Reassignment of the murine 3'TRDD1 recombination signal sequence.

T cell receptor genes are assembled in developing T lymphocytes from discrete V, D, and J genes by a site-specific somatic rearrangement mechanism. A flanking recombination signal, composed of a conserved heptamer and a semiconserved nonamer separated by 12 or 23 variable nucleotides, targets the activity of the rearrangement machinery to the adjoining V, D, and J genes. Following the rearrangement of V, D, or J genes, their respective recombination signals are ligated together. Although these signal joints are allegedly invariant, created by the head-to-head abuttal of the heptamers, some do exhibit junctional diversity. Recombination signals were initially identified by comparison and alignment of germ-line sequences with the sequence of rearranged genes. However, their overall low level of sequence conservation makes their characterization solely from sequence data difficult. Recently, computational analysis unraveled correlations between nucleotides at several positions scattered within the spacer and recombination activity, so that it is now possible to identify putative recombination signals and determine and predict their recombination efficiency. In this paper, we analyzed the variability introduced in signal joints generated after rearrangement of the TRDD1 and TRDD2 genes in murine thymocytes. The recurrent presence of identical nucleotides inserted in these signal joints led us to reconsider the location and sequence of the TRDD1 recombination signal. By combining molecular characterization and computational analysis, we show that the functional TRDD1 recombination signal is shifted inside the putative coding sequence of the TRDD1 gene and, consequently, that this gene is shorter than indicated in the databases

Single cell analysis reveals similar functional competence of dominant and nondominant CD8 T-cell clonotypes.

Immune protection from infectious diseases and cancer is mediated by individual T cells of different clonal origin. Their functions are tightly regulated but not yet fully characterized. Understanding the contribution of each T cell will improve the prediction of immune protection based on laboratory assessment of T-cell responses. Here we developed techniques for simultaneous molecular and functional assessment of single CD8 T cells directly ex vivo. We studied two groups of patients with melanoma after vaccination with two closely related tumor antigenic peptides. Vaccination induced T cells with strong memory and effector functions, as found in virtually all T cells of the first patient group, and fractions of T cells in the second group. Interestingly, high functionality was not restricted to dominant clonotypes. Rather, dominant and nondominant clonotypes acquired equal functional competence. In parallel, this was also found for EBV- and CMV-specific T cells. Thus, the nondominant clonotypes may contribute similarly to immunity as their dominant counterparts

Impact of a hypomorphic Artemis disease allele on lymphocyte development, DNA end processing, and genome stability

Artemis was initially discovered as the gene inactivated in human radiosensitive T−B− severe combined immunodeficiency, a syndrome characterized by the absence of B and T lymphocytes and cellular hypersensitivity to ionizing radiation. Hypomorphic Artemis alleles have also been identified in patients and are associated with combined immunodeficiencies of varying severity. We examine the molecular mechanisms underlying a syndrome of partial immunodeficiency caused by a hypomorphic Artemis allele using the mouse as a model system. This mutation, P70, leads to premature translation termination that deletes a large portion of a nonconserved C terminus. We find that homozygous Artemis-P70 mice exhibit reduced numbers of B and T lymphocytes, thereby recapitulating the patient phenotypes. The hypomorphic mutation results in impaired end processing during the lymphoid-specific DNA rearrangement known as V(D)J recombination, defective double-strand break repair, and increased chromosomal instability. Biochemical analyses reveal that the Artemis-P70 mutant protein interacts with the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit and retains significant, albeit reduced, exo- and endonuclease activities but does not undergo phosphorylation. Together, our findings indicate that the Artemis C terminus has critical in vivo functions in ensuring efficient V(D)J rearrangements and maintaining genome integrity

Shape-Based Tracking Allows Functional Discrimination of Two Immune Cell Subsets Expressing the Same Fluorescent Tag in Mouse Lung Explant

Dendritic Cells (DC) represent a key lung immune cell population, which play a critical role in the antigen presenting process and initiation of the adaptive immune response. The study of DCs has largely benefited from the joint development of fluorescence microscopy and knock-in technology, leading to several mouse strains with constitutively labeled DC subsets. However, in the lung most transgenic mice do express fluorescent protein not only in DCs, but also in closely related cell lineages such as monocytes and macrophages. As an example, in the lungs of CX3CR1+/gfp mice the green fluorescent protein is expressed mostly by both CD11b conventional DCs and resident monocytes. Despite this non-specific staining, we show that a shape criterion can discriminate these two particular subsets. Implemented in a cell tracking code, this quantified criterion allows us to analyze the specific behavior of DCs under inflammatory conditions mediated by lipopolysaccharide on lung explants. Compared to monocytes, we show that DCs move slower and are more confined, while both populations do not have any chemotactism-associated movement. We could generalize from these results that DCs can be automatically discriminated from other round-shaped cells expressing the same fluorescent protein in various lung inflammation models

Analyse de la recombinaison des gènes TCRAD : réarrangements radio-induits et structure des jonctions signal.

