Sinvastatina induz o processo autofágico em células de melanoma humano metastático : potencial ação na resistência tumoral

Orientadora : Profª. Drª. Sheila Maria Brochado WinnischoferCo-orientador : Profª. Drª. Glaucia Regina MartinezDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 30/03/2016Inclui referências : f. 75-82Resumo: O melanoma é um tipo de câncer de pele que possui baixa incidência, porém é muito agressivo e com alto índice de mortalidade. Vale destacar que um dos grandes desafios da terapêutica atual é a ocorrência do processo de resistência. O mecanismo de resistência tumoral é complexo e, em geral, acontece porque as células tumorais sofrem mutações, amplificações ou superexpressões de genes regulatórios ou por modulação de mecanismos compensatórios (como senescência e autofagia) que produzem a resistência. A condição de resistência propicia aumento da tolerância das células tumorais aos efeitos citotóxicos do fármaco e/ou ativa sinais de sobrevivência nas mesmas. Esses fatos enfatizam a necessidade da busca por novas alternativas de tratamento que sejam mais eficientes e que superem os mecanismos de resistência tumoral. A sinvastatina é um fármaco da classe das estatinas utilizado para o tratamento de dislipidemias. Atualmente, sabe-se que possui ação antitumoral, capaz de induzir apoptose,parada do ciclo celular e modular o processo de autofagia em diversas linhagens de tumores. A relação entre autofagia e apoptose é controversa, pois, a autofagia ora é tratada como mecanismo capaz de suprimir o desenvolvimento do tumor, ora capaz de promover o tumor fornecendo substratos da degradação decomponentes celulares. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da sinvastatina na modulação da autofagia em células de melanoma metastático humano da linhagem WM9. Nossos resultados mostram que a sinvastatina é capaz de reduzir a viabilidade das células WM9 e WM1617 de forma dependente da concentração, atingindo 53,5 % e 90,3 % (pelo método de MTT) após tratamento das células com sinvastatina nas concentrações de 1 ?M e 5 ?M,respectivamente. A redução de viabilidade foi acompanhada por aumento no índice autofágico em torno de 2,5 unidades para o tratamento na concentração de5 ?M de sinvastatina e aumento da quantidade de células na fase G0-G1 do ciclo celular de forma dependente da concentração. O co-tratamento de sinvastatina com o inibidor de autofagia hidroxicloroquina promoveu inibição efetiva do processo autofágico, com concomitante aumento da sensibilidade das célulasWM9 aos efeitos citotóxicos da sinvastatina, promovendo redução mais expressiva da viabilidade celular (atingindo 97% com a combinação sinvastatina/hidroxicloroquina, 5?M/25?M), acompanhada de aumento da quantidade de células com DNA fragmentado (atingindo 18,4% com a combinação). Para melhor compreender o mecanismo de ação da sinvastatina,foram avaliados dois marcadores chaves do processo autofágico: LC3-I/II e p62.Pode-se observar níveis aumentados da expressão de LC3-I/II proporcional ao aumento da concentração de sinvastatina e concomitante redução dos níveis de proteína p62. Quando o processo autofágico foi inibido pelo uso da hidroxicloroquina observou-se que a expressão de LC3-I/II foi diminuída e os níveis de p62 não foram alterados. Ainda, foi observado que o número de células WM9com vacúolos fluorescentes (marcados com a proteína de fusão GFP-LC3)aumentam percentualmente com o aumento da concentração de sinvastatina utilizada nos tratamentos, fato que corrobora os resultados de expressão. Juntos,esses dados indicam que o tratamento das células WM9 com sinvastatina é capaz de induzir o processo autofágico de maneira concentração-dependente, sendo este um mecanismo de resistência tumoral em modelo de melanoma