Darier disease: molecular study of a two-generation Portuguese family

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018Background Darier Disease is a rare autosomal dominant disorder, which predominantly affects the skin of individuals regardless their gender or ethnicity. Clinical manifestations usually involve nail abnormalities and focal skin lesions such as greasy, brownish-redish keratotic papules, which are distributed in seborrheic areas of the body. Affected individuals are usually heterozygous for mutation in ATPase sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Calcium transporting 2 (ATP2A2) gene, responsible for encoding Sarco/Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase 2 (SERCA2). Although ATP2A2 mutations significantly reduce ER Ca2+ stores in both lesional and non lesional keratinocytes, scientists suggest that a threshold in ER Ca2+ depletion is required to disrupt adhesion molecules, as seen in lesional epidermis. Nonetheless, DD hallmarks (acantholysis and dyskeratosis) remain to be fully elucidated. Haploinsufficiency or dominant-negative effect are the postulated pathogenic mechanisms. Objective This study consists in the molecular characterization of a two-generation Portuguese family with DD history, including co-associated phenotypes and intrafamilial phenotypic variability. Methods All exons and intron-exon borders of ATP2A2 were bidirectionally sequenced from DNA and RNA extracted from the five subjects enrolled in this study (four affected individuals and one unaffected individual). Relative levels SERCA2 mRNA and protein were quantified by RT-qPCR and western blotting, respectively. Results A splice-site mutation (c.1287+1G>T or IVS10+1G>T) was identified in all four affected individuals, who carry the mutation in heterozigosity, whereas the unaffected individual was shown to carry the wild-type ATP2A2 sequence in both alleles. This mutation leads to the skipping of full exon 10, which consequently generates a frameshift followed by a premature translation termination codon in exon 11. Results from RT-PCR of a fragment spanning exons 8-13 suggest that a small amount of the mutant transcript escapes NMD and less than 50% expression of the wild-type transcript is detected. In agreement, relative wild-type and mutant SERCA2 mRNA expression levels assessed by qPCR revealed wild-type gene expression alone revealed a 36% expression, while mutant mRNA expression exhibited residual levels of 18%. In contrast, western blot results showed 40 to 50% expression of wild-type SERCA2 (115 kDa) in DD patients when compared to the healthy individual, while no sign of the putative mutant SERCA2 (45 kDa) was detected. These findings suggest that despite the escape of a small portion of abnormal SERCA2 mRNA from NMD, there is still no generation of mutant protein. Therefore, haploinsufficiency appears to be the mechanism underlying DD pathology in these patients. Finally, no genotype-phenotype correlations were found; however, this study contributed to alert physicians to the wide range of defects predicted by ATP2A2 mutations, including neuropsychiatric features, hearing loss, corneal viral infections by HSV, and glomerular nephritis which is, to the best of our knowledge, here firstly reported in association with DD. Conclusion As the first study of Portuguese patients, it adds knowledge to the worldwide mutational and clinical spectrum of DD and, importantly, contributes to genetic counseling since it allowed to discard a possible carrier status of the unaffected member of the family.Introdução A doença de Darier é uma genodermatose rara, de transmissão