Global reachability of 2D structured systems

In this paper the new concept of 2D structured system is defined and a characterization of global reachability is obtained. This extends a well known result for 1D structured systems, according to which (A ,B ) is (generically) reachable if and only if the matrix [A B] is full generically row rank and irreducible

Desenvolvimento de biomarcadores para avaliação dos efeitos disruptores endócrinos da exposição a ambiente vulcânico usando a glândula suprarrenal de Mus musculus

Dissertação de Mestrado, Ambiente, Saúde e Segurança, 29 de janeiro de 2019, Universidade dos Açores.As populações que vivem em áreas de vulcanismo ativo estão expostas aos poluentes emitidos pela desgaseificação difusa dos solos. Este estudo tem como principal objetivo avaliar as alterações histológicas na glândula suprarrenal de ratinhos (Mus musculus) decorrentes da exposição ao ambiente vulcânico. Para alcançar este objetivo foram recolhidos 8 ratinhos expostos ao ambiente vulcânico (grupo exposto) e 23 ratinhos recolhidos em Rabo de Peixe (grupo controlo), nos quais foram estudados os seguintes parâmetros histológicos da suprarrenal: a área e o perímetro totais da suprarrenal; a área e o perímetro do córtex, e a espessura das diferentes zonas constituintes do córtex (zona glomerulosa, zona fasciculada e zona reticulada); e, a área, o perímetro e o diâmetro da medula. Tendo em conta os resultados obtidos para a idade verificou-se que os ratinhos do grupo exposto são significativamente mais velhos, o que implica mais tempo de exposição ao ambiente vulcânico, o que poderá resultar em fadiga cortical. Na medula adrenal, os resultados obtidos refletem que a exposição ao ambiente vulcânico não resultou em alterações histológicas significativas dos parâmetros analisados. Assim, as diferenças encontradas nos valores de área e perímetro da suprarrenal devem-se às alterações verificadas no córtex adrenal. Analisando as três zonas do córtex, comparando o grupo controlo com o grupo exposto, é possível depreender que, para a zona glomerulosa, não existem diferenças significativas ao nível da sua espessura. Relativamente à zona fasciculada e à zona reticulada, estas apresentaram uma redução significativa de espessura no grupo exposto comparativamente ao grupo controlo. Os ratos das Furnas estão permanentemente expostos a uma atmosfera bastante rica em CO₂ (hipercapnia) e pobre em O₂ (hipoxia). Os resultados obtidos poderão encontrar explicação na exposição crónica a um ambiente bastante rico em CO₂, a qual poderá produzir uma redução dos níveis de ansiedade e de stress (devido ao efeito relaxante deste gás) com a concomitante redução da solicitação do córtex adrenal e, consequentemente, à sua atrofia. Outra hipótese para explicar os resultados obtidos é a ocorrência de hipocortisolismo, devido à redução da produção de cortisol na zona fasciculada como consequência de uma exposição crónica ao stress ambiental, resultando num quadro de fadiga adrenal por excesso de estimulação da glândula sem que nunca se consiga atingir um equilíbrio. Com base nos resultados obtidos pode concluir-se que, para além de o Mus musculus ser um bom bioindicador para a biomonitorização dos efeitos do vulcanismo, a espessura do córtex, e em particular da zona fasciculada, constituem bons biomarcadores de exposição.ABSTRACT: Populations that live around active volcanic areas are more exposed to pollutants emitted from soil degassing. The main objective of this study is to evaluate the histological changes in adrenal gland of mice (Mus musculus) exposed to a volcanic environment. To achieve this goal, 8 mice exposed to the volcanic environment and 23 mice from Rabo de Peixe (control group) were colleted, in which the following histological parameters of the adrenal were studied: the total area and perimeter of the adrenal gland; area and perimeter of cortex; the thickness of the different layers of the córtex (zona glomerulosa, zona fasciculata and zona reticularis); area, perimeter and diameter of the adrenal medulla. The results show that mice exposed to the volcanic environment (exposed group) are significantly older, and therefore have been longer exposed to the volcanic environment, which may have resulted in cortical fatigue. Nevertheless, the results obtained reflect that the exposure to the volcanic environment did not result in significant alterations of the adrenal medulla. Thus, the differences found in the adrenal area and perimeter values are due to changes in the adrenal cortex. The analysis of the three layers of the cortex showed that there were no significant differences in the thickness of zona glomerulosa between the studied groups. Both zona fasciculata and zona reticularis presented a significant reduction of their thickness