humano.Vale destacar que, independente do aumento no fluxo autofágico, a sinvastatina foi citotóxica, tornando interessante a possibilidade de ser utilizada como um agente terapêutico alternativo e/ou adjuvante ao uso de quimioterápicos.Palavras-chave: Melanoma, sinvastatina, autofagia.Abstract: Melanoma is a type of skin cancer that has low incidence, but is very aggressive and with high mortality rate. One of the big challenges of the modern therapy is the occurrence of the resistance process. The tumor resistance mechanism is complex and usually happens because the tumor cells undergo mutations, amplifications or super expressions by regulatory genes or by modulation of compensatory mechanisms that produces resistance. The tumor resistance condition increases the tolerance of tumor cells to the cytotoxic effects of the drugand/or activate survival signals in tumor cells. These facts emphasize the necessity to look for new and more effective treatment alternatives that overcome the resistance mechanisms of tumor cells. Simvastatin is a drug of the statin class used for the treatment of dyslipidemia. Currently, it?s known that have antitumor activity, capable of inducing apoptosis, cell cycle arrest and modulate the process of autophagy in several tumor lines. The link between autophagy and apoptosis is controversial because, autophagy is sometimes treated as a mechanism able to suppress tumor development, sometimes able to promote tumor providing degradation substrates. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of simvastatin on the modulation of autophagy in human metastatic melanoma cellsWM9 lineage. Our results demonstrate that simvastatin is able to reduce the viability of WM9 cell concentration dependent manner, reaching 53,5 % and 90,3 %(by MTT method) after treatment of cells with simvastatin at concentrations of 5?Mand 1?M, respectively. The decrease in viability was followed by an increase inautophagic index of about 2.5 units for the treatment at a concentration of 5 uM andsimvastatin increased amount of cells in the G0-G1 phase of the cell cycle concentration dependent manner. The co-treatment of simvastatin with the inhibitorhydroxychloroquine promoted effectively inhibition of the autophagic process, with concomitant increased sensitivity of WM9 cells to the cytotoxic effects of simvastatin, promoting more significant reduction in cell viability (97 %, simvastatin5?M/25?M hydroxychloroquine) accompanied by significant increase in the numberof cells with fragmented DNA (18,4 % simvastatin/hydroxychloroquine 5?M/25?M).To further understand the mechanism of the action of simvastatin capable of inducing autophagy, were evaluated two key markers of the autophagic process. Itcan be observed increased levels of expression of LC3-I/II proportional to the concentration of simvastatin and concomitant reduction of p62 protein levels. When the autophagic process was inhibited by the use of hydroxychloroquine it was observed that the expression of LC3-I/II was reduced, and p62 levels were unchanged. Confirming the results of expression, it was observed that the number of WM9 cells with fluorescent vacuoles (marked with LC3-GFP protein fusion)percentage increase with increasing concentration of simvastatin used in the treatments. Together, these results indicates that the treatment of cells withsimvastatin WM9 is capable of inducing the autophagic process in a concentration dependent manner, which is a tumor resistance mechanism in human melanoma model. Note that independent of the increase in autophagic flux simvastatin wascytotoxic, making interesting possibility to be used as an alternative therapeutic agent and/or adjuvant to chemotherapy. Key-Words: Melanoma, simvastatin, autophagy