autossómica dominante, que não distingue sexo ou etnia. As manifestações clínicas caraterísticas desta doença envolvem anomalias nas unhas e lesões cutâneas focais, tais como pápulas queratóticas acastanhadas-avermelhadas distribuídas pelas áreas seborreicas do corpo. Os indivíduos afetados são geralmente heterozigóticos para uma mutação no gene ATP2A2, responsável pela codificação da proteína SERCA2. Embora as mutações no gene ATP2A2 reduzam significativamente as reservas de Ca2+ no retículo endoplasmático em células lesionadas e não lesionadas, os cientistas sugerem a necessidade de um limite na depleção destas reservas para interferir no funcionamento de moléculas de adesão, como observado nos queratinócitos acantolíticos da epiderme lesionada. Haploinsuficiência ou efeito dominante negativo são os mecanismos patogénicos postulados para o fenótipo de Darier. Objetivo Este projeto consiste na caraterização molecular duas gerações de uma família Portuguesa de com histórico de doença de Darier, incluindo co-fenótipos e variabilidade fenotípica intrafamiliar. Métodos Todos os exões e limites exão-intrão do gene ATP2A2 foram sequenciados bidirecionalmente a partir de DNA e RNA extraídos dos cinco indivíduos envolvidos neste estudo (quatro afetados e um não afetado). Os níveis relativos de RNA mensageiro e proteína SERCA2 foram quantificados por PCR em tempo real e Western blotting, respetivamente. Resultados A mutação patogénica (c.1287 + 1G> T ou IVS10 + 1G> T) foi identificada em todos os quatro indivíduos afetados, que exibem a mutação em heterozigotia, enquanto o indivíduo não afetado exibe a sequência normal de ATP2A2 em ambos os alelos. A mutação altera o splicing e leva à eliminação completa do exão 10, que consequentemente altera a leitura da ORF, seguida de um codão de terminação de tradução prematura no exão 11. Os resultados de RT-PCR, correspondente à amplificação de um fragmento abrangendo os exões 8 a 13, sugerem que uma pequena quantidade do transcrito mutado consegue escapar ao NMD e que a expressão de transcrito normal é inferior a 50% relativamente ao indivíduo normal. Em conformidade, os níveis relativos de expressão de RNA mensageiro SERCA2 normal e mutado avaliados por PCR em tempo real revelaram 36% de expressão do gene normal, e aproximadamente 18% de expressão do transcrito mutado. Em contraste, os resultados de western blot mostraram 40 a 50% de expressão de SERCA2 normal (115 kDa) nos indivíduos com a doença, em comparação com o indivíduo saudável, enquanto nenhum sinal da hipotética proteína mutada (45 kDa) foi detetado. Em geral, os resultados obtidos sugerem que, apesar da pequena porção de transcrito mutado escapar ao NMD, não há tradução em proteína mutada, ou esta deve ser imediatamente degradada. Portanto, a haploinsuficiência parece ser o mecanismo responsável pela patologia de Darier nos doentes estudados. Finalmente, não foi possível identificar qualquer correlação genótipo-fenótipo; no entanto, este estudo contribuiu para alertar os médicos dermatologistas sobre a panóplia de alterações provocadas pelas mutações no gene ATP2A2, incluindo sintomas neuropsiquiátricos, perda de audição, infeções virais da córnea causadas por HSV, e nefrite glomerular membranosa que é, pelo que temos conhecimento, relatado neste trabalho pela primeira vez em associação com DD. Conclusão Como primeiro estudo em doentes Portugueses, esta investigação acrescenta conhecimento ao espetro mutacional e clínico mundial da doença de Darier e, mais importante, contribui para o aconselhamento genético, uma vez que permitiu descartar um possível estatuto de portador do membro não afetado da família