in the exposed group when compared to the control group. Furnas mice are permanently exposed to an atmosphere rich in CO₂ (hypercapnia) and poor in O₂ (hypoxia). These results may be explained by the chronic exposure to an environment rich in CO₂: due to the relaxing effect of this gas, such exposure probably produced a reduction in anxiety and stress levels resulting in a reduction of the adrenal cortex and, consequently, its atrophy. Another explanation for the obtained results, may be the occurrence of hypocortisolism, i.e., the reduction of cortisol production by the zona fasciculata. This situation may be due to chronic exposure to environmental stress, resulting in adrenal fatigue due to the over stimulation of the cortex without ever being able to reach a balance. Based on the results, we can conclude that, Mus musculus is a good bioindicator for the biomonitoring of the effects of volcanism, being the thickness of the cortex, and in particular the zona fasciculata, effective biomarkers of exposure

Dicionário aberto : um recurso para processamento de linguagem natural

Este artigo apresenta o projecto Dicionário Aberto, a construção de um dicionário aberto, livre e gratuíto, para a língua portuguesa. Para ajudar no arranque optou-se pela transcrição de um dicionário em papel no domínimo público: Novo Diccionário da Língua Portuguesa, de Cândido de Figueiredo, de 1913. Apresentamos o processo usado para a transcrição bem como a metodo- logia usada para garantir um patamar de qualidade mínima da transcrição, e como o dicionário foi posteriormente convertido para um formato XML, per- mitindo uma maior facilidade de processamento a terceiros. Finalmente, são discutidos os problemas existentes no uso de um dicio- nário com quase um século, e como se pretende proceder à sua modernização (de conteúdos e de grafia), e de que forma este recurso pode ser útil para o processamento da língua portuguesa.This document presents Dicionário Aberto project which aims at the construction of an open-source and free dictionary, for the Portuguese language. To help the bootstrap process, a paper dictionary in the public domain was transcribed: Novo Diccionário da Língua Portuguesa, of Cândido de Figueiredo, from 1913

First advances in near fall detection and prediction when using a walker

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Eletrónica Médica)Falls are a major concern to society. Several injuries associated with falls need medical care, and in the worst-case scenario, a fall can lead to death. These consequences have a high cost for the population. In order to overcome these problems, a diversity of approaches for detection, prediction, and prevention of falls have been tackled. Walkers are often prescribed to subjects who present a higher risk of falling. Thus, it is essential to develop strategies to enhance the user's safety in an imminent danger situation. In this sense, this dissertation aims to develop a strategy to detect a near fall (NF) and its direction as well as the detection of incipient near fall (INF) while the subject uses a walker. Furthermore, it has the purpose of detecting two gait events, the heel strike (HS) and the toe-off (TO). The strategies established, in this work, were based on the data gathered through an inertial sensor placed on the lower trunk and force sensors placed on the insoles. Following data collection, the methodology adopted to identify the situations aforementioned was based on machine learning algorithms. In order to reach the model with best performance, many combinations of different classifiers were tested with three feature selection methods. Regarding the detection of NF, the results achieved presented a Matthews Correlation Coefficient (MCC) of 79.99% being possible to detect a NF 1.76±0.76s before its end. With the implementation of the post-processing algorithm, a large part of the false positives was eliminated being able to detect all NF 1.48±0.68s before its end. Concerning the models built to distinguish the direction of the NF, the best model presented accuracy of 58.97% being unable to reliably distinguish the three fall directions. The methodology followed, in this work, was unsuccessful to detect an INF. The best model presented MCC=23.87%, in this case. Lastly, with respect to the detection of HS and TO events the best model reached MCC=86.94%. With the application of the post-processing algorithm, part of misclassified samples was eliminated, however, a delay in the detection of the HS and TO events was introduced. With the post-processing it was possible to reach MCC=88.82%, not including the imposed delay.As quedas representam uma grande preocupação para a sociedade. Várias lesões associadas às quedas necessitam de cuidados médicos e, no pior dos casos, uma