Papel de vesículas extracelulares na modulação dos fenótipos de agressividade e resistência em modelo de glioblastoma humano

Orientadora: Profa. Dra. Sheila Maria Brochado WinnischoferCoorientador: Prof. Dr. Marcel Ivan RamírezTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 18/01/2021Inclui referências: p. 92-100Resumo: Os gliomas apesar de apresentarem baixa incidência (2% dos tumores malignos em geral) possuem altas taxas de mortalidade. O quimioterápico padrão para esse tipo de tumor é a Temozolomida (TMZ). Dentre os gliomas, os astrocitomas são os mais comuns e são classificados de acordo com o grau de agressividade (I a IV), sendo o IV conhecido como glioblastoma - GB. Apesar do progresso na terapia, o perfil de agressividade e os mecanismos de resistência tumoral dificultam o tratamento. Células de GB secretam vesículas extracelulares (VEs) e o conteúdo dessas vesículas pode estar associado à modulação de fenótipos como agressividade e resistência. Diversos alvos moleculares caracterizados na biologia tumoral vêm sendo descritos no conteúdo vesicular. No presente trabalho, um de nossos principais alvos é o gene supressor de tumor RECK e seu transcrito alternativo RECK-var 3 (associado a mau prognóstico) com o objetivo de avaliar o papel de ambos na modulação dos fenótipos de agressividade e resistência, via VEs, em modelo de GB humano. Foram utilizadas as linhagens A172, T98G, U87MG, U87MG-EGFR, U87MG-RECK e U87MG-RECK var 3, diferentes em relação ao grau de agressividade e nível de expressão endógena dos transcritos. Nossos resultados mostram que VEs derivadas destas células foram caracterizadas como uma população majoritariamente de microvesículas (cerca de 200 nm). A internalização das VEs foi observada na linhagem A172 incubada com VEs derivadas das outras linhagens. Houve aumento na proliferação e na capacidade de formação de colônias em substrato sólido das células A172 após incubação com VEs de células mais agressivas (U87MG, U87MG-EGFP, U87MG-RECK var 3), sugerindo que essas VEs modularam o fenótipo de agressividade das células A172. Ainda, os resultados sugerem um aumento da proteína RECK endógena nas células A172 após incubação com VEs derivadas da linhagem U87MG-RECK, assim como um aumento nos níveis de transcrito de RECK-var 3 após incubação com VEs da linhagem U87MG-RECK var3. Juntos, esses resultados mostram a participação de ambos os transcritos na modulação do fenótipo de agressividade. Comparando os perfis das células U87MG e T98G na responsividade à TMZ, foi observado que células U87MG incubadas com VEs derivadas de T98G (resistente à TMZ) e posteriormente tratadas com TMZ aumentaram a sua resistência ao quimioterápico. Por outro lado, VEs derivadas de U87MG incubadas em células T98G parecem sensibilizá-las à TMZ enquanto VEs derivadas de U87MG-RECK var 3 parecem reverter esse efeito, não alterando a resistência ao tratamento. Os resultados encontrados até o momento evidenciam que células de glioblastoma com níveis diferenciados de RECK e RECKvar 3 são capazes de modular o fenótipo proliferativo e de resistência tumoral via sua capacidade de secreção de VEs com características distintas.Abstract: Despite gliomas have a low incidence (2% of malignant tumors in general), they have high mortality rates. The standard chemotherapy for this type of tumor is Temozolomide (TMZ). Among gliomas, astrocytomas are the most common and are classified according to the degree of aggression (I to IV), the IV being known as glioblastoma - GB. Despite progress in therapy, the profile of aggressiveness and the mechanisms of tumor resistance make treatment difficult. GB cells secrete extracellular vesicles (EVs), and the contents of these vesicles may be associated with the modulation of phenotypes such as aggressiveness and resistance. Several molecular targets characterized in tumor biology have been described in the vesicular content. In the present study, one of our targets is the RECK tumor suppressor gene and its alternative RECK-var 3 transcript (associated with poor prognosis) to evaluate the role of both in modulating the phenotypes of aggression and resistance, via EVs, in a human GB model. The cell lines A172, T98G, U87MG, U87MG-EGFR, U87MG-RECK and U87MG-RECK var 3 were used, different in relation to the degree of aggressiveness and level of endogenous expression of the transcripts. Our results show that EVs derived from these cells were characterized as a population mainly of microvesicles (about 200 nm). The internalization of EVs was observed in the A172 cells incubated with EVs derived from the other cells. There was modulation in the proliferation and colony formation capacity on solid substrate of A172 cells after incubation with EVs of more aggressive cells (U87MG, U87MGEGFP, U87MG-RECK var 3), suggesting that these EVs modulated the cell aggressiveness phenotype A172. Furthermore, we can observe the modulation of the endogenous RECK protein in A172 cells after incubation with EVs derived from the U87MG-RECK cells, as well as an increase in the transcript levels of RECK-var 3 after incubation with EVs of the U87MG-RECK var3 cells. Together, these results suggest the participation of both transcripts in the modulation of the aggressiveness phenotype. Comparing the profiles of U87MG and T98G cells in response to TMZ, it was observed that U87MG cells incubated with EVs derived from T98G (resistant to TMZ) and subsequently treated with TMZ increased their resistance to chemotherapy. On the other hand, EVs derived from U87MG incubated in T98G cells appear to sensitize them to TMZ while EVs derived from U87MG-RECK var 3 seem to reverse this effect, without changing the resistance to treatment. The results found so far show that glioblastoma cells with differentiated levels of RECK and RECK-var 3 can modulate the proliferative and tumor resistance phenotype, mediated by the secretion capacity of EVs with different characteristics