A MÚSICA NO AMBIENTE ESCOLAR

Vivemos em uma sociedade em que a música está presente intrinsecamente no cotidiano. O namoro, lazer, esporte, cultos religiosos entre outras atividades são regidas pela música. Deve ser considerada também a importante tarefa de contribuir para externar nosso s sentimentos e emoções, assim não podemos vê-la apenas com uma função de entretenimento. Algumas pesquisas colocam que existem benefícios intelectuais para aqueles que praticam música, já que induz o prolongamento de neurônios e a ampliação de conexões entre eles. Então começamos a pensar sobre a necessidade de trabalhar mais a musicalização dentro do ambiente escolar, assim além das atividades escolares serem mais prazerosas, poderia potencializar o desenvolvimento intelectual dos alunos. Esta pesquisa foi realizada com o objetivo de apresentar a possível importância d o ensino de música dentro do ambiente escolar, tendo em vista que os estudantes que tocam algum instrumento, vem demonstrando aumento em seu desempenho. A pesquisa foi realizada com estudantes do Ensino Médio do Colégio da Polícia Militar – Unidade Dendezeiros, Salvador-Bahia, considerando que nesta escola possui uma banda de música constituída por alunos. Utilizamos os métodos qualitativos e quantitativos. Em um primeiro momento houve a necessidade de nivelamento do conteúdo, assim foi feita uma revisão de literatura ; para realização da pesquisa de campo utilizou-se um questionário contendo 8 (oito) perguntas objetivas de múltipla escolha com a finalidade de reconhecer um possível desenvolvimento que os entrevistados poderiam ter adquirido após o início de aulas de música. A participação dos entrevistados obedeceu ao critério de serem alunos do CPM e estarem participando da banda de música, ou de já terem participado dela. Em posse dos questionários aplicados, foi realizada a tabulação dos dados e a construção e análise dos gráficos. Foram entrevistados 32 (trinta e dois alunos. 100% (cem) dos alunos afirmam que o ensino da música é essencial nas escolas. Quanto ao aumento de seu desempenho escolar, 94% (noventa e quatro) destes alunos relatam que apresentaram alguma melhora, apenas 6% (seis) não apresentaram melhora no desempenho. Percebemos também que a relação social dos entrevistados aumentou em 100% (cem), assim como a sua autoestima o qual 87% (oitenta e sete) do s entrevistados dizem que aumentou consideravelmente. Quando perguntados sobre o aumento de seus níveis intelectuais62% (sessenta e dois) responderam que houve uma melhora, 31% (trinta e um) responderam que ela talvez po de ter ocorrido e 7% (sete) responderam que não houve melhora. Com esses dados pode-se perceber que, pelo menos na maioria dos entrevistados, há sim uma melhora tanto intelectual ou de desempenho quanto no campo social e psicológico, de modo que visam a música como importante auxílio para o desenvolvimento do indivíduo no ambiente escolar. Ao longo dessa pesquisa nós conseguimos compreender de fato as influências e consequências que a música e sua prática proporciona para o estágio de desenvoltura das pessoas. Assim achamos que as escolas deveriam de certa forma terem o devido suporte e condição de se aperfeiçoar no ensino e prática musical com intuito de proporcionar uma melhor formação dos seus respectivos alunos em qualquer faixa de idade, visando sempre os fatores de desempenho no campo social e psicológico. Esperamos que com esse resultado favorável, as escolas tentem adquirir recursos para ter estrutura adequada para ensino e prática de música, para que seus respectivos alunos possam obter melhora em seu desenvolvimento

H3K36 methylation and DNA-binding both promote Ioc4 recruitment and Isw1b remodeler function

The Isw1b chromatin-remodeling complex is specifically recruited to gene bodies to help retain pre-existing histones during transcription by RNA polymerase II. Recruitment is dependent on H3K36 methylation and the Isw1b subunit Ioc4, which contains an N-terminal PWWP domain. Here, we present the crystal structure of the Ioc4-PWWP domain, including a detailed functional characterization of the domain on its own as well as in the context of full-length Ioc4 and the Isw1b remodeler. The Ioc4-PWWP domain preferentially binds H3K36me3-containing nucleosomes. Its ability to bind DNA is required for nucleosome binding. It is also furthered by the unique insertion motif present in Ioc4-PWWP. The ability to bind H3K36me3 and DNA promotes the interaction of full-length Ioc4 with nucleosomes in vitro and they are necessary for its recruitment to gene bodies in vivo. Furthermore, a fully functional Ioc4-PWWP domain promotes efficient remodeling by Isw1b and the maintenance of ordered chromatin in vivo, thereby preventing the production of non-coding RNAs

Glucosylpolyphenols as Inhibitors of Aβ-Induced Fyn Kinase Activation and Tau Phosphorylation: Synthesis, Membrane Permeability, and Exploratory Target Assessment within the Scope of Type 2 Diabetes and Alzheimer's Disease

