delivery. Collectively, our study uncovers an important role of monothiol glutaredoxins in cellular iron metabolism, with a surprising connection to cellular redox and sulfur metabolisms

Evolutionary conservation and in vitro reconstitution of microsporidian iron–sulfur cluster biosynthesis

This work was supported by Marie Curie Postdoctoral Fellowships to T.A.W., E. H. and S. L., a European Research Council Advanced Investigator Grant (ERC-2010-AdG-268701) to T.M.E., and a Wellcome Trust Programme Grant (number 045404) to T.M.E. and J.M.L. R.L. acknowledges generous financial support from Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 593, SFB 987, GRK 1216, LI 415/5), LOEWE program of state Hessen, Max-Planck Gesellschaft, von Behring-Röntgen StiftungMicrosporidians are a diverse group of obligate intracellular parasites that have minimized their genome content and simplified their sub-cellular structures by reductive evolution. Functional studies are limited because we lack reliable genetic tools for their manipulation. Here, we demonstrate that the cristae-deficient mitochondrion (mitosome) of the microsporidian Trachipleistophora hominis is the functional site of iron-sulphur cluster (ISC) assembly, which we suggest is the essential task of this organelle. Cell fractionation, fluorescence imaging and fine-scale immunoelectron microscopy demonstrate that mitosomes contain a complete pathway for [2Fe-2S] cluster biosynthesis that we biochemically reconstituted using purified recombinant mitosomal ISC proteins. Reconstitution proceeded as rapidly and efficiently as observed for yeast or fungal mitochondrial ISC components. Core components of the T. hominis cytosolic iron-sulphur protein assembly (CIA) pathway were also identified including the essential Cfd1-Nbp35 scaffold complex that assembles a [4Fe-4S] cluster as shown by spectroscopic methods in vitro. Phylogenetic analyses reveal that both the ISC and CIA biosynthetic pathways are predominantly bacterial, but their cytosolic and nuclear target Fe/S proteins are mainly archaeal. This mixed evolutionary history of the Fe/S-related proteins and pathways, and their strong conservation among highly reduced parasites, provides additional compelling evidence for the ancient chimeric ancestry of eukaryotes.Publisher PDFPeer reviewe

The function of glutaredoxin GRXS15 is required for lipoyl-dependent dehydrogenases in mitochondria

Iron–sulfur (Fe–S) clusters are ubiquitous cofactors in all life and are used in a wide array of diverse biological processes, including electron transfer chains and several metabolic pathways. Biosynthesis machineries for Fe–S clusters exist in plastids, the cytosol, and mitochondria. A single monothiol glutaredoxin (GRX) is involved in Fe–S cluster assembly in mitochondria of yeast and mammals. In plants, the role of the mitochondrial homolog GRXS15 has only partially been characterized. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) grxs15 null mutants are not viable, but mutants complemented with the variant GRXS15 K83A develop with a dwarf phenotype similar to the knockdown line GRXS15 amiR. In an in-depth metabolic analysis of the variant and knockdown GRXS15 lines, we show that most Fe–S cluster-dependent processes are not affected, including biotin biosynthesis, molybdenum cofactor biosynthesis, the electron transport chain, and aconitase in the tricarboxylic acid (TCA) cycle. Instead, we observed an increase in most TCA cycle intermediates and amino acids, especially pyruvate, glycine, and branched-chain amino acids (BCAAs). Additionally, we found an accumulation of branched-chain a-keto acids (BCKAs), the first degradation products resulting from transamination of BCAAs. In wild-type plants, pyruvate, glycine, and BCKAs are all metabolized through decarboxylation by mitochondrial lipoyl cofactor (LC)-dependent dehydrogenase complexes. These enzyme complexes are very abundant, comprising a major sink for LC. Because biosynthesis of LC depends on continuous Fe–S cluster supply to lipoyl synthase, this could explain why LC-dependent processes are most sensitive to restricted Fe–S supply in grxs15 mutants

Modelowanie numeryczne belek żelbetowych z uwzględnieniem rzeczywistego rozmieszczenia zbrojenia

The article presents comparison of the results obtained from reinforced concrete beams experimental studies with the use of ARAMIS system (digital image correlation) with the results gained from numerical modeling. During studies, deviation from the plane of reinforced concrete beams was observed. Inventory of rebars positions in cross-section of this beams showed significant deviations. Analysis carried out in the work [1] revealed the impact of improperly embedded longitudinal reinforcement on the occurrence of horizontal displacements. Based on the collected data, numerical models of two selected reinforced concrete beams with correct and incorrect positon of the reinforcing bars were made using the Concrete Damaged Plasticity model in Abaqus software. It has been shown that premature interruption of the calculation appeared in models taking into account deviations in the position of reinforcing bars. However, the occurrence of horizontal displacements was still confirmed by numerical model for beams with incorrect positioning of rebars.W artykule przedstawiono porównanie wyników badań eksperymentalnych belek żelbetowych z wykorzystaniem systemu ARAMIS (korelacja obrazu cyfrowego) z wynikami uzyskanymi w wyniku modelowania numerycznego. W wykonanych badaniach zaobserwowane zostało odchylenie z płaszczyzny belek żelbetowych, spowodowane niezgodnym z projektem rozmieszczeniem prętów zbrojenia, co potwierdzono w pracy [1]. Inwentaryzacja położenia prętów zbrojeniowych w przekroju poprzecznym belek wykazała ich znaczne odchylenia. Na podstawie zebranych danych, w oprogramowaniu Abaqus, przy użyciu modelu Concrete Damaged Plasticity, wykonano numeryczne modele dwóch wybranych belek żelbetowych z prawidłowym oraz nieprawidłowym rozmieszczeniem prętów. Stwierdzono przedwczesne przerwanie obliczeń dla modeli uwzględniających odchylenie w położeniu prętów zbrojeniowych. Mimo to opracowany model numeryczny potwierdza występowanie przemieszczeń poziomych w belkach z niewłaściwym rozmieszczeniem prętów