AVALIAÇÃO DO PERFIL LIPÍDICO EM ADULTOS NO SUL DO BRASIL

Objetivo: avaliar o perfil lipídico em adultos de um laboratório de análises clínicas em Santana do Livramento/RS. Metodologia: estudo transversal retrospectivo quantitativo desenvolvido em um laboratório com 944 indivíduos que realizaram dosagens do perfil lipídico. Resultados: a maioria dos indivíduos apresentou dosagens de lipídeos fora do desejável. Foi observada diferença estatisticamente significante entre os sexos e os valores de HDL-c (p≤ 0,001) e triglicerídeos (p≤ 0,001). Associação significativa foi observada entre a faixa etária e as dosagens de colesterol total (p≤0,001) e LDL-c (p=0,010), para ambos os sexos. Percentuais elevados de hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia isolada, hiperlipidemia mista e HDL-c baixo foram observados em indivíduos a partir dos 40 anos de idade. Conclusão: os resultados encontrados evidenciaram uma forte tendência ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares a partir de 40 anos de idade e poderão contribuir para um planejamento preventivo de estratégias de saúde pública na região.Descritores: Prevalência; Dislipidemias; lipídeo

Post-Transcriptional Control of RNA Expression in Cancer

Approximately 80% of the human genome contains functional DNA, including protein coding genes, non-protein coding regulatory DNA elements and non-coding RNAs (ncRNAs). An altered transcriptional signature is not only a cause, but also a consequence of the characteristics known as the hallmarks of cancer, such as sustained proliferation, replicative immortality, evasion of growth suppression and apoptotic signals, angiogenesis, invasion, metastasis, evasion of immune destruction and metabolic re-wiring. Post-transcriptional events play a major role in determining this signature, which is evidenced by the fact that alternative RNA splicing takes place in more than half of the human genes, and, among protein coding genes, more than 60% contain at least one conserved miRNA-binding site. In this chapter, we will discuss the involvement of post-transcriptional events, such as RNA processing, the action of non-coding RNAs and RNA decay in cancer development, and how their machinery may be used in cancer diagnosis and treatment

The utilization of primary care and emergency services in the SUS of Belo Horizonte : health problems, procedures and choice of services

Avalia-se o uso das unidades básicas e de urgências do Sistema Único de Saúde (SUS) de Belo Horizonte (BH). Objetivos: identificar o principal problema de saúde que o cidadão leva à Unidade de Pronto- atendimento (UPA) e à Unidade Básica de Saúde (UBS), considerando as especificidades dos níveis de atenção; caracterizar os principais procedimentos de atenção básica e de média complexidade utiliza- dos nesses serviços, comparativamente. Pesquisa do tipo survey, com aplicação direta de questionário fechado a 997 entrevistados, distribuídos em 10 UBSs e 7 UPAs. A demanda que chega aos serviços investigados é por consultas médicas e por procedimentos de enfermagem, motivada por afecções leves, passíveis de atendimento na atenção básica. Os usuários vão à UBS por ser um serviço próximo da residência, de rápido atendimento e de fácil deslocamento, caracterizando boa oferta e capilaridade da Saúde da Família. Verificou-se duplicidade na utilização dos serviços, o que contribui para outras investigações.The use of the Primary Care and Emergency Units of Sistema Único de Saúde (SUS – Brazilian National Health System) was evaluated in the city of Belo Horizonte (Southeastern Brazil). Objectives: to identify the main health problem that the citizen takes to the Emergency Unit and to the Primary Care Unit, considering the specificities of the health care levels; to characterize the main primary level and second level procedures that are used in these services, comparatively. This is a survey in which a closed questionnaire was administered to 997 interviewees from 10 Primary Care Units and 7 Emergency Units. The demand that arrives at the investigated services is for medical consultations and nursing procedures, motivated by minor affections which can be assisted in the Primary Care Unit. Users go to the Primary Care Unit because it is a service that is close to their homes and provides quick assistance, characterizing good offer and capillarity of the Family Health Program. Duplicity in services utilization was verified, which contributes to further investigations

