Διερεύνηση Μηχανισμών Χρωμοσωμικής Αστάθειας και Τελομερικής Ομοιόστασης κατά την Επαγωγή Καρκινικών Βλαστικών Κυττάρων Ιn vitro και Ιn vivo

Ως χρωμοσωμική αστάθεια στη νεοπλασία (CIN-Chromosomal Instability in Neoplasia) ορίζεται ο αυξημένος ρυθμός συνεχών απωλειών ή διπλασιασμών ολόκληρων χρωμοσωμάτων ή μεγάλων τμημάτων τους κατά την κακοήθη κυτταρική ανάπτυξη. Η χρωμοσωμική αστάθεια είναι πολύ συχνή στη νεοπλασία (παρατηρείται περίπου στο 90% των συμπαγών όγκων και σε πολλές αιματολογικές κακοήθειες). Η CIN είναι συνεχής διαδικασία, διότι κατά την εξέλιξη της νόσου, ενισχύεται διαρκώς από την έκθεση των πολλαπλασιαζόμενων νεοπλασματικών κυττάρων σε τελομερική δυσλειτουργία, στρες αντιγραφής, ανεπάρκεια των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου κύκλου και διαταραχές της μιτωτικής ατράκτου. Η τελομερική δυσλειτουργία και πως αυτή επηρεάζει τη χρωμοσωμική αστάθεια, είναι το κύριο θέμα έρευνας της παρούσας διατριβής. Τα τελομερή είναι εξειδικευμένες δομές που παίζουν σημαντικό ρόλο στη σταθερότητα του χρωμοσώματος. Η διασφάλιση της λειτουργικής και δομικής ακεραιότητάς τους έχει ζωτική σημασία για τη φυσιολογική και παθολογική κυτταρική λειτουργία. Η ικανότητα συνεχούς κυτταρικού πολλαπλασιασμού στον καρκίνο είναι άμεσα εξαρτώμενη από την ενεργοποίηση των μηχανισμών αναπλήρωσης των τελομερών. Στις νεοπλασίες των θηλαστικών, το μήκος των τελομερών ανανεώνεται κυρίως από το ένζυμο τελομεράση (TERT) ή σπανιότερα μέσω της εναλλακτικής επιμήκυνσης των τελομερών (alternative lengthening of telomeres-ALT). Στην ανθρώπινη νεοπλασία, ο συνεχής κυτταρικός πολλαπλασιασμός απουσία τελομεράσης (ALT) χαρακτηρίζεται από υψηλούς ρυθμούς δομικής αστάθειας των χρωμοσωμάτων. Αυτό οφείλεται στο ότι τα χρωμοσώματα των ALT καρκινικών κυττάρων δε διαθέτουν επαρκή τελομερική προστασία και είναι συχνά επιδεκτικά σε τυχαίες τελομερικές συντήξεις. Οι συντήξεις των τελομερών οδηγούν σε φαινόμενα γενικευμένης γενωμικής αστάθειας και οδηγούν σε ανασυνδυασμούς μεταξύ χρωμοσωμάτων οι οποίες ενεργοποιούν ή καταστέλλουν αντίστοιχα, ογκογόνα ή ογκοκατασταλτικά γονίδια. Τα νεοπλασματικά κύτταρα που χρησιμοποιούν τον ALT μηχανισμό επιμήκυνσης των τελομερών παρουσιάζουν 5 φορές αυξημένη συχνότητα χρωμοσωμικής αστάθειας σε σχέση με αυτά που χρησιμοποιούν την τελομεράση. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση μηχανισμών δημιουργίας ανευπλοειδίας και πολυπλοειδίας κατά την εξέλιξη ALT καρκινικών κυττάρων σε συνθήκες γενοτοξικού στρες και στρες της αντιγραφής, σε μια προσπάθεια συμβολής στην κατανόηση της χρωμοσωμικής αστάθειας προς την ανάπτυξη νέων, αποτελεσματικότερων προγνωστικών διαγνωστικών ή ογκοθεραπευτικών μεθόδων.Human malignancies overcome replicative senescence either by activating the reverse-transcriptase telomerase or by utilizing a homologous recombination-based mechanism, referred to as alternative lengthening of telomeres (ALT). In budding yeast, ALT exhibits features of break-induced replication (BIR), a repair pathway for one-ended DNA double-strand breaks (DSBs) that requires the non-essential subunit Pol32 of DNA polymerase delta and leads to conservative DNA replication. Here, we examined whether ALT in human cancers also exhibits features of BIR. A telomeric fluorescence in situ hybridization protocol involving three consecutive staining steps revealed the presence of conservatively replicated telomeric DNA in telomerase-negative cancer cells. Furthermore, depletion of PolD3 or PolD4, two subunits of human DNA polymerase delta that are essential for BIR, reduced the frequency of conservatively replicated telomeric DNA ends and led to shorter telomeres and chromosome end-to-end fusions. Taken together, these results suggest that BIR is associated with conservative DNA replication in human cells and mediates ALT in cancer