Despite the rapidly increasing number of patients suffering from type 2 diabetes, Alzheimer's disease, and diabetes-induced dementia, there are no disease-modifying therapies that are able to prevent or block disease progress. In this work, we investigate the potential of nature-inspired glucosylpolyphenols against relevant targets, including islet amyloid polypeptide, glucosidases, and cholinesterases. Moreover, with the premise of Fyn kinase as a paradigm-shifting target in Alzheimer's drug discovery, we explore glucosylpolyphenols as blockers of Aβ-induced Fyn kinase activation while looking into downstream effects leading to Tau hyperphosphorylation. Several compounds inhibit Aβ-induced Fyn kinase activation and decrease pTau levels at 10 μM concentration, particularly the per-O-methylated glucosylacetophloroglucinol and the 4-glucosylcatechol dibenzoate, the latter inhibiting also butyrylcholinesterase and β-glucosidase. Both compounds are nontoxic with ideal pharmacokinetic properties for further development. This work ultimately highlights the multitarget nature, fine structural tuning capacity, and valuable therapeutic significance of glucosylpolyphenols in the context of these metabolic and neurodegenerative disorders.European Commission GA 612347Fundação para a Ciência e a Tecnologia SFRH/BD/93170/2013, SFRH/BD/116614/2016, PD/BD/142847/2018, SFRH/BD/145600/2019, CEECIND/03414/2018, CEECIND/02300/2017, UIDB/00100/2020, UIDB/04046/2020, UIDB/04378/2020, IF/00780/2015Gobierno de España CTQ2016-78703-PJunta de Andalucía FQM13

Sugar-based bactericides targeting phosphatidylethanolamine-enriched membranes

Free PMC Article: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6242839/Anthrax is an infectious disease caused by Bacillus anthracis, a bioterrorism agent that develops resistance to clinically used antibiotics. Therefore, alternative mechanisms of action remain a challenge. Herein, we disclose deoxy glycosides responsible for specific carbohydrate-phospholipid interactions, causing phosphatidylethanolamine lamellar-to-inverted hexagonal phase transition and acting over B. anthracis and Bacillus cereus as potent and selective bactericides. Biological studies of the synthesized compound series differing in the anomeric atom, glycone configuration and deoxygenation pattern show that the latter is indeed a key modulator of efficacy and selectivity. Biomolecular simulations show no tendency to pore formation, whereas differential metabolomics and genomics rule out proteins as targets. Complete bacteria cell death in 10 min and cellular envelope disruption corroborate an effect over lipid polymorphism. Biophysical approaches show monolayer and bilayer reorganization with fast and high permeabilizing activity toward phosphatidylethanolamine membranes. Absence of bacterial resistance further supports this mechanism, triggering innovation on membrane-targeting antimicrobials.The European Union is gratefully acknowledged for the support of the project “Diagnostic and Drug Discovery Initiative for Alzheimer’s Disease” (D3i4AD), FP7-PEOPLE-2013-IAPP, GA 612347. We thank the Management Authorities of the European Regional Development Fund and the National Strategic Reference Framework for the support of the Incentive System - Research and Technological Development Co-Promotion FACIB Project number 21457. Fundação para a Ciência e a Tecnologia is also acknowledged for the support of projects UID/Multi/00612/2013, FCT/UID/ Multi/04046/2013, IF/00808/2013/CP1159/CT0003, PTDC/BBBBQB/6071/2014, as well as for the post-doc grant SFRH/BPD/42567/2007 (A.M.), the Ph.D. grants SFRH/BDE/51998/2012 (C.D.), and SFRH/BDE/51957/2012 (J.P.P.), both co-sponsored by CIPAN, and also for the Ph.D. grant SFRH/BD/116614/2016 (R.N.).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Interlaboratory Coverage Test on Plant Food Bioactive Compounds and their Metabolites by Mass Spectrometry-Based Untargeted Metabolomics.