Anais do V Encontro Brasileiro de Educomunicação: Educação midiática e políticas públicas

A presente coletânea, que chega ao público através de um suporte digital, tem como objetivo disponibilizar os papers, bem como os relatos de experiências educomunicativas apresentados durante o V ENCONTRO BRASILEIRO DE EDUCOMUNICAÇÃO, que teve como tema central: “Educação Midiática e Políticas Públicas”. O evento foi realizado em São Paulo, entre 19 e 21 de setembro de 2013, a partir de uma parceria entre o NCE/USP - Núcleo de Comunicação e Educação da USP, a Licenciatura em Educomunicação da ECA/USP, a ABPEducom – Associação Brasileira de Pesquisadores e Profissionais da Educomunicação e a FAPCOM – Faculdade Paulus de Tecnologia e Comunicação, que ofereceu seu campus, na Vila Mariana, para os atos do evento. Os presentes anais disponibilizam o texto de abertura, de autoria do coordenador geral do evento, denominado “Educação midiática e políticas públicas: vertentes históricas da emergência da Educomunicação na América Latina”. Na sequência, apresentam 61 papers sobre aspectos específicos da temática geral, resultantes de pesquisas na área, seguidos de 27 relatos de práticas educomunicativas, em nível nacional

Reducing the environmental impact of surgery on a global scale: systematic review and co-prioritization with healthcare workers in 132 countries

Abstract Background Healthcare cannot achieve net-zero carbon without addressing operating theatres. The aim of this study was to prioritize feasible interventions to reduce the environmental impact of operating theatres. Methods This study adopted a four-phase Delphi consensus co-prioritization methodology. In phase 1, a systematic review of published interventions and global consultation of perioperative healthcare professionals were used to longlist interventions. In phase 2, iterative thematic analysis consolidated comparable interventions into a shortlist. In phase 3, the shortlist was co-prioritized based on patient and clinician views on acceptability, feasibility, and safety. In phase 4, ranked lists of interventions were presented by their relevance to high-income countries and low–middle-income countries. Results In phase 1, 43 interventions were identified, which had low uptake in practice according to 3042 professionals globally. In phase 2, a shortlist of 15 intervention domains was generated. In phase 3, interventions were deemed acceptable for more than 90 per cent of patients except for reducing general anaesthesia (84 per cent) and re-sterilization of ‘single-use’ consumables (86 per cent). In phase 4, the top three shortlisted interventions for high-income countries were: introducing recycling; reducing use of anaesthetic gases; and appropriate clinical waste processing. In phase 4, the top three shortlisted interventions for low–middle-income countries were: introducing reusable surgical devices; reducing use of consumables; and reducing the use of general anaesthesia. Conclusion This is a step toward environmentally sustainable operating environments with actionable interventions applicable to both high– and low–middle–income countries

Sinvastatina induz o processo autofágico em células de melanoma humano metastático : potencial ação na resistência tumoral

