Microfluidic extraction and digital quantification of circulating cell-free DNA from serum

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From Toxins Targeting Ligand Gated Ion Channels to Therapeutic Molecules

Ligand-gated ion channels (LGIC) play a central role in inter-cellular communication. This key function has two consequences: (i) these receptor channels are major targets for drug discovery because of their potential involvement in numerous human brain diseases; (ii) they are often found to be the target of plant and animal toxins. Together this makes toxin/receptor interactions important to drug discovery projects. Therefore, toxins acting on LGIC are presented and their current/potential therapeutic uses highlighted

Digital PCR: principle and applications.

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Évolution dirigée et biopile enzymatique (étude de la laccase CotA et optimisation par évolution dirigée en microfluidique digitale)

Les biopiles enzymatiques ont vu le jour pour développer des sources miniatures d électricité renouvelable. Cette technologie naissante est cependant encore limitée en termes de puissance ou de durée de vie. Bien qu encore peu employée, une stratégie pour améliorer ces performances consiste à optimiser les propriétés catalytiques ou de stabilité des enzymes. Ces travaux de doctorat décrivent le développement d une plateforme de microfluidique digitale permettant l évolution dirigée de la laccase CotA de Bacillus subtilis pour une utilisation dans une biopile enzymatique. Ces travaux démontrent la possibilité d utiliser une enzyme extrêmophile au sein d une biopile enzymatique. L efficacité de CotA en tant que biocatalyseur de la réduction de l O2 a été évaluée pour la première fois en développant des biocathodes ou des biopiles Glucose/O2 complètes. Une plateforme microfluidique modèle de criblage à très haut débit applicable à l évolution dirigée de la laccase CotA a également été mise au point et validée. La plateforme permet l encapsulation de cellules E. coli exprimant la protéine dans des microgouttelettes aqueuses de quelques picolitres, l incubation des microgouttelettes, l ajout du substrat par picoinjection puis la détection et le tri de l activité enzymatique de CotA à très haut débit (1 million de clones en seulement 4 heures). La plateforme est directement applicable au criblage de banques de mutants et les variants optimisés sélectionnés devraient mener à la création d une nouvelle génération de biopiles plus efficaces. Cette plateforme universelle de criblage constitue un outil à la fois versatile et puissant pour l évolution dirigée des protéines.Enzymatic biofuel cells have been recently developed to create miniature renewable electricity sources. However, this new technology is still limited in terms of power and lifetime compared to classical fuel cells. Although it has been rarely used yet, one strategy to improve these performances is to optimize the catalytic and stability properties of the enzymes. This PhD work describes the development of a droplet-based microfluidic platform for thr directed evolution of CotA laccase from Bacillus subtilis for enzymatic biofuel cells application. This work demonstrates the possibility of using an extremophilic enzyme inside an enzymatique biofuel cell. The efficiency of CotA as a biocatalyst for O2 reduction has been evaluated for the first time developing biocathodes or complete Glucose/O2 biofuel cells. A droplet-based microfluidic high-throughput screening platform for CotA directed evolution has also been developed and validated. This platform allows the encapsulation of E. coli cells expressing the protein in aqueous droplets of few picoliters, the incubation of droplets, the addition of the substrate using picoinjection and then the detection and the sorting of CotA enzymatic activity using very high-throughput (1 million clones in only 4 hours). The platform can be directly used for the screening of mutant libraries. Optimized selected mutants would lead to the creation of a new and more efficient generation of enzymatic biofuel cells. This universal droplet-based microfluidic screening platform is a very powerful tool for directed evolution of proteins.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Multiplex Detection of KRAS Mutations Using Passive Droplet Fusion

International audienceWe describe a droplet microfluidics method to screen for multiple mutations of a same oncogene in a single experiment using passive droplet fusion. Genomic DNA from H1573 cell-line was screened for the presence of the six common mutations of the KRAS oncogene as well as wild-type sequences with a detection efficiency of 98 %. Furthermore, the mutant allelic fraction of the cell-line was also assessed correctly showing that the technique is quantitative

