NLRP3 inflammasome as a target to reduce epileptiform activity in organotypic slices

Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2018A epilepsia é uma doença do foro neurológico caracterizada pela predisposição duradoura para gerar crises epilépticas. Cada crise é uma perturbação transitória da atividade neuronal que se torna síncrona e excessiva, interrompendo, momentaneamente, a função normal do cérebro. Calcula-se que, em Portugal, 1 em cada 200 pessoas tenha esta disfunção do sistema neurológico. Não existe cura para a epilepsia, no entanto, existem fármacos antiepilépticos (FAEs) que previnem a ocorrência de crises epilépticas. Os FAEs são prescritos de acordo com o tipo de epilepsia e com os fatores individuais de cada pessoa. Por vezes são necessárias várias tentativas e/ou politerapia para encontrar a medicamentação adequada para controlar as crises. Contudo nem todas as pessoas reagem aos FAEs. Estima-se que 30-40% das pessoas em todo o mundo sofrem de epilepsia refratária, ou seja, não têm a doença controlada. Uma vez que a epilepsia refratária pode ser incapacitante em algumas vertentes pessoais e profissionais e existe um elevado número de pessoas a sofrer desta doença, é necessário uma melhor compreensão da epilepsia e do processo de epileptogénese. Este processo é responsável por tornar um cérebro normal num cérebro com atividade neuronal anormal. Além disso, também é imprescindível testar novas terapias antiepileptogénicas que possibilitem uma melhor qualidade de vida a estes doentes. A maioria dos FAEs modula os mecanismos excitatórios e inibitórios relacionados direta ou indiretamente com a neurotransmissão. No entanto, tem havido um crescente interesse no estudo de moléculas/ fármacos anti-inflamatórios como terapias antiepileptogénicas. Além dos neurónios, as células gliais, ou seja, os astrócitos e a microglia, têm um papel importante no processo de epileptogénese. Estas células gliais estão envolvidas no processo de neuroinflamação produzindo diversas citocinas e outras moléculas que irão potenciar a inflamação. Atualmente sabe-se que existe um circuito positivo entre a epilepsia e a inflamação. A atividade epiléptica promove a libertação de fatores inflamatórios e a inflamação, por sua vez, potencia a atividade epiléptica. Uma das citocinas pro-inflamatórias mais estudada no âmbito da epilepsia é a interleucina-1β (IL-1β). Estudos recentes demonstraram que a expressão desta molécula está aumentada em modelos animais de epilepsia, bem como em pacientes com esta patologia. A IL-1β é produzida por um complexo multiproteico associado à imunidade inata denominado de inflamassoma NLRP3. Este complexo é ativado na presença de agentes patogénicos ou perigosos ao organismo, tais como os lipopolissacarídeos (LPS) e a adenosina trifosfato (ATP). Os LPS são moléculas que estão presentes na membrana exterior de bactérias gram-negativas, enquanto o ATP é uma molécula que transporta energia e é essencial às células. Ao ser ativado, o inflamassoma NLRP3 promove a clivagem da pro-IL-1β (forma inativa) em IL-1β, através da ativação da capase-1. Na forma ativa, a IL-1β sai da célula e promove a inflamação nas células vizinhas. Diversos estudos têm-se focado na modulação do mecanismo de ação desta interleucina, através de anticorpos anti-IL-1β ou através de antagonistas do seu recetor. Medicamentos que contêm substâncias como Anacinra (antagonista do recetor humano da interleucina-1) ou Canacinumab (anticorpo anti-IL-1β monoclonal totalmente humanizado) têm sido amplamente utilizados no tratamento de doenças relacionadas com o inflamassoma NLRP3, tal como a artrite reumatóide. No entanto, até 2016 ainda nenhum destes medicamentos tinha sido testado em doentes epilépticos. Casos clínicos reportados recentemente têm demonstrado a eficácia destes medicamentos em doentes com epilepsia refratária. Até