Chronic p53-independent p21 expression causes genomic instability by deregulating replication licensing

The cyclin-dependent kinase inhibitor p21WAF1/CIP1 (p21) is a cell-cycle checkpoint effector and inducer of senescence, regulated by p53. Yet, evidence suggests that p21 could also be oncogenic, through a mechanism that has so far remained obscure. We report that a subset of atypical cancerous cells strongly expressing p21 showed proliferation features. This occurred predominantly in p53-mutant human cancers, suggesting p53-independent upregulation of p21 selectively in more aggressive tumour cells. Multifaceted phenotypic and genomic analyses of p21-inducible, p53-null, cancerous and near-normal cellular models showed that after an initial senescence-like phase, a subpopulation of p21-expressing proliferating cells emerged, featuring increased genomic instability, aggressiveness and chemoresistance. Mechanistically, sustained p21 accumulation inhibited mainly the CRL4–CDT2 ubiquitin ligase, leading to deregulated origin licensing and replication stress. Collectively, our data reveal the tumour-promoting ability of p21 through deregulation of DNA replication licensing machinery—an unorthodox role to be considered in cancer treatment, since p21 responds to various stimuli including some chemotherapy drugs

In vitro and in vivo study of the genomic instability and telomeric homeostasis of induced cancer stem cells