Plateforme microfluidique d optimisation de biocatalyseurs pour des biopiles à combustible

Pour faire face à la baisse considérable des énergies fossiles et des ressources naturelles, différents types de biopiles à combustible ont été développés et optimisés. Ces systèmes sont capables de convertir l énergie chimique en énergie électrique à partir de ressources renouvelables grâce à des catalyseurs biologiques. Les deux problèmes majeurs des biopiles sont les faibles puissances qu elles génèrent et leur courte durée de vie. Afin de résoudre ces problèmes et augmenter les performances des biopiles, la plupart des travaux de recherche se sont principalement axés sur le développement de nouvelles stratégies pour améliorer le transfert d électrons ainsi que sur l optimisation des méthodes d immobilisation des enzymes sur les électrodes. Nous pensons que l évolution dirigée des biocatalyseurs par des cycles répétitifs de mutagenèse/sélection permettrait d augmenter leur activité dans ce nouvel environnement que constitue la biopile. Pour la création de la banque de variants, la stratégie choisie est l introduction de mutations artificielles et aléatoires dans le gène codant pour la protéine d intérêt. Pour la sélection des enzymes optimisées, nous avons choisi la technique de la compartimentation in vitro (IVC) couplée à la microfluidique, développée au sein de notre laboratoire. Cette méthode permet de créer des gouttes d eau-dans-huile de taille homogène, de les manipuler à volonté, de détecter la fluorescence de leur contenu et de les trier en se basant sur cette fluorescence afin de récupérer le variant désiré. Mon projet de thèse consiste à créer, par évolution dirigée, des biocatalyseurs spécialement adaptés à fonctionner dans les conditions de fonctionnement de biopile. Pour le compartiment anodique, nous avons choisi de tester et d optimiser différentes Pyrrolo-Quinone-Quinone-alcool déshydrogénases (PQQ- ADH) réalisant l oxydation de l éthanol en acide acétique. Une fois les électrons transférés au compartiment cathodique, une laccase bactérienne extrêmophile se charge de la réduction du dioxygène en eau. Le passage des électrons vers la cathode génère un courant proportionnel aux taux de catalyse au niveau des électrodes. Pour la mesure de l activité de ces enzymes cathodique et anodique en goutte, deux tests fluorogéniques différents ont été développés. Pour les PQQ-ADH, le test s est basé sur la réduction d une molécule fluorogénique (la résazurine) pour produire un fluorophore (la résorufine) une fois que l éthanol est oxydé en acide acétique par les enzymes. Par la suite, nous avons développé et optimisé deux plateformes microfluidiques de sélection des biocatalyseurs anodique et cathodique. L une permet de sélectionner les enzymes exprimées in vitro en gouttes et l autre de sélectionner les enzymes exprimées in vivo en gouttes. Mes travaux de thèse se sont focalisés, essentiellement sur le développement de la plateforme microfluidique de sélection des PQQ-ADH exprimée in vivo et plus précisément sur le contrôle des échanges de composés entre les gouttes, le choix du tensioactif adapté au test, la stratégie de récupération des variants sélectionnés et la validation de sa pertinence avec une sélection modèle utilisant les PQQ-ADH.To cope with the dramatic decline of fossil fuels and natural resources, different types of biofuel cell have been developed and optimized. These systems are capable of converting chemical energy into electrical energy from renewable resources by biological catalysts. The two major problems which limit their application are the small amount of power they generate and their short-lived. Our goal is to build a functional biofuel cell using enzymes as redox catalysts at the anode (Pyrrolo-Quinone-Quinone-alcool déshydrogénases, PQQ-ADH) and the cathode (laccase). To achieve this goal the key points are a high catalytic activity of these enzymes at high ethanol concentrations, broad pH and temperature variations and their stability at the interface with the electrodes. These are conditions under which the natural enzyme will never evolve in vivo. Hence, we are aiming to apply in vitro protein evolution methods in combination with digital microfluidics to create better catalysts for the green energy production. Digital microfluidics is a novel and promising high-throughput screening technique which can emulsify samples in droplets of a volume as small as ~1pL. These tiny droplets can mimic artificial cells allowing expressing the genes of interest and test for their enzymatic activity. Even more important, digital microfluidics allows droplets fusion, content mixing, incubations, signal detection and sorting of positives variants separately. In addition, with being a very powerful high-throughput technique, our approach will procure an unprecedented level of control over the directed evolution experiments. For a successful evolution of ADH and laccase using digital microfluidics, the following challenges need to be addressed (before performing directed evolution of the catalysts): 1. Synthesis and detailed characterisation of surfactants used in digital microfluidic experiments (emulsion stability, leakage and biological compatibility). 2. Creation of a reliable microfluidic chip allowing to detect and sort the droplets containing highly active biocatalysts. 3. Controling the leakage of compounds between droplets. 4. Optimisation of the recovery strategy selected variants and validate its relevance with a model selection of PQQ-ADH.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Droplet-Based Microfluidics Digital PCR for the Detection of KRAS Mutations