Bioactive compounds present in plant-based foods, and their metabolites derived from gut microbiota and endogenous metabolism, represent thousands of chemical structures of potential interest for human nutrition and health. State-of-the-art analytical methodologies, including untargeted metabolomics based on high-resolution mass spectrometry, are required for the profiling of these compounds in complex matrices, including plant food materials and biofluids. The aim of this project was to compare the analytical coverage of untargeted metabolomics methods independently developed and employed in various European platforms. In total, 56 chemical standards representing the most common classes of bioactive compounds spread over a wide chemical space were selected and analyzed by the participating platforms (n = 13) using their preferred untargeted method. The results were used to define analytical criteria for a successful analysis of plant food bioactives. Furthermore, they will serve as a basis for an optimized consensus method

Dez anos de experiência com a substituição da valva aórtica com homoenxertos valvares aórticos implantados pela técnica da substituição total da raiz

OBJETIVO: Avaliar os resultados imediatos e tardios de 10 anos da substituição da valva aórtica por homoenxertos valvares aórticos implantados pela técnica de substituição total da raiz, e identificar eventuais fatores de risco correlacionados com a degeneração tecidual primária dos enxertos. MÉTODO: Entre maio/1995 e janeiro/2006, 282 pacientes com média de idade de 52,8±16,6 anos foram submetidos à substituição da valva aórtica com homoenxertos valvares. As etiologias prevalentes foram a valva aórtica bicúspide calcificada e a degeneração senil em 49% dos casos. Quarenta e sete pacientes eram reoperações e 26 tinham endocardite bacteriana aguda. Procedimentos associados foram realizados em 113 pacientes. O homoenxerto valvar foi implantado pela técnica de substituição total da raiz em todos os casos. O tempo de seguimento pós-operatório variou de 1 a 129 meses (média = 41±25 meses). RESULTADOS: A mortalidade imediata foi de 7%, sendo de apenas 2,6% nos casos de operação eletiva para a substituição isolada da valva aórtica. Dos 262 que receberam alta hospitalar, foi possível obter avaliação clínica e/ou ecocardiograma em 209 deles, sendo 51 (20%) perdidos durante o seguimento. Houve 17 óbitos tardios, entre o 2º e 81º meses de pós-operatório, o que resultou em curva atuarial de sobrevida global de 90% e 80,1% aos 5 e 10 anos de evolução, respectivamente. Foram observados apenas oito episódios tromboembólicos (quatro imediatos e quatro tardios), durante a evolução para uma incidência linearizada de 0,3%/100 pacientes/ano. Endocardite bacteriana ocorreu em três ocasiões (0,4%/100 pacientes/ano). Nove pacientes foram reoperados, dos quais apenas três por problemas no homoenxerto (uma degeneração tecidual e dois casos de endocardite), o que resultou numa probabilidade de 94% livres dessa complicação aos 10 anos de seguimento. A análise do ecocardiograma tardio demonstrou gradiente máximo variando entre 3 a 47 mmHg (média de 14,5 mmHg), sendo que apenas dois pacientes apresentavam gradiente superior a 40mmHg. Insuficiência valvar moderada foi encontrada em quatro pacientes. CONCLUSÕES: Os resultados imediatos e tardios com a substituição da valva aórtica por homoenxerto valvar criopreservado foram excelentes, com boa capacidade funcional e baixa morbi-mortalidade tardia. O único fator de risco para a degeneração tecidual primária foi a idade do paciente menor que 20 anos. Homoenxertos aórticos representam uma excelente opção para pacientes com idade acima de 40-50 anos, especialmente naqueles com contra-indicação ou que não desejem fazer o uso de anticoagulantes

Interlaboratory Coverage Test on Plant Food Bioactive Compounds and their Metabolites by Mass Spectrometry-Based Untargeted Metabolomics

Bioactive compounds present in plant-based foods, and their metabolites derived from gut microbiota and endogenous metabolism, represent thousands of chemical structures of potential interest for human nutrition and health. State-of-the-art analytical methodologies, including untargeted metabolomics based on high-resolution mass spectrometry, are required for the profiling of these compounds in complex matrices, including plant food materials and biofluids. The aim of this project was to compare the analytical coverage of untargeted metabolomics methods independently developed and employed in various European platforms. In total, 56 chemical standards representing the most common classes of bioactive compounds spread over a wide chemical space were selected and analyzed by the participating platforms (n = 13) using their preferred untargeted method. The results were used to define analytical criteria for a successful analysis of plant food bioactives. Furthermore, they will serve as a basis for an optimized consensus method