Ως χρωμοσωμική αστάθεια στη νεοπλασία (CIN-Chromosomal Instability in Neoplasia) ορίζεται ο αυξημένος ρυθμός συνεχών απωλειών ή διπλασιασμών ολόκληρων χρωμοσωμάτων ή μεγάλων τμημάτων τους κατά την κακοήθη κυτταρική ανάπτυξη. Η χρωμοσωμική αστάθεια είναι πολύ συχνή στη νεοπλασία (παρατηρείται περίπου στο 90% των συμπαγών όγκων και σε πολλές αιματολογικές κακοήθειες). Η CIN είναι συνεχής διαδικασία, διότι κατά την εξέλιξη της νόσου, ενισχύεται διαρκώς από την έκθεση των πολλαπλασιαζόμενων νεοπλασματικών κυττάρων σε τελομερική δυσλειτουργία, στρες αντιγραφής, ανεπάρκεια των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου κύκλου και διαταραχές της μιτωτικής ατράκτου. Η τελομερική δυσλειτουργία και πως αυτή επηρεάζει τη χρωμοσωμική αστάθεια, είναι το κύριο θέμα έρευνας της παρούσας διατριβής. Τα τελομερή είναι εξειδικευμένες δομές που παίζουν σημαντικό ρόλο στη σταθερότητα του χρωμοσώματος. Η διασφάλιση της λειτουργικής και δομικής ακεραιότητάς τους έχει ζωτική σημασία για τη φυσιολογική και παθολογική κυτταρική λειτουργία. Η ικανότητα συνεχούς κυτταρικού πολλαπλασιασμού στον καρκίνο είναι άμεσα εξαρτώμενη από την ενεργοποίηση των μηχανισμών αναπλήρωσης των τελομερών. Στις νεοπλασίες των θηλαστικών, το μήκος των τελομερών ανανεώνεται κυρίως από το ένζυμο τελομεράση (TERT) ή σπανιότερα μέσω της εναλλακτικής επιμήκυνσης των τελομερών (alternative lengthening of telomeres-ALT). Στην ανθρώπινη νεοπλασία, ο συνεχής κυτταρικός πολλαπλασιασμός απουσία τελομεράσης (ALT) χαρακτηρίζεται από υψηλούς ρυθμούς δομικής αστάθειας των χρωμοσωμάτων. Αυτό οφείλεται στο ότι τα χρωμοσώματα των ALT καρκινικών κυττάρων δε διαθέτουν επαρκή τελομερική προστασία και είναι συχνά επιδεκτικά σε τυχαίες τελομερικές συντήξεις. Οι συντήξεις των τελομερών οδηγούν σε φαινόμενα γενικευμένης γενωμικής αστάθειας και οδηγούν σε ανασυνδυασμούς μεταξύ χρωμοσωμάτων οι οποίες ενεργοποιούν ή καταστέλλουν αντίστοιχα, ογκογόνα ή ογκοκατασταλτικά γονίδια. Τα νεοπλασματικά κύτταρα που χρησιμοποιούν τον ALT μηχανισμό επιμήκυνσης των τελομερών παρουσιάζουν 5 φορές αυξημένη συχνότητα χρωμοσωμικής αστάθειας σε σχέση με αυτά που χρησιμοποιούν την τελομεράση.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση μηχανισμών δημιουργίας ανευπλοειδίας και πολυπλοειδίας κατά την εξέλιξη ALT καρκινικών κυττάρων σε συνθήκες γενοτοξικού στρες και στρες της αντιγραφής, σε μια προσπάθεια συμβολής στην κατανόηση της χρωμοσωμικής αστάθειας προς την ανάπτυξη νέων, αποτελεσματικότερων προγνωστικών διαγνωστικών ή ογκοθεραπευτικών μεθόδων

Alternative lengthening of human telomeres is a conservative DNA replication process with features of break‐induced replication

Human malignancies overcome replicative senescence either by activating the reverse-transcriptase telomerase or by utilizing a homologous recombination-based mechanism, referred to as alter- native lengthening of telomeres (ALT). In budding yeast, ALT exhibits features of break-induced replication (BIR), a repair pathway for one-ended DNA double-strand breaks (DSBs) that requires the non-essential subunit Pol32 of DNA polymerase delta and leads to conservative DNA replication. Here, we examined whether ALT in human cancers also exhibits features of BIR. A telomeric fluorescence in situ hybridization protocol involving three consecutive staining steps revealed the presence of conservatively replicated telomeric DNA in telomerase-negative cancer cells. Furthermore, depletion of PolD3 or PolD4, two subunits of human DNA polymerase delta that are essential for BIR, reduced the frequency of conservatively replicated telomeric DNA ends and led to shorter telomeres and chromosome end-to-end fusions. Taken together, these results suggest that BIR is associated with conservative DNA replication in human cells and mediates ALT in cancer.</p

Karyotypic Flexibility of the Complex Cancer Genome and the Role of Polyploidization in Maintenance of Structural Integrity of Cancer Chromosomes

