Estudo da atividade antimelanoma de compostos 1,3,4- tiadiazóis mesoiônicos

RESUMO As características estruturais dos compostos mesoiônicos, os quais possuem regiões de carga positiva e negativa distintas associadas a um sistema poliheteroatômico, possibilitam que estes compostos atravessem membranas e interajam com biomoléculas. Diversas aplicações biológicas já foram descritas para os compostos mesoiônicos. Uma série de cloretos de 4-fenil-5-[2'-Y, 4'-X ou 4'-X-cinamoil]-1,3,4- tiadiazólio-2-fenilamina foi avaliada em células de melanoma murino B16-F10 in vitro e em tumores resultantes da implantação subcutánea das células B16-F10 em camundongos C57BL/6. Os compostos diferem apenas no substituinte do anel cinamoil (Ml-J, X = OH; MI-2,4diF, X = Y = F; MMF, X = F e Ml-D, X = N02). A exposição das células B16-F10 aos compostos Ml-D, MI-2,4diF and MI-4F, todos na mesma concentração micromolar (50 nmol.L"1) diminuiu a viabilidade celular para 8%, 50% e 22%, respectivamente, enquanto o Ml-J não apresentou nenhum efeito significante nas mesmas condições. Contudo, baixas doses de Ml-D, como 10nmol.L"1, foram suficientes para impedir o crescimento celular por 72 h, mas para o MI-2,4diF e o MI-4F o efeito na proliferação das células B16-F10 foi observado apenas na concentração de 25 nmol.L"1. Apesar de o MI-4F ter apresentado um efeito ligeiramente melhor que o Ml- 2,4diF in vitro, seus efeitos no crescimento tumoral in vivo não foram significativos. O Ml-D inibiu o crescimento tumoral em 77%. A maior efetividade do Ml-D comparado aos compostos Mi-2,4diF, MI-4F and Ml-J contra as células de melanoma B16-F10 é provavelmente devido ao seu grupo atrator de elétrons (N02), que intensifica a carga positiva do anel mesoiônico e permite uma extensiva conjugação da cadeia lateral com a porção exocíclica. Isto parece ser importante para a atividade antitumoral destes compostos contra o melanoma. O Ml-D foi comparado com os antineopiásicos fotemustina e dacarbazina, cujos efeitos em melanoma são reconhecidos. O Ml-D mostrou-se mais citotóxico para as células B16-F10 que a fotemustina nas mesmas condições experimentais in vitro. A atividade antitumoral in vivo das drogas foi avaliada em camundongos C57BL/6 portadores de melanoma subcutáneo (B16-F10). Os animais foram tratados por via intraperitoneal (i.p.) com Ml-D, fotemustina ou dacarbazina utilizando uma única dose de 57 |¿mol.kg"1, 24 h após a inoculação das células. No 17° dia, os tumores foram extraídos e seus pesos determinados. O Ml-D inibiu o crescimento tumoral em 85%. O crescimento das células B16-F10 in vivo respondeu à fotemustina, e uma inibição do crescimento tumoral de -50% foi observada. Para a dacarbazina, 57 ^mol.kg"1 causou uma reproduzível tendência à inibição tumoral de 27%. O Ml-D também foi eficiente em inibir em 64% o crescimento de um tumor já desenvolvido de 8 dias. Os efeitos do composto Ml-D foram avaliados em diferentes linhagens de melanoma humano. O Ml-D diminui in vitro a viabilidade e a proliferação das células MEL-85, SK-MEL, A2058 e MEWO, mostrando uma elevada atividade citotóxica. A adesão das células MEL-85 a diferentes componentes da matriz extracelular foi avaliada em presença do Ml-D. O composto reduziu a adesão à laminina, fibronectina e matrigel. A morfología e a organização dos filamentos de actina do citoesqueleto foram alteradas pelo tratamento com Ml-D. Estes resultados nas células de melanoma humano apontam o Ml-D como uma droga bastante promissora contra o melanoma, que é extremamente resistente à quimioterapia. Este é um estudo encorajador no que diz respeito à possibilidade do Ml-D se tornar uma nova ferramenta para o estudo e o tratamento do melanoma

A Novel Hyaluronidase from Brown Spider (Loxosceles intermedia) Venom (Dietrich's Hyaluronidase): From Cloning to Functional Characterization