então, apenas se tinham realizado estudos com substâncias similares em modelos animais. Adicionalmente, também foram desenvolvidos estudos para inibir a caspase-1, que tiveram sucesso na supressão de atividade epiléptica em modelos animais, mas não foram aprovados nos ensaios clínicos, ficando apenas na fase II. O presente estudo teve como principal objetivo modular a ativação do inflamassoma NLRP3 e avaliar o impacto na atividade epiléptica de fatias organotípicas. As fatias organotípicas são um ótimo modelo ex vivo, uma vez que preservam a arquitetura tridimensional, as conexões neuronais e as interações entre os neurónios e células gliais, por longos períodos. Além disso, também permitem testar potenciais fármacos de modo mais rápido, menos doloroso e menos dispendioso do que aconteceria em modelos animais. Inicialmente foi estabelecido o modelo de ativação do inflamassoma NLRP3 em fatias organotípicas de hipocampo e córtex preparadas a partir dos cérebros de ratos Sprague-Dawley com 6/7 dias de vida, por exposição a diferentes concentrações de LPS (5, 10 e 20ng/mL) durante 3 e 6h ou a LPS (10ng/mL) e ATP (1mM) simultaneamente. Após uma pré-incubação apenas com LPS durante 3h, o ATP foi co-incubado com o LPS durante mais 3h. De modo a escolher a melhor condição de ativação do inflamassoma, estudou-se a expressão proteica da αII-espectrina, para avaliar a morte celular, de componentes do inflamassoma (NLRP3 e ASC), e de marcadores das células gliais (Iba1 e GFAP). Adicionalmente foram quantificados, no tecido e no meio de cultura, os níveis de duas citocinas pro-inflamatórias: a IL-1β e os Fatores de Necrose Tumoral Alfa (TNF-α). Verificou-se que a exposição das fatias organotípicas ao LPS/ATP promoveu a diminuição de necrose, bem como a potenciação da libertação de citocinas para o meio extracelular. Uma vez que estes processos são característicos da ativação do inflamassoma, optou-se por utilizar esta condição. Posteriormente foi verificado o efeito da ativação do inflamassoma, pelo LPS/ATP, nas células gliais e na atividade epileptiforme. Através da técnica de imunohistoquímica foi possível observar a migração da microglia em direção ao meio de cultura. Na presença de LPS/ATP, a secção da fatia mais próxima do meio de cultura apresentava maior densidade celular, relativamente ao controlo, e maior ativação da microglia. Estas características correspondem a um processo de microgliose. Uma vez que existia elevada produção de IL-1β e microgliose nas fatias expostas a LPS/ATP antecipou-se um aumento na atividade epileptiforme nestas fatias. No entanto, tal não foi observado. As fatias expostas aos ativadores do inflamassoma apresentaram um número de bursts por fatia e características intrínsecas dos bursts semelhantes aos observados em fatias controlo. Os bursts são conjuntos de atividade neuronal excessiva que representam a fase ictal (correspondente à crise epiléptica). Após uma avaliação cuidada verificou-se que as fatias controlo, não sujeitas à adição de fármacos, exibiam uma elevada atividade epileptiforme. As fatias denominadas controlo neste estudo sofreram apenas uma mudança do meio de cultura, processo este que já havia sido descrito por diversos estudos. Durante os primeiros 14 dias in vitro, as fatias foram cultivadas num meio que continha soro de cavalo (meio Opti-MEM). Como este soro não é quimicamente definido, ou seja, varia de lote para lote, o meio de cultura foi alterado para um meio sem soro (meio Neurobasal A) no dia antes da adição dos fármacos. No entanto, verificou-se que as fatias controlo apresentavam claramente mais atividade epiléptica, que as fatias cultivadas sempre em meio Opti-MEM. Posteriormente foi avaliado o impacto da inibição do inflamassoma NLRP3 na produção da IL-1β e na microgliose, uma vez que tinham sido potenciadas na presença de LPS/ATP. De modo a inibir o