We have shown that irradiation of pre-TCR-deficient CD3ε-/- mice restores thymocyte differentiation, by a p53-dependent and by a p53-independent pathway. Events normally associated during normal thymocyte development are dissociated in response to radiation exposure. Both of these pathways require LAT expression. Therefore, radiation exposure activates pre-TCR-like signals. TCRA gene rearrangement is induced following radiation exposure. The signal joints resulting from TCRA gene rearrangement have the same structure than those found in wild type mice. All signal joint analyzed in un-manipulated wild type mice do exhibit junctionnal diversity. This diversity results mainly from TdT activity. We present evidences that proteins involved in DNA repair and genomic stability participated in SJ formation. We propose that signal joint diversity is not an aberrant process but is a key feature of V(D)J recombination. All our work increases our understanding of molecular events associated with V(D)J recombination.La différenciation des lymphocytes T dans le thymus est strictement contrôlée par le réarrangement des gènes codants pour les chaînes du TCR et leur expression en surface dans le cadre du pré-TCR ou du TCR. Les souris incapables d'assembler un pré-TCR présentent un blocage précoce du développement des thymocytes. Nous avons montré que l'irradiation de souris CD3ε-/-, qui sont déficientes en pré-TCR, restaure la différenciation des thymocytes par des voies différentes selon que p53 soit présente ou non. En réponse à l'irradiation, il existe une dissociation temporelle de l'activation des voies de signalisations contrôlant plusieurs événements co-régulés durant le développement des thymocytes. Ces voies sont cependant toutes deux centralisées au niveau de LAT. L'irradiation induit donc des voies de signalisations mimant les effets de l'activation du pré-TCR.La différenciation radio-induite des thymocytes immatures s'accompagne du réarrangement de novo des gènes TCRA. L'étude des jonctions signal (JS) formées lors du réarrangement des gènes TCRA ne montre pas de différences de structure entre les JS de souris sauvages ou les JS formées suite à l'irradiation. Le réarrangement TCRA radio-induit est donc probablement l'œuvre de la machinerie de recombinaison traditionnelle. Contrairement au modèles actuels de recombinaison V(D)J les JS de souris sauvages analysées présentent des modifications, quels que soient les gènes réarrangés. Nous avons pu montrer une influence de plusieurs protéines impliquées dans la réparation de l'ADN et le maintient de la stabilité du génome sur la structure des JS. Nous proposons que ces modifications ne sont pas le résultat d'un processus de recombinaison aberrant mais constituent une propriété intrinsèque de la recombinaison. Nos travaux permettent donc une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la recombinaison V(D)J

Analyse de la recombinaison des gènes TCRAD (Réarrangements radio-induits et structure des jonctions signal)

La différenciation des thymocytes est strictement contrôlée par le réarrangement des gènes codants pour les chaînes du TCR et leur expression dans le cadre du pré-TCR ou du TCR. Les souris incapables d'assembler un pré-TCR présentent un blocage du développement des thymocytes. Nous avons montré que l'irradiation de souris CD3e-/- restaure la différenciation des thymocytes en empruntant une voie P53 dépendante et une voie P53 indépendante. En réponse à l'irradiation, il existe une dissociation temporelle de l'activation des voies de signalisations contrôlant l'expression de CD2 et la reprise de la différenciation. Ces voies sont cependant toutes deux centralisées par LAT. L'irradiation active donc les voies de signalisations préTCR like. La différenciation radio-induite s'accompagne de plus du réarrangement de novo des gènes TCRA. L'étude des jonctions signal (JS) formées lors du réarrangement des gènes TCRA ne montre pas de différences de structure entre les JS de souris sauvages ou les JS formées suite à l'irradiation. Le réarrangement TCRA radio-induit est donc probablement l'œuvre de la machinerie de recombinaison traditionnelle. Quelques soient les gènes qui réarrangent, les JS de souris wt analysées, présentent des modifications résultant majoritairement de l'action de la TdT. Il semble donc que ces modifications sont une propriété intrinsèque de la recombinaison et non le résultat d'un processus infidèle. Pour finir nous avons pu montrer une influence des protéines de réparation et de maintient de la stabilité du génôme sur la structure des JS. Nos travaux permettent donc une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la recombinaison V(D)J.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Étude numérique et expérimentale des déformations mécaniques induites par le soudage