queda pode levar à morte. Estas consequências traduzem-se em custos elevados para a população. A fim de ultrapassar estes problemas, várias abordagens têm sido endereçadas para deteção, previsão e prevenção das quedas. Os andarilhos são muitas vezes prescritos a sujeitos que apresentam um risco de queda maior. Desta forma, é essencial desenvolver estratégias para aumentar a segurança do utilizador perante uma situação de perigo iminente. Neste sentido, esta dissertação visa desenvolver uma estratégia que permita a deteção de uma quase queda (NF) e a sua direção, assim como a deteção incipiente de uma NF (INF). Para além disso, tem o objetivo de detetar dois eventos de marcha, o heel strike (HS) e o toe-off (TO). As estratégias definidas, neste trabalho, basearam-se nos dados recolhidos através de um sensor inercial posicionado no tronco inferior e de sensores de força colocados nas palmilhas. Após a aquisição dos dados, a metodologia adotada para identificar as situações anteriormente referidas foi baseada em algoritmos de machine learning. Com o intuito de obter o modelo com melhor desempenho, várias combinações de diferentes classificadores foram testadas com três métodos de seleção de features. No que concerne à deteção da NF, os resultados alcançados apresentaram um Matthews Correlation Coefficient (MCC) de 79.99% sendo possível detetar uma NF 1.76±0.76s antes do seu final. Com a implementação do algoritmo de pós-processamento, grande parte dos falsos positivos foram eliminados, sendo possível detetar todas as NF 1.48±0.68s antes do seu final. Em relação aos modelos construídos para distinguir a direção da NF, o melhor modelo apresentou uma precisão (ACC) de 59.97%. A metodologia seguida neste trabalho não foi bem sucedida na deteção INF. O melhor modelo apresentou um MCC=23.87%. Relativamente à deteção dos eventos, HS e TO, o melhor modelo atingiu um MCC=86.94%. Com a aplicação do algoritmo de pós-processamento parte das amostras mal classificadas foram eliminadas, no entanto, foi introduzido um atraso na deteção do HS e do TO. Com o pós-processamento foi possível obter um MCC=88.82%, não incluindo o atraso imposto pelo pós-processamento

Integration of multi-shell diffusion imaging derived metrics in tractography reconstructions of clinical data

Tese de mestrado integrado Engenharia Biomédica e Biofísica (Engenharia Clínica e Instrumentação Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019Nos últimos anos, com o rápido avanço das técnicas imagiológicas, a oportunidade de mapear o cérebro humano in vivo com uma resolução sem precedentes tornou-se realidade, permanecendo ainda hoje como uma das áreas de maior interesse da neurociência. Sabendo que o movimento natural das moléculas de água nos tecidos biológicos é altamente influenciado pelo ambiente microestrutural envolvente, e que a anisotropia que este processo aleatório assume na matéria branca pode ser explorada com o intuito de inferir características importantes associadas ao tecido neuronal, a ressonância magnética ponderada por difusão (dMRI, do inglês “Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging") afirmou-se como a técnica de imagem mais amplamente utilizada para a investigação in vivo e não invasiva da conectividade cerebral. A primeira técnica padrão de dMRI foi a imagiologia por tensor de difusão (DTI, do inglês "Diffusion Tensor Imaging"). Implementada com a capacidade de fornecer sensibilidade à microestrutura do tecido, esta técnica permite extrair informação acerca da tridimensionalidade da distribuição da difusão de moléculas de água através da aplicação de seis gradientes de difusão não colineares entre si. Além da difusividade média (MD, do inglês "Mean Diffusivity"), é também possível extrair outros índices microestruturais, como a anisotropia fraccional (FA, do inglês "Fractional Anisotropy"), que fornece informação acerca da percentagem de difusão anisotrópica num determinado voxel. Ambas as métricas são amplamente utilizadas como medidas de alterações microestruturais, todavia, apesar da sua sensibilidade, estes marcadores não são específicos quanto às características individuais da microestrutura tecidual. Regiões com reduzida FA podem camuflar regiões de conformação de cruzamento de fibras, ou fibras muito anguladas, que a DTI não consegue resolver. A razão para esta limitação reside no número reduzido de diferentes direções de difusão que são exploradas, assim como no pressuposto de que a distribuição das moléculas de água é gaussiana, o que não é necessariamente verdade. De forma alternativa e com o intuito de tais limitações serem ultrapassadas, é possível implementar uma representação matemática do sinal adquirido de forma a explorar o propagador de difusão, da qual a imagiologia por ressonância magnética do propagador