inflamassoma, utilizou-se um inibidor seletivo deste complexo multiproteico denominado de MCC950 (10μM). Na presença dos ativadores do inflamassoma, o MCC950 não foi capaz de reverter a libertação da citocina pro-inflamatória nem a microgliose. Por estudos electrofisiológicos verificou-se que na presença dos ativadores do inflamassoma, o MCC950 não foi capaz de reverter a atividade neuronal excessiva. No entanto, quando o MCC950 foi incubado sozinho, observou-se uma clara diminuição da atividade ictal nas fatias organotípicas. Conclui-se que a atividade epileptiforme induzida nas fatias organotípicas pela mudança do meio de cultura era dependente do inflamassoma, dado que foi revertida por incubação com o seu inibidor. Em suma, os nossos resultados demonstram que o inflamassoma NLRP3 está relacionado com a indução e potenciação da atividade epileptiforme. Adicionalmente, também sugerem que o MCC950 é um potencial agente terapêutico para a epilepsia e que o inflamassoma NLRP3 deve continuar a ser meticulosamente estudado como potencial alvo terapêutico para a epilepsia.Extensive evidence has supported the involvement of neuroinflammation in epileptic seizures. Recently, analysis of serum blood samples of epileptic patients revealed an increased production of several pro-inflammatory cytokines, namely interleukin-1β (IL-1β).This protein is produced by NLRP3 inflammasome, a cytosolic multiprotein complex involved in innate immune response. The canonic activation of NLRP3 inflammasome involves a priming signal (as lipopolysaccharides – LPS), which upregulates the expression of NLRP3 and pro-IL1β; and an activating signal (as adenosine triphosphate – ATP), which promotes the assembly of the complex. The goals of this study were to enhance epileptiform activity of organotypic slices through LPS/ATP – activated NLRP3 inflammasome and to reduce this activity by selectively inhibiting the inflammasome. Organotypic cortex-hippocampus slices of Sprague-Dawley rats with 6/7 days were exposed to different LPS concentrations (5, 10, 20ng/mL) at 3 or 6h or LPS (10ng/mL) plus ATP (1mM) to choose the best condition to activate the NLRP3 inflammasome. In order to inhibit the inflammasome, a selective inhibitor, MCC950 (10μM), was added 1h before co-incubation with LPS and ATP. Negative controls with each compound alone were carried out in some assays. Regarding inflammasome activation, LPS and ATP together decreased necrosis (assessed by ratio SBDP120/α-IISpectrin) and potentiated the release of pro-inflammatory cytokines (interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor α). These events are characteristics of NLRP3 inflammasome activation. Expression of inflammasome components (NLRP3 e ASC) and glial cells markers (Iba1 e GFAP) were also evaluated, but did not show differences. In LPS/ATP presence, slices presented microgliosis in the layers near the culture medium. However, they depicted a similar epileptiform activity when compared with control slices, which were not exposed to drugs. In this study was possible to verify that control slices, that only underwent culture medium exchange, had an exacerbated synchronous neuronal activity, when compared with slices that did not undergo this process. In slices treated with MCC950 in the presence of LPS/ATP, neither IL-1β release nor microgliosis were reversed by MCC950. Moreover, NLRP3 inflammasome inhibitor did not affect epileptiform activity in the presence of LPS/ATP. Nevertheless, when MCC950 was incubated alone, the epileptiform activity was dramatically reduced. That is, MCC950 reversed the epileptiform activity induced by medium exchange, suggesting that this process involved the NLRP3 inflammasome. Our findings demonstrate the important role of NLRP3 inflammasome in the promotion of epileptiform activity and begin to unravel a potential target for antiepileptic therapy

