Formulierung von therapeutischen Oligonukleotiden mit PAMAM-Dendrimeren zur Aktivierung von <em>Pattern Recognition</em> Rezeptoren des angeborenen Immunsystems

Der ubiquitär exprimierte Immunrezeptor Retinoic Acid inducible Gene-I, kurz RIG-I, ist eine zytosolisch lokalisierte Helikase, die zur Detektion von pathogenen RNA-Viren befähigt ist. Als synthetischer Ligand konnte eine 5‘-triphosphorylierte, doppelsträngige RNA (3pRNA) identifiziert werden, die wie auch die RNA der Viren an den Rezeptor bindet und nach dessen Aktivierung einer Reihe verschiedener Signalwege anstößt. So kommt es zur hauptsächlich zur Induktion und Sekretion von Typ-I Interferonen (IFNα/β) und dem davon abhängigen C-X-C Motiv Chemokin 10 (CXCL-10). Durch diese ausgeschütteten molekularen Signale wird eine anti-virale Immunantwort eingeleitet, die durch die Aktivierung und Rekrutierung weiterer Immunzellen neben der innaten auch die adaptive Immunantwort auslöst. Daneben führt die Aktivierung von RIG-I in Tumorzellen auch zur Einleitung eines proapoptotischen Signalwegs, der bedingt, dass die Zelle in den programmierten Zelltod geführt wird. Um diese immunologisch wertvollen Eigenschaften auch im Rahmen einer therapeutischen Anwendung nutzen zu können, muss die synthetisch hergestellte RNA jedoch gut verpackt werden. Denn einerseits bedingen äußere Einflüsse (RNasen) den Abbau der RNA-Moleküle, andererseits besitzt die RNA alleine aufgrund ihrer hohen negativen Ladung nicht die Möglichkeit in die Zelle und schon gar nicht bis ins Zytosol zu gelangen, wo der Rezeptor lokalisiert ist. Diese Verpackung ermöglichen virale aber auch nicht-virale Vektorsysteme, die die RNA schützen und auf verschiedensten Wegen die Aufnahme in die Zelle vermitteln. Ein vielversprechendes nicht-virales Vektorsystem stellen PAMAM-Dendrimere dar. Diese hochdefinierten, sphärische polymere Strukturen besitzen eine Größe von 1 bis 10 Nanometern und sind in der Lage aufgrund einzigartigen Struktur RNA an sich zu binden, aber auch in sich aufzunehmen. Aufgrund ihrer guten Biokompatibilität, ihrer geringen Toxizität und auch aufgrund ihrer modifizierbaren Oberfläche, werden sie besonders oft für den Einschuss toxischer Arzneimittel verwendet, um dessen Effektivität und Spezifität von erhöhen und die Nebenwirkungen der Therapie zu reduzieren. In dieser Arbeit wurden PAMAM-Dendrimere als Vektorsysteme für 3pRNA zur Aktivierung von RIG-I, aber auch für Liganden der endosomal lokalisierte Nukleinsäure-bindenden Rezeptoren Toll-like Rezeptor 7 und 8 (TLR7 / 8) evaluiert. Es stellte sich heraus, dass die so hergestellten Dendriplexe neben einer hohen Transfektionseffizienz in vitro auch in vivo ein hohes Transferpotential besitzen. Diese in vivo Anwendbarkeit machte einen therapeutischen Einsatz der 3p-Dendriplexe im murinen hepatozellulären Karzinom, sowie im murinen Melanommodell möglich und führte sowohl intravenös als auch intratumoral verabreicht zu einer starken Tumorregression und zu einem verlängerten Überleben der Tiere. Zudem zeigte sich in Reprovokationsstudien an tumorfreien Tieren, dass die Behandlung einen immunologischen Schutz bewirkt, der das Anwachsen neuer Tumore verhindert. Durch die Herleitung einer maschinellen Herstellungsmethode war es am Ende möglich durch einen hochdefinierten und kontrollierbaren Prozess stabile 3p-Dendriplexe zu produzieren. Diese Methode bietet eine solide erste Grundlage die Herstellung von 3p-Dendriplexen als direkt applikationsfähige Arzneiform auch im Großmaßstab unter GMP zu ermöglichen

Deadzone-Quadratic Penalty Function for Predictive Extended Cruise Control with Experimental Validation

Battery Electric Vehicles have high potentials for the modern transportations, however, they are facing limited cruising range. To address this limitation, we present a semi-autonomous ecological driver assistance system to regulate the velocity with energy-efficient techniques. The main contribution of this paper is the design of a real-time nonlinear receding horizon optimal controller to plan the online cost-effective cruising velocity. Instead of conventional L2-norms, a deadzone-quadratic penalty function for the nonlinear model predictive controller is proposed. Obtained field experimental results demonstrate the effectiveness of the proposed method for a semi-autonomous electric vehicle in terms of real-time energy-efficient velocity regulation and constraints satisfaction

Luspatercept stimulates erythropoiesis, increases iron utilization, and redistributes body iron in transfusion-dependent thalassemia