aparente médio (MAP-MRI, do inglês “Mean Apparent Propagator Magnetic Resonance Imaging”) é exemplo. Esta técnica analítica caracteriza-se pelo cálculo da função de densidade de probabilidade associada ao deslocamento de spin, o que permite descrever o caráter não-gaussiano do processo de difusão tridimensional e quantificar índices escalares inerentes ao processo de difusão, os quais sublinham as características complexas intrínsecas à microestrutura do tecido. Estes parâmetros incluem o deslocamento médio quadrático (MSD, em inglês “mean square displacement”), a probabilidade de retorno à origem (RTOP, do inglês “return-to-the origin probability”) e suas variantes de difusão em uma e duas dimensões – a probabilidade de retorno ao plano (RTPP, do inglês “return-to-the plane probability”) e a probabilidade de retorno ao eixo (RTAP, do inglês “return-to-the axis probability”), respetivamente. Em resposta às limitações da DTI associadas à falta de especificidade para distinguir características microestruturais dos tecidos, surgiu ainda o modelo de Dispersão de Orientação de Neurite e Imagem de Densidade (NODDI, do inglês “Neurite Orientation Dispersion and Density Imaging”), o qual utiliza o processo de difusão para estimar a morfologia das neurites. Tendo como premissa subjacente que o sinal de difusão pode ser definido pela soma da contribuição dos sinais de diferentes compartimentos, este modelo biofísico diferencia o espaço intra e extracelular o que, por sua vez, permite quantificar a dispersão e densidade das neurites. Deste modo, dois parâmetros intrínsecos à microestrutura envolvente podem ser calculados: a densidade neurítica e o índice de dispersão da orientação das neurites. No entanto, de forma a garantir a viabilidade clínica do modelo, este pode ser aplicado por meio do método AMICO (do inglês “Accelerated Microstructure Imaging via Convex Optimization”) através do seu ajuste linear, o que permite o cálculo do índice de dispersão da orientação das neurites (ODI, do inglês “Orientation Dispersion Index”), da fração de volume intracelular (ICVF do inglês, “Intracellular Volume Fraction”), e da fração de volume isotrópico (ISOVF, do inglês “Isotropic Volume Fraction”). O estudo da configuração arquitetural das estruturas cerebrais in vivo, por meio da dMRI associada aos métodos de tractografia, permitiu a reconstrução não invasiva das fibras neuronais e a exploração da informação direcional inerente às mesmas, sendo que o seu estudo tem revelado uma enorme expansão por meio do estabelecimento de marcadores biológicos perante a presença de diversas condições patológicas. O objetivo principal desta dissertação prende-se com existência de uma variação proeminentenas métricas de difusão ao longo dos tratos de matéria branca no cérebro humano. Atualmente, a maioriados estudos de tractografia tem por base uma abordagem que se resume à análise do valor escalar médio da métrica de difusão para a estrutura cerebral em estudo, pelo que se tem verificado um crescente interesse na utilização de métodos que considerem a extensão da variabilidade nas métricas de difusão ao longo dos tratos de modo a providenciarem um maior nível de detalhe ao nível do processo de difusão, evitando interpretações erróneas dos parâmetros microestruturais. Desta forma, em primeiro lugar, foi desenvolvido uma análise ao longo dos tratos de matéria branca, tendo por base a variação dos valores assumidos pelos parâmetros microestruturais acima mencionados. No presente estudo foi possível demonstrar a eficácia de tal abordagem ao longo de três tratos de matéria de branca (fascículo arqueado, trato corticoespinhal, e corpo caloso), para além de permitir, através da variância assumida pelos diversos parâmetros microestruturais, o estudo detalhado de regiões anatómicas que assumem uma distribuição complexa de múltiplos conjuntos populacionais de fibras, como é o caso do centro semioval, o qual constitui uma região de cruzamento de fibras provenientes dos três tratos de matéria branca em estudo. De seguida, esta técnica foi utilizada com sucesso na identificação de diferenças microestruturais por meio do estudo dos diversos parâmetros de difusão em pacientes com diagnóstico prévio de epilepsia no lobo temporal (TLE, do inglês “Temporal Lobe Epilepsy”), com foco epiléptico localizado no hemisfério esquerdo, e controlos. O estudo do ambiente microestrutural por meio dos múltiplos mapas escalares permitiu averiguar a alteração do processo de difusão e/ou anisotropia, associadas ao efeito fisiopatológico da TLE na organização da matéria branca. Os resultados revelaram diferenças localizadas, as quais se traduziram num aumento da difusividade e redução da anisotropia do processo de difusão ao longo dos tratos em estudo dos pacientes com TLE, sugerindo deste modo