Neural stem cells and cannabinoids in the spotlight as potential therapy for epilepsy

© 2020 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).Epilepsy is one of the most common brain diseases worldwide, having a huge burden in society. The main hallmark of epilepsy is the occurrence of spontaneous recurrent seizures, having a tremendous impact on the lives of the patients and of their relatives. Currently, the therapeutic strategies are mostly based on the use of antiepileptic drugs, and because several types of epilepsies are of unknown origin, a high percentage of patients are resistant to the available pharmacotherapy, continuing to experience seizures overtime. Therefore, the search for new drugs and therapeutic targets is highly important. One key aspect to be targeted is the aberrant adult hippocampal neurogenesis (AHN) derived from Neural Stem Cells (NSCs). Indeed, targeting seizure-induced AHN may reduce recurrent seizures and shed some light on the mechanisms of disease. The endocannabinoid system is a known modulator of AHN, and due to the known endogenous antiepileptic properties, it is an interesting candidate for the generation of new antiepileptic drugs. However, further studies and clinical trials are required to investigate the putative mechanisms by which cannabinoids can be used to treat epilepsy. In this manuscript, we will review how cannabinoid-induced modulation of NSCs may promote neural plasticity and whether these drugs can be used as putative antiepileptic treatment.This work was supported by IF/01227/2015 and UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. D.M.L. (PD/BD/141784/2018) and L.R.-R. (PD/BD/150344/2019) were in receipt of a fellowship from FCT. The authors are in hold of a H2020 Twinning Action from EU (EpiEpiNet).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Occurrence of Multidrug-Resistant Bacteria Resulting from the Selective Pressure of Antibiotics: A Comprehensive Analysis of ESBL K. pneumoniae and MRSP Isolated in a Dog with Rhinorrhea

(This article belongs to the Special Issue Antimicrobial Use in Companion Animals)Because of public health concerns, much greater scrutiny is now placed on antibiotic use in pets, especially for antimicrobial agents that have human analogs. Therefore, this study aimed to characterize the phenotypic and genotypic profiles of multidrug-resistant bacteria isolated from nasal swabs samples taken from a one-year-old male Serra da Estrela dog with rhinorrhea that was treated with amikacin. An extended-spectrum β-lactamases (ESBL) Klebsiella pneumoniae was isolated in the first sample taken from the left nasal cavity of the dog. Seven days later, methicillin-resistant (MRSP) Staphylococcus pseudintermedius was also isolated. Nevertheless, no alterations to the therapeutic protocol were performed. Once the inhibitory action of the antibiotic disappeared, the competitive advantage of the amikacin-resistant MRSP was lost, and only commensal flora was observed on both nasal cavities. The genotypic profile of extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Klebsiella pneumoniae revealed the same characteristics and close relation to other strains, mainly from Estonia, Slovakia and Romania. Regarding MRSP isolates, although resistance to aminoglycosides was present in the first MRSP, the second isolate carried aac(6')-aph(2″), which enhanced its resistance to amikacin. However, the veterinary action was focused on the treatment of the primary agent (ESBL K. pneumoniae), and the antibiotic applied was according to its phenotypic profile, which may have led to the resolution of the infectious process. Therefore, this study highlights the importance of targeted therapy, proper clinical practice and laboratory-hospital communication to safeguard animal, human and environmental health.Simple Summary: Antimicrobial resistance (AMR) poses a major threat to human and animal health. One of the causes underlying the emergence of increasingly resistant strains is antibiotic selective pressure. This study aimed to evaluate the impact of treatment with amikacin on an extended spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Klebsiella pneumoniae isolated in a dog with rhinorrhea. In the middle of the treatment, methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius (MRSP) was isolated from the left nasal cavity of the dog. At the end of the treatment, K. pneumoniae was not recovered from nasal swab samples, while MRSP displayed phenotypical and genotypical changes. Six weeks after the end of the treatment, only commensal flora was observed in both nasal cavities. These results warn of the effects of antibiotic pressure, which can lead to the emergence of multidrug-resistant strains either by directly promoting the enrichment of bacteria with resistance to multiple antimicrobial agents or via the subsequent acquisition of resistance genes. Therefore, adapting clinical practice to this new reality is crucial to limit the selection and spread of multi-resistant bacteria among pets, humans and the environment.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Cancro da mama hereditário: dupla heterozigotia para variantes patogénicas nos genes BRCA1 e ATM