Loxoscelism is the designation given to clinical symptoms evoked by Loxosceles spider's bites. Clinical manifestations include skin necrosis with gravitational spreading and systemic disturbs. the venom contains several enzymatic toxins. Herein, we describe the cloning, expression, refolding and biological evaluation of a novel brown spider protein characterized as a hyaluronidase. Employing a venom gland cDNA library, we cloned a hyaluronidase (1200 bp cDNA) that encodes for a signal peptide and a mature protein. Amino acid alignment revealed a structural relationship with members of hyaluronidase family, such as scorpion and snake species. Recombinant hyaluronidase was expressed as N-terminal His-tag fusion protein (similar to 45 kDa) in inclusion bodies and activity was achieved using refolding. Immunoblot analysis showed that antibodies that recognize the recombinant protein cross-reacted with hyaluronidase from whole venom as well as an anti-venom serum reacted with recombinant protein. Recombinant hyaluronidase was able to degrade purified hyaluronic acid (HA) and chondroitin sulfate (CS), while dermatan sulfate (DS) and heparan sulfate (HS) were not affected. Zymograph experiments resulted in similar to 45 kDa lytic zones in hyaluronic acid (HA) and chondroitin sulfate (CS) substrates. Through in vivo experiments of dermonecrosis using rabbit skin, the recombinant hyaluronidase was shown to increase the dermonecrotic effect produced by recombinant dermonecrotic toxin from L. intermedia venom (LiRecDT1). These data support the hypothesis that hyaluronidase is a spreading factor. Recombinant hyaluronidase provides a useful tool for biotechnological ends. We propose the name Dietrich's Hyaluronidase for this enzyme, in honor of Professor Carl Peter von Dietrich, who dedicated his life to studying proteoglycans and glycosaminoglycans.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Fundacao Araucaria-PR (FAP)Secretaria de Estado de Ciencia, Tecnologia e Ensino Superior do Parana (SETI)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Univ Fed Parana, Dept Cell Biol, BR-80060000 Curitiba, Parana, BrazilUniv Fed Parana, Clin Hosp, Dept Clin Pathol, BR-80060000 Curitiba, Parana, BrazilUniv Estadual Ponta Grossa, Dept Struct Mol Biol & Genet, Ponta Grossa, BrazilCatholic Univ Parana, Hlth & Biol Sci Inst, Curitiba, Parana, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Biochem, São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Biochem, São Paulo, BrazilWeb of Scienc

Phospholipase-D activity and inflammatory response induced by brown spider dermonecrotic toxin: Endothelial cell membrane phospholipids as targets for toxicity

Brown spider dermonecrotic toxins (phospholipases-D) are the most well-characterized biochemical constituents of Loxosceles spp. venom. Recombinant forms are capable of reproducing most cutaneous and systemic manifestations such as dermonecrotic lesions, hematological disorders, and renal failure. There is currently no direct confirmation for a relationship between dermonecrosis and inflammation induced by dermonecrotic toxins and their enzymatic activity. We modified a toxin isoform by site-directed mutagenesis to determine if phospholipase-D activity is directly related to these biological effects. the mutated toxin contains an alanine substitution for a histidine residue at position 12 (in the conserved catalytic domain of Loxosceles intermedia Recombinant Dermonecrotic Toxin - LiRecDT1). LiRecDT1H12A sphingomyelinase activity was drastically reduced, despite the fact that circular dichroism analysis demonstrated similar spectra for both toxin isoforms, confirming that the mutation did not change general secondary structures of the molecule or its stability. Antisera against whole venom and LiRecDT1 showed cross-reactivity to both recombinant toxins by ELISA and immunoblotting. Dermonecrosis was abolished by the mutation, and rabbit skin revealed a decreased inflammatory response to LiRecDT1H12A compared to LiRecDT1. Residual phospholipase activity was observed with increasing concentrations of LiRecDT1H12A by dermonecrosis and fluorometric measurement in vitro. Lipid arrays showed that the mutated toxin has an affinity for the same lipids LiRecDT1, and both toxins were detected on RAEC cell surfaces. Data from in vitro choline release and HPTLC analyses of LiRecDT1-treated purified phospholipids and RAEC membrane detergent-extracts corroborate with the morphological changes. These data suggest a phospholipase-D dependent mechanism of toxicity, which has no substrate specificity and thus utilizes a broad range of bioactive lipids. (C) 2010 Elsevier B.V. All rights reserved.Secretaria de Estado de CienciaTecnologia e Ensino Superior (SETI) do ParanaFundacao Araucaria-PRFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Univ Fed Parana, Dept Cell Biol, BR-81531990 Curitiba, Parana, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Biochem, São Paulo, BrazilUniv Estadual Ponta Grossa, Dept Struct Mol Biol & Genet, Ponta Grossa, BrazilCatholic Univ Parana, Hlth & Biol Sci Inst, Curitiba, Parana, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Biochem, São Paulo, BrazilWeb of Scienc