International audienceWe demonstrate an accurate and sensitive quantification of mutated KRAS oncogene in genomic DNA, using droplet-based microfluidics and digital PCR

Développement de nouvelles techniques de microfuidique en gouttes pour la détection des biomarqueurs de cancer

Le cancer constitue un problème majeur de santé publique en France. La nécessité de disposer d un test capable de détecter très précocement une tumeur, avant même qu elle ne soit décelable par l imagerie (et surtout avant les métastases) ne fait pas doute. Pour l heure, la voie la plus prometteuse pour détecter la maladie demeure la mise au point des tests simples, fiables, rapides et hautement sensibles, reposant sur le dosage de marqueurs génétiques (des biomarqueurs). Nous avons développé une procédure non-invasive, innovante et au moins 1000 fois plus sensible que les méthodes actuelles (0,0005% de séquences mutées détectées parmi un excès de séquences non-mutées), pour le criblage des biomarqueurs spécifiques des cancers. Elle peut facilement être utilisée pour le diagnostic, le pronostique ou la prédiction des procédures de gestion clinique des patients souffrant du cancer colorectal et par après pour les patients souffrant d autres types de cancer. Cette méthode est basée sur l utilisation des millions de microgouttelettes en tant qu autant de bioréacteurs indépendants. Apportant ainsi la possibilité d analyse chaque molécule d ADN indépendamment, elle permettra de détecter spécifiquement une minorité de séquences mutantes au sein d une forte quantité de séquences non mutées et avec un débit important. Nous avons développé cette stratégie pour la détection des mutations de l oncogène KRAS (responsables des non-réponses aux thérapies ciblées) et nous l avons validé avec la détection de mutations KRAS dans les échantillons de plasma sanguin et de tumeur des patients atteints d un cancer colorectal métastatique. Notre méthode trouvera son utilité non seulement dans le domaine du diagnostic précoce des cancers, mais aussi dans cas de la prédiction de la réponse aux traitements ciblés grâce à la détection de biomarqueurs spécifiques.The aim of this work is to establish novel strategies for the highly sensitive screening of cancer biomarkers in biological samples.To achieve this goal, we developed droplet-based microfluidic dPCR technique. Using a limiting dilution, individual DNA molecules are encapsulated within monodisperse droplets of a water-in-oil emulsion created with a microfluidic device. Fluorescent TaqMan® probes targeting the screened cancer biomarkers allow the detection of mutations. We focused on the mutations in the human KRAS gene for the development of our test. This method is also transposable in a multiplexed format for the parallel detection of multiple mutations in clinical samples.The developed technique allowed the precise quantification of a mutated KRAS gene in the presence of a 200,000-fold excess of un-mutated KRAS genes and enabled the determination of mutant allelic specific imbalance (MASI) in several cancer cell-lines. We validated our technique by screening for KRAS mutations in the blood plasma and tumor samples from patients with metastatic colorectal cancer.STRASBOURG-Bib.electronique 063 (674829902) / SudocSudocFranceF

Digital PCR: principle and applications.

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