Luspatercept, a ligand-trapping fusion protein, binds select TGF-β superfamily ligands implicated in thalassemic erythropoiesis, promoting late-stage erythroid maturation. Luspatercept reduced transfusion burden in the BELIEVE trial (NCT02604433) of 336 adults with transfusion-dependent thalassemia (TDT). Analysis of biomarkers in BELIEVE offers novel physiological and clinical insights into benefits offered by luspatercept. Transfusion iron loading rates decreased 20% by 1.4 g (~7 blood units; median iron loading rate difference: −0.05 ± 0.07 mg Fe/kg/day, p< .0001) and serum ferritin (s-ferritin) decreased 19.2% by 269.3 ± 963.7 μg/L (p < .0001), indicating reduced macrophage iron. However, liver iron content (LIC) did not decrease but showed statistically nonsignificant increases from 5.3 to 6.7 mg/g dw. Erythropoietin, growth differentiation factor 15, soluble transferrin receptor 1 (sTfR1), and reticulocytes rose by 93%, 59%, 66%, and 112%, respectively; accordingly, erythroferrone increased by 51% and hepcidin decreased by 53% (all p < .0001). Decreased transfusion with luspatercept in patients with TDT was associated with increased erythropoietic markers and decreasing hepcidin. Furthermore, s-ferritin reduction associated with increased erythroid iron incorporation (marked by sTfR1) allowed increased erythrocyte marrow output, consequently reducing transfusion needs and enhancing rerouting of hemolysis (heme) iron and non-transferrin-bound iron to the liver. LIC increased in patients with intact spleens, consistent with iron redistribution given the hepcidin reduction. Thus, erythropoietic and hepcidin changes with luspatercept in TDT lower transfusion dependency and may redistribute iron from macrophages to hepatocytes, necessitating the use of concomitant chelator cover for effective iron management

BAG1: The Guardian of Anti-Apoptotic Proteins in Acute Myeloid Leukemia

BCL2 associated Athano-Gene 1 (BAG1) is a multifunctional protein that has been described to be involved in different cell processes linked to cell survival. It has been reported as deregulated in diverse cancer types. Here, BAG1 protein was found highly expressed in children with acute myeloid leukemia at diagnosis, and in a cohort of leukemic cell lines. A silencing approach was used for determining BAG1's role in AML, finding that its down-regulation decreased expression of BCL2, BCL-XL, MCL1, and phospho-ERK1/2, all proteins able to sustain leukemia, without affecting the pro-apoptotic protein BAX. BAG1 down-regulation was also found to increase expression of BAG3, whose similar activity was able to compensate the loss of function of BAG1. BAG1/BAG3 co-silencing caused an enhanced cell predisposition to death in cell lines and also in primary AML cultures, affecting the same proteins. Cell death was CASPASE-3 dependent, was accompanied by PARP cleavage and documented by an increased release of pro-apoptotic molecules Smac/DIABLO and Cytochrome c. BAG1 was found to directly maintain BCL2 and to protect MCL1 from proteasomal degradation by controlling USP9X expression, which appeared to be its novel target. Finally, BAG1 was found able to affect leukemia cell fate by influencing the expression of anti-apoptotic proteins crucial for AML maintenance

Spatial Segregation of BMP/Smad Signaling Affects Osteoblast Differentiation in C2C12 Cells

BACKGROUND: Bone morphogenetic proteins (BMPs) are involved in a plethora of cellular processes in embryonic development and adult tissue homeostasis. Signaling specificity is achieved by dynamic processes involving BMP receptor oligomerization and endocytosis. This allows for spatiotemporal control of Smad dependent and non-Smad pathways. In this study, we investigate the spatiotemporal regulation within the BMP-induced Smad transcriptional pathway. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Here we discriminate between Smad signaling events that are dynamin-dependent (i.e., require an intact endocytic pathway) and dynamin-independent. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis in fluorescence microscopy and fractionation studies revealed a delay in Smad1/5/8 phosphorylation and nuclear translocation after BMP-2 stimulation of C2C12 cells. Using whole genome microarray and qPCR analysis, we identified two classes of BMP-2 induced genes that are differentially affected by inhibition of endocytosis. Thus, BMP-2 induced gene expression of Id1, Id3, Dlx2 and Hey1 is endocytosis-dependent, whereas BMP-2 induced expression of Id2, Dlx3, Zbtb2 and Krt16 is endocytosis-independent. Furthermore, we demonstrate that short term inhibition of endocytosis interferes with osteoblast differentiation as measured by alkaline phosphatase (ALP) production and qPCR analysis of osteoblast marker gene expression. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: Our study demonstrates that dynamin-dependent endocytosis is crucial for the concise spatial activation of the BMP-2 induced signaling cascade. Inhibition of endocytic processes during BMP-2 stimulation leads to altered Smad1/5/8 signaling kinetics and results in differential target gene expression. We show that interfering with the BMP-2 induced transcriptional network by endocytosis inhibition results in an attenuation of osteoblast differentiation. This implies that selective sensitivity of gene expression to endocytosis provides an additional mechanism for the cell to respond to BMP in a context specific manner. Moreover, we suggest a novel Smad dependent signal cascade induced by BMP-2, which does not require endocytosis

Role of the ubiquitin proteasome system in hematologic malignancies

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