uma perda na organização das diversas estruturas anatómicas e a expansão do espaço extracelular face aos controlos. Verificou-se ainda que pacientes com esta condição neurológica sofrem de alterações microestruturais que afetam redes cerebrais em grande escala, envolvendo regiões temporais e extratemporais de ambos os hemisférios. Adicionalmente, aplicada como técnica capaz de investigar padrões de mudança na matéria branca, procedeu-se à realização de um estudo assente na estatística espacial baseada no trato (TBSS, do inglês “Tract-Based Spatial Statistics”). Após a exploração das diversas métricas de difusão, os pacientes com TLE (com lateralização à esquerda) demonstraram alterações no processo de difusão, ilustradas pelos diversos padrões de mudança microestrutural de cada métrica em estudo, concordantes com os resultados anteriormente aferidos pela análise ao longo do trato. Por fim, uma análise baseada em fixel (FBA, do inglês “Fixel-Based Analysis”) foi realizada, a qual permitiu uma análise estatística abrangente de medidas quantitativas da matéria branca, com o intuito de detetar alterações no volume intra-axonal por variação na densidade intra-voxel e/ou reorganização da morfologia macroscópica. Para identificar tais diferenças entre pacientes e controlos, três parâmetros foram considerados: densidade das fibras (FD, do inglês “Fibre Density”), seção transversal do feixe de fibras (FC, do inglês “Fibre-bundle Cross-section”), e densidade de fibras e seção transversal (FDC, do inglês “Fibre Density and Cross-section). Reduções na FD, FC e FDC foram identificadas em pacientes com TLE (com lateralização à esquerda) em comparação com os controlos, o que está de acordo com as mudanças microestruturais que resultam do processo de degeneração que afeta as estruturas de matéria branca com a perda de axónios na presença de uma condição neuropatológica como a TLE. Apesar do resultado final positivo, tendo em conta a meta previamente estabelecida, está aberto o caminho para o seu aperfeiçoamento, tendo em vista as direções futuras que emergem naturalmente desta dissertação. Como exemplo disso, poder-se-á recorrer ao estudo pormenorizado das metodologias técnicas associadas à abordagem apresentada que tem por base a análise das métricas de difusão ao longo dos tratos de matéria branca, uma vez que o desvio padrão associado a cada valor atribuído pelas diversas métricas foi significativo, o que de alguma forma poderá ter influenciado os resultados e, consequentemente, as conclusões deles extraídas, tendo em vista a sua viabilidade enquanto aplicação clínica. Como nota final, gostaria apenas de salientar que a imagiologia por difusão e, em particular, a tractografia têm ainda muito espaço para progredir. A veracidade desta afirmação traduz-se pela existência de uma grande variedade de modelos e algoritmos implementados, bem como de técnicas e metodologias de análise à informação microestrutural retida tendo por base o perfil de difusão que carateriza cada trato em estudo, sem que no entanto, exista consenso na comunidade científica acerca da melhor abordagem a seguir.Diffusion-weighted magnetic resonance imaging (dMRI) is a non-invasive imaging method which has been successfully applied to study white matter (WM) in order to determine physiological information and infer tissue microstructure. The human body is filled with barriers affecting the mobility of molecules and preventing it from being constant in different directions (anisotropic diffusion). In the brain, the sources for this anisotropy arise from dense packing axons and from the myelin sheath that surrounds them. Diffusion Tensor Imaging (DTI) is widely used to extract fibre directions from diffusion data, but it fails in regions containing multiple fibre orientations. The constrained spherical deconvolution technique had been proposed to address this limitation. It provides an estimate of the fibre orientation distribution that is robust to noise whilst preserving angular resolution. As a noninvasive technique that generates a three-dimensional reconstruction of neuronal fibres, tractography is able to map in vivo the human WM based on the reconstruct of the fibre orientations from the diffusion profile. Most of the tractography studies use a “tract-averaged” approach to analysis, however it is well known that there is a prominent variation in diffusion metrics within WM tracts. In this study we address the challenge of defining a microstructural signature taking into account the potentially rich anatomical variation in diffusion metrics along the tracts. Therefore, a workflow to conduct along-tract analysis of WM tracts (namely, arcuate fasciculus, corticospinal and corpus callosum) and integrate not only DTI derived measures, but also more advanced parameters from