Orientadora : Profª. Drª. Sheila Maria Brochado WinnischoferCo-orientador : Profª. Drª. Glaucia Regina MartinezDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 30/03/2016Inclui referências : f. 75-82Resumo: O melanoma é um tipo de câncer de pele que possui baixa incidência, porém é muito agressivo e com alto índice de mortalidade. Vale destacar que um dos grandes desafios da terapêutica atual é a ocorrência do processo de resistência. O mecanismo de resistência tumoral é complexo e, em geral, acontece porque as células tumorais sofrem mutações, amplificações ou superexpressões de genes regulatórios ou por modulação de mecanismos compensatórios (como senescência e autofagia) que produzem a resistência. A condição de resistência propicia aumento da tolerância das células tumorais aos efeitos citotóxicos do fármaco e/ou ativa sinais de sobrevivência nas mesmas. Esses fatos enfatizam a necessidade da busca por novas alternativas de tratamento que sejam mais eficientes e que superem os mecanismos de resistência tumoral. A sinvastatina é um fármaco da classe das estatinas utilizado para o tratamento de dislipidemias. Atualmente, sabe-se que possui ação antitumoral, capaz de induzir apoptose,parada do ciclo celular e modular o processo de autofagia em diversas linhagens de tumores. A relação entre autofagia e apoptose é controversa, pois, a autofagia ora é tratada como mecanismo capaz de suprimir o desenvolvimento do tumor, ora capaz de promover o tumor fornecendo substratos da degradação decomponentes celulares. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da sinvastatina na modulação da autofagia em células de melanoma metastático humano da linhagem WM9. Nossos resultados mostram que a sinvastatina é capaz de reduzir a viabilidade das células WM9 e WM1617 de forma dependente da concentração, atingindo 53,5 % e 90,3 % (pelo método de MTT) após tratamento das células com sinvastatina nas concentrações de 1 ?M e 5 ?M,respectivamente. A redução de viabilidade foi acompanhada por aumento no índice autofágico em torno de 2,5 unidades para o tratamento na concentração de5 ?M de sinvastatina e aumento da quantidade de células na fase G0-G1 do ciclo celular de forma dependente da concentração. O co-tratamento de sinvastatina com o inibidor de autofagia hidroxicloroquina promoveu inibição efetiva do processo autofágico, com concomitante aumento da sensibilidade das célulasWM9 aos efeitos citotóxicos da sinvastatina, promovendo redução mais expressiva da viabilidade celular (atingindo 97% com a combinação sinvastatina/hidroxicloroquina, 5?M/25?M), acompanhada de aumento da quantidade de células com DNA fragmentado (atingindo 18,4% com a combinação). Para melhor compreender o mecanismo de ação da sinvastatina,foram avaliados dois marcadores chaves do processo autofágico: LC3-I/II e p62.Pode-se observar níveis aumentados da expressão de LC3-I/II proporcional ao aumento da concentração de sinvastatina e concomitante redução dos níveis de proteína p62. Quando o processo autofágico foi inibido pelo uso da hidroxicloroquina observou-se que a expressão de LC3-I/II foi diminuída e os níveis de p62 não foram alterados. Ainda, foi observado que o número de células WM9com vacúolos fluorescentes (marcados com a proteína de fusão GFP-LC3)aumentam percentualmente com o aumento da concentração de sinvastatina utilizada nos tratamentos, fato que corrobora os resultados de expressão. Juntos,esses dados indicam que o tratamento das células WM9 com sinvastatina é capaz de induzir o processo autofágico de maneira concentração-dependente, sendo este um mecanismo de resistência tumoral em modelo de melanoma humano.Vale destacar que, independente do aumento no fluxo