Introdução/objetivos: O cancro da mama hereditário (CMH) representa 5-10% dos casos de cancro da mama, destes ~30% devem-se a variantes patogénicas germinativas nos genes BRCA1 e BRCA2. Vários outros genes de suscetibilidade para CMH têm sido identificados, com diferentes graus de penetrância. A determinação da causa genética subjacente ao CMH permite identificar os indivíduos com risco aumentado de desenvolver tumores, os quais podem beneficiar de medicina personalizada, e também oferecer o teste genético preditivo a familiares em 1º grau, após aconselhamento genético. A sequenciação de nova geração (NGS) veio revolucionar o diagnóstico molecular do CMH proporcionando alta eficiência e baixos custos, usando painéis multigénicos. Neste trabalho, utilizou-se a NGS para sequenciar um painel de genes de suscetibilidade para CMH numa doente com história pessoal de cancro da mama e ovário e história familiar de cancro do lado materno e paterno. Métodos: NGS com preparação das bibliotecas de sequências-alvo a partir de DNA genómico (protocolo Trusight Cancer - TruSight Rapid Capture, Illumina) e sequenciação no MiSeq (Illumina). Análise bioinformática efetuada com os programas MiSeq Reporter, Enrichment e Variant Studio (Illumina), Alamut Visual e Integrative Genomics Viewer. As variantes patogénicas identificadas por NGS nos genes BRCA1 e ATM foram confirmadas por sequenciação de Sanger. Resultados: Foi identificado um caso raro de dupla heterozigotia para as variantes patogénicas BRCA1: c.2037delinsCC, p.(Lys679Asn*4) e ATM: c.3802delG, p.(Val1268*). A pesquisa destas variantes num familiar com cancro da mama e em dois familiares em 1º grau saudáveis, após aconselhamento genético, permitiu diagnosticá-los como portadores de uma ou de ambas as variantes. Conclusões: A NGS de um painel de genes de suscetibilidade para CMH permitiu identificar um caso raro de dupla heterozigotia para variantes patogénicas nos genes BRCA1 e ATM. Esta abordagem analítica foi crucial pois possibilitou um aconselhamento genético orientado em função das variantes identificadas e do risco de desenvolvimento de tumores associados a uma ou a ambas as variantes. Este caso demonstra a vantagem da sequenciação de um painel multigénico face à análise molecular limitada aos genes BRCA1 e BRCA2.FCT - UID/BIM/0009/2016info:eu-repo/semantics/publishedVersio

The influence of 1-naphthaleneacetic acid on recovering ‘Rocha’ pear ripening after 1-MCP treatment

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Estratégia de Comunicação | DSDA | Presidência da República

O valor das bibliotecas e dos arquivos tem sido amplamente reconhecido por contribuírem para o desenvolvimento das instituições e das comunidades em que se inserem e que são, por sua vez, a razão da sua existência. E porque as bibliotecas e os arquivos possuem um mercado próprio, constituído por utilizadores reais e potenciais, tal como qualquer outra organização que vise ou não fins lucrativos, têm também necessidades crescentes de utilizar técnicas que os ajudem a conhecer e a relacionarem-se com esse mesmo mercado. Neste sentido, as estratégias de comunicação e difusão dos serviços e dos recursos informativos, potenciadas e facilitadas pelas novas tecnologias, são uma ferramenta importante para a realização da missão destas organizações. Assim sendo, o presente poster apresenta um projeto de Estratégia de Comunicação para a Direção de Serviços de Documentação e Arquivo da Secretaria Geral da Presidência da República, que se traduz na distribuição de folhetos informativos, na realização de exposições e eventos, na produção de uma newsletter e na criação de espaços institucionais próprios em redes sociais (Facebook e LinkedIn)

Silk‐Based antimicrobial polymers as a new platform to design drug‐free materials to impede microbial infections