Mean Apparent Propagator-Magnetic Resonance Imaging (MAP-MRI) and Neurite Orientation Dispersion and Density Imaging (NODDI) model, was developed across healthy controls and patients with Temporal Lobe Epilepsy (TLE). Beyond the true biological variation in diffusion properties along tracts, this technique was applied to show that it allows a more detailed analysis of small regions-of-interest extracted from the tract in order to avoid fibres from WM pathways in the neighbourhood, which might lead to equivocal biological interpretations of the microstructural parameters. Consequently, the along-tract streamline distribution from the centrum semiovale, which is known to be a complex fibre geometry with multiple fibres populations from arcuate fasciculus, corticospinal and corpus callosum, was investigated. Finally, to validate our approach and highlight the strength of this extensible framework, two other methods were implemented in order to support the conclusions derived from the along-tract analysis computed between-groups. Firstly, a tract-based spatial statistics (TBSS) analysis was performed to study the WM change patterns across the whole brain in patients with TLE, and explore the alteration of multiple diffusion metrics. This voxel-based technique provides a powerful and objective method to perform multi-subject comparison, based on voxel-wise statistics of diffusion metrics but simultaneous aiming to minimize the effects of misalignment using a conventional voxel-based analysis method. With this in mind, the results showed increased diffusivity and reduced diffusion anisotropy, suggesting a loss of structural organization and expansion of the extracellular space in the presence of neuropathological condition as TLE. Secondly, the fixel-based analysis (FBA) was performed allowing a comprehensive statistical analysis of WM quantitative measures in order to have access to changes that may result within WM tracts in the presence of TLE. The microstructural/macrostructural changes in WM tracts of TLE patients were observed in temporal and extratemporal regions of both hemispheres, which agrees with the concept that epilepsy is a network disorder

Purification of DNA vaccine to prevent or treat cervical cancer

Human Papillomavirus (HPV) is worldwide sexually transmitted and associated with 99.7% of cervical cancer. The cancer progression is due to the expression of the oncoproteins E6 and E7, which can alter the cell cycle and are responsible for the viral replication and transformation of host cells. The vaccines available are only preventive ones, it being necessary to develop therapeutic ones, to prevent and treat a pre-existent infection. Deoxyribonucleic acid (DNA) vaccination along with the use of plasmid DNA (pDNA) as a non-viral vector arises as a good strategy that can activate both humoral and cellular immune responses, allowing the prevention and treatment of HPV infections. The combination of the amino-acid affinity chromatography (AC) with the innovative monolithic supports appears as a promising approach to obtain highly purified supercoiled (sc) pDNA – the active biological conformation – with high purity and recovery. This allows the selective interaction of specific ligands to the target biomolecule adding to the higher capacity of monoliths when compared to conventional chromatographic supports. Monoliths also allow the use of high flow rates, which allows a fast purification procedure and decreases the retention time of the target biomolecule, avoiding its degradation. In the present work, different elution strategies (manipulation of sodium chloride (NaCl) concentrations and/or pH and competition) were explored, in order to purify the supercoiled HPV-16 E6/E7MUT pDNA, by using the arginine monolith with spacer arm. The best elution strategy applied on both laboratorial and preparative scales allowed the removal of impurities within the regulatory agency recommendations, with 93.3% and 98.5% of purity degree, respectively. This reinforces the applicability of this monolith for the sc pDNA purification. Moreover, only one in thousands naked plasmids presented to the cells reach the nucleus and are expressed. The use of nanoparticles is a valuable strategy that permits the protection of the pDNA by avoiding the enzymatic degradation and facilitates the specific delivery, enhancing the cellular transfection. Thus, different magnesium carbonate (MgCO3) systems were characterized regarding its encapsulation efficiency (around 87%), morphology (round shape), size (99.7-237.4 nm) and zeta potential (positive). These data suggest that the developed nanoparticles are suitable for cellular uptake and thus appropriate for therapeutic applications. Additionally, in vitro studies accompanied with confocal microscopy