autofágico, a sinvastatina foi citotóxica, tornando interessante a possibilidade de ser utilizada como um agente terapêutico alternativo e/ou adjuvante ao uso de quimioterápicos.Palavras-chave: Melanoma, sinvastatina, autofagia.Abstract: Melanoma is a type of skin cancer that has low incidence, but is very aggressive and with high mortality rate. One of the big challenges of the modern therapy is the occurrence of the resistance process. The tumor resistance mechanism is complex and usually happens because the tumor cells undergo mutations, amplifications or super expressions by regulatory genes or by modulation of compensatory mechanisms that produces resistance. The tumor resistance condition increases the tolerance of tumor cells to the cytotoxic effects of the drugand/or activate survival signals in tumor cells. These facts emphasize the necessity to look for new and more effective treatment alternatives that overcome the resistance mechanisms of tumor cells. Simvastatin is a drug of the statin class used for the treatment of dyslipidemia. Currently, it?s known that have antitumor activity, capable of inducing apoptosis, cell cycle arrest and modulate the process of autophagy in several tumor lines. The link between autophagy and apoptosis is controversial because, autophagy is sometimes treated as a mechanism able to suppress tumor development, sometimes able to promote tumor providing degradation substrates. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of simvastatin on the modulation of autophagy in human metastatic melanoma cellsWM9 lineage. Our results demonstrate that simvastatin is able to reduce the viability of WM9 cell concentration dependent manner, reaching 53,5 % and 90,3 %(by MTT method) after treatment of cells with simvastatin at concentrations of 5?Mand 1?M, respectively. The decrease in viability was followed by an increase inautophagic index of about 2.5 units for the treatment at a concentration of 5 uM andsimvastatin increased amount of cells in the G0-G1 phase of the cell cycle concentration dependent manner. The co-treatment of simvastatin with the inhibitorhydroxychloroquine promoted effectively inhibition of the autophagic process, with concomitant increased sensitivity of WM9 cells to the cytotoxic effects of simvastatin, promoting more significant reduction in cell viability (97 %, simvastatin5?M/25?M hydroxychloroquine) accompanied by significant increase in the numberof cells with fragmented DNA (18,4 % simvastatin/hydroxychloroquine 5?M/25?M).To further understand the mechanism of the action of simvastatin capable of inducing autophagy, were evaluated two key markers of the autophagic process. Itcan be observed increased levels of expression of LC3-I/II proportional to the concentration of simvastatin and concomitant reduction of p62 protein levels. When the autophagic process was inhibited by the use of hydroxychloroquine it was observed that the expression of LC3-I/II was reduced, and p62 levels were unchanged. Confirming the results of expression, it was observed that the number of WM9 cells with fluorescent vacuoles (marked with LC3-GFP protein fusion)percentage increase with increasing concentration of simvastatin used in the treatments. Together, these results indicates that the treatment of cells withsimvastatin WM9 is capable of inducing the autophagic process in a concentration dependent manner, which is a tumor resistance mechanism in human melanoma model. Note that independent of the increase in autophagic flux simvastatin wascytotoxic, making interesting possibility to be used as an alternative therapeutic agent and/or adjuvant to chemotherapy. Key-Words: Melanoma, simvastatin, autophagy