Brown Spider (Loxosceles genus) Venom Toxins: Tools for Biological Purposes

Venomous animals use their venoms as tools for defense or predation. These venoms are complex mixtures, mainly enriched of proteic toxins or peptides with several, and different, biological activities. In general, spider venom is rich in biologically active molecules that are useful in experimental protocols for pharmacology, biochemistry, cell biology and immunology, as well as putative tools for biotechnology and industries. Spider venoms have recently garnered much attention from several research groups worldwide. Brown spider (Loxosceles genus) venom is enriched in low molecular mass proteins (5–40 kDa). Although their venom is produced in minute volumes (a few microliters), and contain only tens of micrograms of protein, the use of techniques based on molecular biology and proteomic analysis has afforded rational projects in the area and permitted the discovery and identification of a great number of novel toxins. The brown spider phospholipase-D family is undoubtedly the most investigated and characterized, although other important toxins, such as low molecular mass insecticidal peptides, metalloproteases and hyaluronidases have also been identified and featured in literature. The molecular pathways of the action of these toxins have been reported and brought new insights in the field of biotechnology. Herein, we shall see how recent reports describing discoveries in the area of brown spider venom have expanded biotechnological uses of molecules identified in these venoms, with special emphasis on the construction of a cDNA library for venom glands, transcriptome analysis, proteomic projects, recombinant expression of different proteic toxins, and finally structural descriptions based on crystallography of toxins

Estudo da atividade antimelanoma de compostos 1,3,4- tiadiazóis mesoiônicos

RESUMO As características estruturais dos compostos mesoiônicos, os quais possuem regiões de carga positiva e negativa distintas associadas a um sistema poliheteroatômico, possibilitam que estes compostos atravessem membranas e interajam com biomoléculas. Diversas aplicações biológicas já foram descritas para os compostos mesoiônicos. Uma série de cloretos de 4-fenil-5-[2'-Y, 4'-X ou 4'-X-cinamoil]-1,3,4- tiadiazólio-2-fenilamina foi avaliada em células de melanoma murino B16-F10 in vitro e em tumores resultantes da implantação subcutánea das células B16-F10 em camundongos C57BL/6. Os compostos diferem apenas no substituinte do anel cinamoil (Ml-J, X = OH; MI-2,4diF, X = Y = F; MMF, X = F e Ml-D, X = N02). A exposição das células B16-F10 aos compostos Ml-D, MI-2,4diF and MI-4F, todos na mesma concentração micromolar (50 nmol.L"1) diminuiu a viabilidade celular para 8%, 50% e 22%, respectivamente, enquanto o Ml-J não apresentou nenhum efeito significante nas mesmas condições. Contudo, baixas doses de Ml-D, como 10nmol.L"1, foram suficientes para impedir o crescimento celular por 72 h, mas para o MI-2,4diF e o MI-4F o efeito na proliferação das células B16-F10 foi observado apenas na concentração de 25 nmol.L"1. Apesar de o MI-4F ter apresentado um efeito ligeiramente melhor que o Ml- 2,4diF in vitro, seus efeitos no crescimento tumoral in vivo não foram significativos. O Ml-D inibiu o crescimento tumoral em 77%. A maior efetividade do Ml-D comparado aos compostos Mi-2,4diF, MI-4F and Ml-J contra as células de melanoma B16-F10 é provavelmente devido ao seu grupo atrator de elétrons (N02), que intensifica a carga positiva do anel mesoiônico e permite uma extensiva conjugação da cadeia lateral com a porção exocíclica. Isto parece ser importante para a atividade antitumoral destes compostos contra o melanoma. O Ml-D foi comparado com os antineopiásicos fotemustina e dacarbazina, cujos efeitos em melanoma são reconhecidos. O Ml-D mostrou-se mais citotóxico para as células B16-F10 que a fotemustina nas mesmas condições experimentais in vitro. A atividade antitumoral in vivo das drogas foi avaliada em camundongos C57BL/6 portadores de melanoma subcutáneo (B16-F10). Os animais foram tratados por via intraperitoneal (i.p.) com Ml-D, fotemustina ou dacarbazina utilizando uma única dose de 57 |¿mol.kg"1, 24 h após a inoculação das células. No 17° dia, os tumores foram extraídos e seus pesos determinados. O Ml-D inibiu o crescimento tumoral em 85%. O crescimento das células B16-F10 in vivo respondeu à fotemustina, e uma inibição do crescimento tumoral de -50% foi observada. Para a dacarbazina, 57 ^mol.kg"1 causou uma reproduzível tendência à inibição tumoral de 27%. O Ml-D também foi eficiente em inibir em 64% o crescimento de um tumor já desenvolvido de 8 dias. Os efeitos do composto Ml-D foram avaliados em diferentes linhagens de melanoma humano. O Ml-D diminui in vitro a viabilidade e a proliferação das células MEL-85, SK-MEL, A2058 e MEWO, mostrando uma elevada atividade citotóxica. A adesão das células MEL-85 a diferentes componentes da matriz extracelular foi avaliada em presença do Ml-D. O composto reduziu a adesão à laminina, fibronectina e matrigel. A morfología e a organização dos filamentos de actina do citoesqueleto foram alteradas pelo tratamento com Ml-D. Estes resultados nas células de melanoma humano apontam o Ml-D como uma droga bastante promissora contra o melanoma, que é extremamente resistente à quimioterapia. Este é um estudo encorajador no que diz respeito à possibilidade do Ml-D se tornar uma nova ferramenta para o estudo e o tratamento do melanoma