were performed, which revealed that all the formulated systems are able to transfect eukaryotic cells.A infeção causada pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV) é uma doença sexualmente transmitida, que afeta tanto homens como mulheres a nível mundial. Em último caso, a infeção causada pelo HPV pode levar ao aparecimento de massas tumorais. De facto, o ácido desoxirribonucleico (DNA) do HPV foi encontrado em 99,7% dos casos de cancro do colo do útero, provocando mais de meio milhão de mortes. A progressão do cancro é devida à expressão das oncoproteínas E6 e E7, consideradas tumorogénicas pela sua capacidade de alterar o ciclo celular, sendo estas responsáveis pela replicação viral e transformação e imortalização das células hospedeiras. Atualmente, existem apenas duas vacinas comercializadas contra a infeção pelo HPV: a Gardasil® e a Cervarix®. Estas vacinas profiláticas ativam unicamente a imunidade humoral, pela geração de anticorpos contra o HPV e são somente preventivas, ou seja, apenas são efetivas antes de ocorrer a infeção. Assim, as vacinas terapêuticas têm a promissora vantagem de conseguir eliminar lesões pré-existentes e até tumores. Surgem então algumas estratégias terapêuticas inovadoras, como a terapia génica e as vacinas de DNA, que ativam tanto a resposta humoral como a celular, permitindo a prevenção e o tratamento de doenças como o cancro do colo do útero. Nas vacinas de DNA, o uso do DNA plasmídico (pDNA) como vetor não viral torna-se bastante apelativo, não só pela sua baixa toxicidade e elevada segurança, mas também pela simples produção e aplicação. A produção destas vacinas requer a purificação à escala preparativa do pDNA superenrolado (sc), considerada a isoforma biologicamente ativa. É, por isso, necessário explorar diversas estratégias de purificação de forma a obter o maior rendimento e pureza do pDNA sc. A cromatografia de afinidade com aminoácidos tem demonstrado ser uma abordagem promissora, pois permite a interação seletiva entre ligandos específicos e as biomoléculas de interesse, à semelhança de interações biológicas que ocorrem naturalmente entre proteínas a aminoácidos no organismo. Para além disso, o uso de monolitos como suporte cromatográfico tem vindo a demonstrar que estes suportes são uma excelente alternativa aos convencionais, visto terem uma maior capacidade de ligação para moléculas de grandes dimensões e que possibilitam a utilização de fluxos mais elevados, diminuindo o tempo de retenção da biomolécula de interesse, evitando assim a sua degradação. Assim, o presente trabalho teve como primeiro objetivo explorar diferentes estratégias de eluição cromatográficas, utilizando um monolito de arginina com um braço espaçador, no sentido de purificar o pDNA sc a usar numa vacina de DNA contra o cancro do colo do útero. Inicialmente, foram realizados vários ensaios, quer em condições de eluição iónicas quer hidrofóbicas, para avaliar o comportamento cromatográfico e a influência dos diferentes grupos imobilizados no monolito de epóxi. Depois, o monolito de arginina com um braço espaçador foi caracterizado em termos de capacidade dinâmica de ligação (2.53 mg/mL obtido a 10% da curva “breakthrough”), confirmando que este suporte apresenta maior capacidade de ligação do que um suporte convencional (0.133 mg/mL), modificados com o mesmo ligando (arginina). Por outro lado, este valor é menor que o valor de capacidade de ligação obtido com o monolito de arginina (3.55 mg/mL), provavelmente devido à eletronegatividade do braço espaçador que promove repulsão pelo pDNA. Para avaliar a seletividade do suporte, vários ensaios foram realizados utilizando amostras de plasmídeo pré-purificado com o kit comercial (isoformas circular aberta, linear e sc), manipulando a concentração de cloreto de sódio (NaCl) e o pH do tampão de eluição. Os resultados comprovaram que é possível obter a isoforma sc purificada, apesar da sua recuperação ser ligeiramente sacrificada. Posteriormente, prosseguiu-se para a purificação do pDNA sc a partir de uma amostra mais complexa de lisado de Escherichia coli (E. coli). Diferentes estratégias de eluição foram abordadas, incluindo a manipulação de NaCl e pH, assim como a adição de arginina no tampão de eluição como agente de competição. Após várias otimizações, a estratégia que melhor resultou na purificação da isoforma de interesse foi a de um gradiente por passos com o tampão de equilíbrio a 680 mM de NaCl em tampão 10 mM tris e 10 mM EDTA (Tris-EDTA), pH 7 e o tampão de eluição a 649 mM e 1 M de NaCl em Tris-EDTA, pH 7,5. Esta estratégia cromatográfica permitiu obter o plasmídeo sc com 93,3% de pureza e 72% de recuperação. A aplicabilidade do monolito de arginina com um braço espaçador na purificação do plasmídeo à escala preparativa também foi