Papel de vesículas extracelulares na modulação dos fenótipos de agressividade e resistência em modelo de glioblastoma humano

Orientadora: Profa. Dra. Sheila Maria Brochado WinnischoferCoorientador: Prof. Dr. Marcel Ivan RamírezTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 18/01/2021Inclui referências: p. 92-100Resumo: Os gliomas apesar de apresentarem baixa incidência (2% dos tumores malignos em geral) possuem altas taxas de mortalidade. O quimioterápico padrão para esse tipo de tumor é a Temozolomida (TMZ). Dentre os gliomas, os astrocitomas são os mais comuns e são classificados de acordo com o grau de agressividade (I a IV), sendo o IV conhecido como glioblastoma - GB. Apesar do progresso na terapia, o perfil de agressividade e os mecanismos de resistência tumoral dificultam o tratamento. Células de GB secretam vesículas extracelulares (VEs) e o conteúdo dessas vesículas pode estar associado à modulação de fenótipos como agressividade e resistência. Diversos alvos moleculares caracterizados na biologia tumoral vêm sendo descritos no conteúdo vesicular. No presente trabalho, um de nossos principais alvos é o gene supressor de tumor RECK e seu transcrito alternativo RECK-var 3 (associado a mau prognóstico) com o objetivo de avaliar o papel de ambos na modulação dos fenótipos de agressividade e resistência, via VEs, em modelo de GB humano. Foram utilizadas as linhagens A172, T98G, U87MG, U87MG-EGFR, U87MG-RECK e U87MG-RECK var 3, diferentes em relação ao grau de agressividade e nível de expressão endógena dos transcritos. Nossos resultados mostram que VEs derivadas destas células foram caracterizadas como uma população majoritariamente de microvesículas (cerca de 200 nm). A internalização das VEs foi observada na linhagem A172 incubada com VEs derivadas das outras linhagens. Houve aumento na proliferação e na capacidade de formação de colônias em substrato sólido das células A172 após incubação com VEs de células mais agressivas (U87MG, U87MG-EGFP, U87MG-RECK var 3), sugerindo que essas VEs modularam o fenótipo de agressividade das células A172. Ainda, os resultados sugerem um aumento da proteína RECK endógena nas células A172 após incubação com VEs derivadas da linhagem U87MG-RECK, assim como um aumento nos níveis de transcrito de RECK-var 3 após incubação com VEs da linhagem U87MG-RECK var3. Juntos, esses resultados mostram a participação de ambos os transcritos na modulação do fenótipo de agressividade. Comparando os perfis das células U87MG e T98G na responsividade à TMZ, foi observado que células U87MG incubadas com VEs derivadas de T98G (resistente à TMZ) e posteriormente tratadas com TMZ aumentaram a sua resistência ao quimioterápico. Por outro lado, VEs derivadas de U87MG incubadas em células T98G parecem sensibilizá-las à TMZ enquanto VEs derivadas de U87MG-RECK var 3 parecem reverter esse efeito, não alterando a resistência ao tratamento. Os resultados encontrados até o momento evidenciam que células de glioblastoma com níveis diferenciados de RECK e RECKvar 3 são capazes de modular o fenótipo proliferativo e de resistência tumoral via sua capacidade de secreção de VEs com características distintas.Abstract: Despite gliomas have a low incidence (2% of malignant tumors in general), they have high mortality rates. The standard chemotherapy for this type of tumor is Temozolomide (TMZ). Among gliomas, astrocytomas are the most common and are classified according to the degree of aggression (I to IV), the IV being known as glioblastoma - GB. Despite progress in therapy, the profile of aggressiveness and the mechanisms of tumor resistance make treatment difficult. GB cells secrete extracellular vesicles (EVs), and the contents of these vesicles may be associated with the modulation of phenotypes such as aggressiveness and resistance. Several molecular targets characterized in tumor biology have been described in the vesicular content. In the present study, one of our targets is the RECK tumor suppressor gene and its alternative RECK-var 3 transcript (associated with poor prognosis) to evaluate the role of both in modulating the phenotypes of aggression and resistance, via EVs, in a human GB model. The cell lines A172, T98G, U87MG, U87MG-EGFR, U87MG-RECK and U87MG-RECK var 3 were used, different in relation to the degree of aggressiveness and level of endogenous expression of the transcripts. Our results show that EVs derived from these cells were characterized as a population mainly of microvesicles (about 200 nm). The internalization of EVs was observed in the A172 cells incubated with EVs derived from the other cells. There was modulation in the proliferation and colony formation capacity on solid substrate of A172 cells after incubation with EVs of more aggressive cells (U87MG, U87MGEGFP, U87MG-RECK var 3), suggesting that these EVs modulated the cell aggressiveness phenotype A172. Furthermore, we can observe the modulation of the endogenous RECK protein in A172 cells after incubation with EVs derived from the U87MG-RECK cells, as well as an increase in the transcript levels of RECK-var 3 after incubation with EVs of the U87MG-RECK var3 cells. Together, these results suggest the participation of both transcripts in the modulation of the aggressiveness phenotype. Comparing the profiles of U87MG and T98G cells in response to TMZ, it was observed that U87MG cells incubated with EVs derived from T98G (resistant to TMZ) and subsequently treated with TMZ increased their resistance to chemotherapy. On the other hand, EVs derived from U87MG incubated in T98G cells appear to sensitize them to TMZ while EVs derived from U87MG-RECK var 3 seem to reverse this effect, without changing the resistance to treatment. The results found so far show that glioblastoma cells with differentiated levels of RECK and RECK-var 3 can modulate the proliferative and tumor resistance phenotype, mediated by the secretion capacity of EVs with different characteristics