L’objectif de la présente étude est de comparer les déformations induites par deux procédés de soudage : le laser impulsionnel et le laser fibre continu. L’étude s’applique au soudage de l’alliage TA6V, pour différentes géométries de plan de joint. Les travaux seront structurés en deux parties. Un volet expérimental est mené sur des assemblages de deux plaques, l’une étant bloquée et l’autre libre. Le soudage induit des déformations dans la pièce et celles-ci sont maximales si la pièce est libre de se déformer. Ces dernières sont mesurées in-situ (capteur mécanique). Un second volet vise à modéliser la génération des contraintes et déformations résiduelles par un calcul numérique. La nécessité de disposer de caractérisations expérimentales intervient à différents maillons de la chaîne de calcul. Tout d’abord, la phase d’interaction entre le faisceau et la matière étant extrêmement complexe à simuler, l’approche thermique se fonde sur un calcul de « flux thermique équivalent ». Ceci nécessite de disposer d’une micrographie caractéristique (vue en coupe de la zone fondue) qui sera utilisée pour identifier des termes de « sources thermiques » via une procédure d’optimisation. Une procédure spécifique sera développée pour chacun des procédés. Le calcul est mené dans le logiciel élément finis COMSOL Multiphysics. Les résultats du calcul (déplacement des points de la plaque libre) sont confrontés aux résultats expérimentaux tout au long de la simulation. Le modèle est applicable à des soudages mettant en jeu des géométries complexes, pour lesquelles les effets de bridage peuvent engendrer des contraintes résiduelles

Reassignment of the murine 3′TRDD1 recombination signal sequence

International audienceT cell receptor genes are assembled in developing T lymphocytes from discrete V, D, and J genes by a site-specific somatic rearrangement mechanism. A flanking recombination signal, composed of a conserved heptamer and a semiconserved nonamer separated by 12 or 23 variable nucleotides, targets the activity of the rearrangement machinery to the adjoining V, D, and J genes. Following the rearrangement of V, D, or J genes, their respective recombination signals are ligated together. Although these signal joints are allegedly invariant, created by the head-to-head abuttal of the heptamers, some do exhibit junctional diversity. Recombination signals were initially identified by comparison and alignment of germ-line sequences with the sequence of rearranged genes. However, their overall low level of sequence conservation makes their characterization solely from sequence data difficult. Recently, computational analysis unraveled correlations between nucleotides at several positions scattered within the spacer and recombination activity, so that it is now possible to identify putative recombination signals and determine and predict their recombination efficiency. In this paper, we analyzed the variability introduced in signal joints generated after rearrangement of the TRDD1 and TRDD2 genes in murine thymocytes. The recurrent presence of identical nucleotides inserted in these signal joints led us to reconsider the location and sequence of the TRDD1 recombination signal. By combining molecular characterization and computational analysis, we show that the functional TRDD1 recombination signal is shifted inside the putative coding sequence of the TRDD1 gene and, consequently, that this gene is shorter than indicated in the databases

Impact de la fissuration a chaud sur la tenue mécanique des liaisons heterogenes Ta/TA6V

Le soudage par laser impulsionnel est un procédé à haute densité d’énergie permettant de réaliser des assemblages hétérogènes mettant en jeu des matériaux aux propriétés thermo-physiques notablement différentes. Malheureusement ce type d’assemblage peut être fragilisé par des fissures dites à chaud, générées au cours du processus de solidification du fait des écarts importants entre les températures de fusion et entre les coefficients de dilatation des pièces à assembler. C’est typiquement le cas de l’assemblage hétérogène Ta-TA6V faisant l’objet de la présente étude. La première partie de l’étude est consacré à la problématique d’assemblage. Après avoir présenté les propriétés des matériaux à assembler, les mécanismes de fissuration à chaud sont détaillés. La seconde partie de cette étude est consacrée à l’impact des fissures sur la tenue mécanique des assemblages. En fatigue, la limite d’endurance de liaisons fissurées ou non à l’issue du procédé a tout d’abord été identifiée. L’impact des hétérogénéités chimiques sur le comportement mécanique sous chargement monotone a ensuite fait l’objet d’une attention particulière. Pour cela, des éprouvettes ont été instrumentées par lithographie (dépôt de plots permettant de mesurer la déformation) et les essais ont été réalisés in-situ dans un MEB afin de mettre en relation les sites d’activité plastique prépondérante avec la microstructure locale (orientation granulaire identifiée par EBSD et composition chimique). Une approche numérique au sein du logiciel COMSOL Multiphysics a permis de corréler les microstructures observées avec les cycles thermiques subis en différents point de la zone de soudage. Pour de forts incréments de déformations, une fissure s’initie dans le matériau le plus dur et le moins ductile : le TA6V. Cette fissure suit ensuite un chemin de propagation tortueux, directement lié à la présence d’interfaces entre des zones de type cellulaire dendritique et des amas riches en tantale