avaliada, tendo-se recuperado o plasmídeo com 98,5% de pureza. As impurezas (DNA genómico, proteínas e endotoxinas) das frações recolhidas de pDNA sc, tanto na escala laboratorial como na preparativa, foram quantificadas, estando os resultados dentro dos valores recomendados pelas agências reguladoras. Assim sendo, o monolito de arginina com um braço espaçador permitiu uma rápida e eficaz separação do pDNA sc, recorrendo a baixas concentrações de sal, tanto numa escala laboratorial como preparativa. Por outro lado, sabe-se que apenas um em mil plasmídeos apresentados às células eucarióticas conseguem alcançar o núcleo e levar à expressão do gene de interesse. Desta forma, torna-se crucial desenvolver estratégias que permitam a proteção do pDNA e que facilitem a sua entrada no núcleo. O uso de nanopartículas tem revelado ser uma valiosa solução, pois além de protegerem o pDNA da degradação enzimática, permitem uma entrega específica e, consequentemente, um aumento na transfeção celular. Assim sendo, este trabalho teve como segundo objetivo a formulação de nanopartículas de carbonato de magnésio (MgCO3) e gelatina, funcionalizadas com os ligandos de manose e galactose para direcionar as nanopartículas para as células alvo (células dendríticas). Em termos da morfologia, as imagens obtidas na microscopia eletrónica de varrimento (SEM) e na microscopia eletrónica de transmissão (TEM) permitiram concluir que todos os sistemas adquirem uma forma arredondada. Foi também calculada a eficiência de encapsulação (EE) dos diferentes sistemas com diferentes quantidades de pDNA, constatando-se que o sistema com 5 µg de pDNA possibilitou uma melhor encapsulação (cerca de 87%). Para além disso, a gelatina permitiu diminuir o tamanho médio das nanopartículas e a funcionalização com os ligandos de manose e galactose não aumentou significativamente o tamanho das nanopartículas de gelatina, estando os valores entre 99,7 nm e 237,4 nm. Por fim, os valores do potencial zeta foram positivos, o que sugere uma interação facilitada das nanopartículas com a membrana celular que é carregada negativamente, possibilitando uma transfeção mais eficiente. Todos os sistemas estudados apresentam características promissoras para um uptake celular adequado, o que foi comprovado pela transfecção de células HeLa. Em conclusão, o presente trabalho mostrou que o monolito de arginina com braço espaçador permitiu a purificação do pDNA sc com um bom grau de pureza e recuperação e as nanopartículas de MgCO3 provaram ser um sistema de entrega eficiente, sendo uma estratégia promissora para o desenvolvimento de uma vacina de DNA eficaz contra infeções provocadas pelo HPV

Rugosidade de superfície de resinas compostas: diferentes procedimentos de polimento e acabamento

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas MonizIntrodução: No âmbito da dentisteria restauradora o objectivo é criar uma interacção benéfica entre a restauração, os tecidos dentários e o meio oral envolvente, sendo para isso, o polimento e acabamento das restaurações um dos passos essenciais. A resina composta, enquanto material restaurador, tem sido amplamente utilizada não só pelo aperfeiçoamento das suas características bem como pelas exigências estéticas dos pacientes. Objectivo: Comparar a rugosidade de superfície de duas resinas compostas aplicando diferentes sistemas de polimento. Materiais e métodos: As resinas compostas utilizadas neste estudo foram a Enamel Plus HRi e Filtek Z250. Cada resina utilizada foi dividida em 3 grupos de polimento, polimento com sistema Enhance® (Dentsply®), Enamel Plus® Shiny e discos Sof-Lex TM XT (3MTM ESPETM). Foram preparadas 42 amostras no total que foram divididas pelos sistemas de polimento (n=7). As resinas foram colocadas em moldes metálicos cilíndricos (10mm x 2 mm) confinados entre 2 matrizes de acetato transparentes e por cima destas foi colocado um vidro para retirar os excessos. Foram fotopolimerizados segundo as instruções do fabricante. Depois das amostras serem polidas, foram lavadas com água destilada durante 10 segundos e secas durante 5 segundos para retirar os detritos. As amostras foram analisadas com o microscópio de força atómica. Resultados: Para a resina Enamel Plus HRi não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas nos valores de Ra entre os diferentes sistemas de polimento (p>0,05). Na resina Filtek Z250, o sistema Enhnance apresentou resultados de Ra mais elevados (p<0,05), que os outros sistemas. O sistema Shiny e Sof-Lex XT (p<0,05) demonstraram, em termos estatísticos, serem semelhantes. Conclusão: Para a resina Enamel plus HRi, não existem diferenças significativas no comportamento clínico dos sistemas de polimento. No caso da resina Filtek Z250 os sistemas Sof-Lex e Shiny apresentaram maior eficácia que o sistema Enhnance