Surgical site infections (SSI) represent a serious health problem that occur after invasive surgery, thus new antimicrobial biomaterials able to prevent SSI are needed. Silks are natural biopolymers with excellent biocompatibility, low immunogenicity and controllable biodegradability. Spider silkbased materials can be bioengineered and functionalized with specific peptides, such as antimicrobial peptides, creating innovative polymers. Herein, we explored new drugfree multifunctional silk films with antimicrobial properties, specifically tailored to hamper microbial infections. Different spider silk domains derived from the dragline sequence of the spider Nephila clavipes (6mer and 15mer, 27 and 41 kDa proteins, respectively) were fused with the two antimicrobial peptides, Hepcidin (Hep) and Human Neutrophil peptide 1 (HNP1). The selfassembly features of the spider silk domains (sheets) were maintained after functionalization. The bioengineered 6merHNP1 protein demonstrated inhibitory effects against microbial pathogens. Silkbased films with 6merHNP1 and different contents of silk fibroin (SF) significantly reduced bacterial adhesion and biofilm formation, whereas higher bacterial counts were found on the films prepared with 6mer or SF alone. The silkbased films showed no cytotoxic effects on human foreskin fibroblasts. The positive cellular response, together with structural and antimicrobial properties, highlight the potential of these multifunctional silkbased films as new materials for preventing SSI.The Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) under the project PTDC/BBB-BIO/0827/2012 and by the European Regional Development Fund (FEDER) through the "COMPETE" - Operational Programme for Competitiveness factors (FCOMP-01-0124-FEDER-028120) supported this work. The authors would like to thank Prof. Celia Manaia from the Escola Superior de Biotecnologia (Porto, Portugal) for providing the Pseudomonas sp. bacteria; and Dr. Alberta Faustino from the Hospital de S. Marcos (Braga, Portugal) for providing the other bacterial strains. A. R. Franco thanks FCT through the PostDoctoral scholarship SFRH/BPD/100760/2014.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Phytochemical study of Muehlenbeckia platyclada (F. Muell) leaves

Medicinal plants have active substances with therapeutic potential that have been used in the treatment of various diseases in humans since the most primitive populations. The use of those plants establishes a direct relationship with the theme of planetary health as it allows to relate the health of the planet's natural systems and the health of human civilization. The plant species Muehlenbeckia platyclada, belonging to the Polygonaceae family, is important in traditional medicine, presenting antinociceptive and analgesic activities proven in several studies. The general objective of the current study is to understand the chemical and phytochemical characteristics of M. platyclada. From the leaves, the humidity and total ash contents were quantified as well as phytochemical prospecting was carried out. An aqueous extract and four ethanolic extracts of different concentrations were prepared from the leaves of the plant drug. Total phenol and flavonoid levels were quantified and the presence of antioxidant activity was verified. As a result: The sum of total ash and humidity content produced a value of 96.39%. It was possible to observe that the reactions for tannins, flavonoids, coumarins, terpenoids/steroids, and saponins were positive while anthraquinones and alkaloids were negative. The average phenol contents ranged from 1.83 to 8.53mg/100g (of organic plant material), concerning the extracting solvents (p < 0.05). The extracting liquid that provided the highest yield of phenols and flavonoids was 50% ethanol, using the hot and cold extraction method. Regarding antioxidant activity, the effective concentration (EC50) for rutin (positive control) was 5.50mg/mL and ranged from 14.30±0.10 to 65.66±7.79 mg/mL, being identified the aqueous extract as the one with the greatest activity. Phytochemical prospecting and investigation into antioxidant activity allow the classification of the studied plant as a potential anti-inflammatory and antitumor agent

Exploring Past, Present and Future

UID/HIS/04209/2019 POCI-01-0145-FEDER-007460.publishersversionpublishe

Following Darwin’s footsteps: Evaluating the impact of an activity designed for elementary school students to link historically important evolution key concepts on their understanding of natural selection

While several researchers have suggested that evolution should be explored from the initial years of schooling, little information is available on effective resources to enhance elementary school students’ level of understanding of evolution by natural selection (LUENS). For the present study, we designed, implemented, and evaluated an educational activity planned for fourth graders (9 to 10 years old) to explore concepts and conceptual fields that were historically important for the discovery of natural selection. Observation field notes and students’ productions were used to analyze how the students explored the proposed activity. Additionally, an evaluation framework consisting of a test, the evaluation criteria, and the scoring process was applied in two fourth-grade classes (N = 44) to estimate elementary school students’ LUENS before and after engaging in the activity. Our results show that our activity allowed students to link the key concepts, resulting in a significant increase of their understanding of natural selection. They also reveal that additional activities and minor fine-tuning of the present activity are required to further support students’ learning about the concept of differential reproduction.info:eu-repo/semantics/publishedVersio