Ongoing chromosomal instability in neoplasia (CIN) generates intratumor genomic heterogeneity and limits the efficiency of oncotherapeutics. Neoplastic human cells utilizing the alternative lengthening of telomeres (ALT)-pathway, display extensive structural and numerical CIN. To unravel patterns of genome evolution driven by oncogene-replication stress, telomere dysfunction, or genotoxic therapeutic interventions, we examined by comparative genomic hybridization five karyotypically-diverse outcomes of the ALT osteosarcoma cell line U2-OS. These results demonstrate a high tendency of the complex cancer genome to perpetuate specific genomic imbalances despite the karyotypic evolution, indicating an ongoing process of genome dosage maintenance. Molecular karyotyping in four ALT human cell lines showed that mitotic cells with low levels of random structural CIN display frequent evidence of whole genome doubling (WGD), suggesting that WGD may protect clonal chromosome aberrations from hypermutation. We tested this longstanding hypothesis in ALT cells exposed to gamma irradiation or to inducible DNA replication stress under overexpression of p21. Single-cell cytogenomic analyses revealed that although polyploidization promotes genomic heterogeneity, it also protects the complex cancer genome and hence confers genotoxic therapy resistance by generating identical extra copies of driver chromosomal aberrations, which can be spared in the process of tumor evolution if they undergo unstable or unfit rearrangements

HN1 interacts with gamma-tubulin to regulate centrosomes in advanced prostate cancer cells

Prostate cancer is one of the most common cancer for men worldwide with advanced forms showing supernumerary or clustered centrosomes. Hematological and neurological expressed 1 (HN1) also known as Jupiter Microtubule Associated Homolog 1 (JPT1) belongs to a small poorly understood family of genes that are evolutionarily conserved across vertebrate species. The co-expression network of HN1 from the TCGA PRAD dataset indicates the putative role of HN1 in centrosome-related processes in the context of prostate cancer. HN1 expression is low in normal RWPE-1 cells as compared to cancerous androgen-responsive LNCaP and androgen insensitive PC-3 cells. HN1 overexpression resulted in differential response for cell proliferation and cell cycle changes in RWPE-1, LNCaP, and PC-3 cells. Since HN1 overexpression increased the proliferation rate in PC-3 cells, these cells were used for functional characterization of HN1 in advanced prostate carcinogenesis. Furthermore, alterations in HN expression led to an increase in abnormal to normal nuclei ratio and increased chromosomal aberrations in PC-3 cells. We observed the co-localization of HN1 with gamma-tubulin foci in prostate cancer cells, further validated by immunoprecipitation. HN1 was observed as physically associated with gamma-tubulin and its depletion led to increased gamma-tubulin foci and disruption in microtubule spindle assembly. Higher HN1 expression was correlated with prostate cancer as compared to normal tissues. The restoration of HN1 expression after silencing suggested that it has a role in centrosome clustering, implicating a potential role of HN1 in cell division as well as in prostate carcinogenesis warranting further studies

Chronic p53-independent p21 expression causes genomic instability by deregulating replication licensing

The cyclin-dependent kinase inhibitor p21(WAF1/CIP1) (p21) is a cell-cycle checkpoint effector and inducer of senescence, regulated by p53. Yet, evidence suggests that p21 could also be oncogenic, through a mechanism that has so far remained obscure. We report that a subset of atypical cancerous cells strongly expressing p21 showed proliferation features. This occurred predominantly in p53-mutant human cancers, suggesting p53-independent upregulation of p21 selectively in more aggressive tumour cells. Multifaceted phenotypic and genomic analyses of p21-inducible, p53-null, cancerous and near-normal cellular models showed that after an initial senescence-like phase, a subpopulation of p21-expressing proliferating cells emerged, featuring increased genomic instability, aggressiveness and chemoresistance. Mechanistically, sustained p21 accumulation inhibited mainly the CRL4-CDT2 ubiquitin ligase, leading to deregulated origin licensing and replication stress. Collectively, our data reveal the tumour-promoting ability of p21 through deregulation of DNA replication licensing machinery-an unorthodox role to be considered in cancer treatment, since p21 responds to various stimuli including some chemotherapy drugs