Identification of the proteomes of C-Kit and SCA-1 expressing populations of mice cardiac stem cells

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Heart failure and other heart diseases are the most important death causes in developed countries. When the heart fails, it heals by scar formation, which compromises its normal ability to pump sufficient blood to meet the metabolic demands of the body. As the heart was usually viewed as a post mitotic organ, the renewal of its tissue by endogenous cells was considered non-existent. However, recent studies in which small dividing cells with stem cell surface marker were found in the heart and identified as Cardiac Stem Cells (CSCs), changed this view and gave a new perspective in therapeutic approaches to heart related diseases. As CSCs are a recent discovery, it is essential to study and characterize these cells to better understand the way in which they regenerate the heart damaged tissue, the molecular factors involved in their mobilization and differentiation and the molecular factors produced by these cells. In the present work, the membrane and nucleus of CSCs expressing the stem cell markers Sca-1 and c-Kit were isolated using differential centrifugation, and the proteome of this nuclear and membrane fractions, along with a whole cell sample for the c-kit+ CSCs was analyzed by Peptide Mass Fingerprint, using MALDI ionization coupled with FT-ICR detection, which allowed an increase in sensitivity and resolution. 122 proteins were identified, 48 for the c-kit+ CSCs and 74 for the Sca-1+ population. Uncharacterized proteins were found in both kinds of cells, along with proteins involved in the proliferation pathways common to both populations, as is the case of the Protein Chibby Homolog 1, or specific of c-kit+ population (Alpha Enolase) or to the Sca-1+ population (47 kDa heat shock protein). Other differences were found and discussed. This work is the first attempt at the unraveling of the proteome of Cardiac Stem Cells.Até ao seculo XX, o coração era considerado um órgão pós-mitótico, sem capacidade de auto-regeneração. Estudos recentes levaram a uma mudança de paradigma, provando a existência de células estaminais no coração, Células Estaminais Cardíacas (CEC), responsáveis por uma taxa diminuta de renovação do tecido cardíaco, e revelando novas possibilidades de terapia para doenças cardíacas. Infelizmente, pouco se sabe ainda acerca dos mecanismos subjacentes à diferenciação e migração destas células, pelo que há necessidade de estudos neste sentido, exigindo uma investigação mais detalhada. No presente projecto caracterizou-se o proteoma de duas populações de Células Estaminais Cardíacas, caracterizadas por apresentarem os marcados de superfície celular c-kit e Sca-1. Através da identificação do proteoma de membrana e núcleo destas células, pretende-se obter conhecimento acerca dos mecanismos subjacentes à diferenciação e proliferação de CSCs, utilizando o modelo animal de ratinhos Balb C, com o objectivo de melhor compreender o potencial destas células na regeneração cardíaca No Capítulo 1 descreve-se com detalhe as propriedades das Células Estaminais Cardíacas. Estas células são multipotentes, pelo que podem diferenciar-se nas três linhagens cardíacas: Cardiomiócitos, Músculo Liso vascular e Células Endoteliais, e têm um papel importante na regeneração cardíaca.Estas célulasdemonstram capacidade de auto-renovação, apresentam elevada plasticidade, e possuem ainda a capacidade de se dividirem assimetricamente, gerando uma nova Célula Estaminal Cardíaca é uma célula progenitora, que se irá diferenciar numa das três linhagens cardíacas já referidas. Cada vez mais existem resultados que indicam que as proteínas secretadas pelas Células Estaminais Cardíacas na vizinhança de uma lesão cardíaca têm um papel importante na regeneração. É fundamental conhecer as vias de sinalização autócrinas e parácrinas destas células e perceber de que modo influenciam a diferenciação e migração das Células Estaminais Cardíacas. Devido a serem uma descoberta recente, pouco se sabe acerca do metabolismo e da sua biologia destas células. O conhecimento do proteoma das Células Estaminais Cardíacas é fundamental para a aplicação destas células em terapia, uma vez que a maioria das funções celulares é exercida por proteínas. O estudo do seu proteoma recorrendo à espectrometria de massa é a estratégia proposta neste trabalho. A abordagem proteómica Bottom-Up à caracterização do proteoma das CSCs permite a identificação de várias proteínas numa mistura. A amostra proteica é digerida enzimaticamente, através da incubação com trispsina, os péptidos resultantes são analisados por espectrometria de massa, e as proteínas identificadas por PeptideMassFingerprint usando o motor de busca MASCOT (www.matrixscience.com). A partir do homogenato proteico, as proteínas a identificar são separadas de acordo com a massa por electroforese unidimensional (SDS-PAGE), separando as proteínas de acordo com a sua massa molecular. Após a digestão das amostras, a mistura de péptidos é analisada por MALDI-FTICR (Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization, com deteccao por Fourier Transform- IonCyclotronRessonanceMassSpectrometry). A análise por FTICR-MS permite a mais elevada exactidão de massa e resolução, dois factores cruciais para o sucesso da identificaçãao de proteínas em misturas complexas. O conhecimento do proteoma das Células Estaminais Cardíacas permite o acesso a informação acerca dos mecanismos que levam à migração e diferenciação das Células Estaminais Cardíacas. No Capítulo 2, é descrito o método de isolamento de Células Estaminais Cardíacas e os resultados obtidos. Ratinhos Balb C foram executados e os seus miocárdios submetidos a destruição manual e várias sequências de centrifugações e filtrações, obtendo-se uma suspensão de células cardíacas. Desta suspensão, através do uso da técnica de FluorescentActivatedCellSorting, as duas populações de Células Estaminais Cardíacas forma isoladas, utilizando sondas fluorescentes, isto é, fluorocromos conjugados com anticorpos monoclonaisanti c-kit e anti Sca-1.Citometria de fluxo é uma técnica amplamente usada para medir características de partículas biológicas. As células a serem analisadas são preparadas em suspensão celular singlecell, e o fluxo-uni-celular é bombardeado com um laser. Quando o laser atinge as células previamente marcadas com uma sonda fluorescente, a fluorescência emitida permite seleccionar e isolar estas células marcadas. A emissão de fluorescência pelas sondas utilizadas permite o isolamento das células que se ligam as mesmas. 1134807 Células Estaminais Cardíacas foram isoladas para a população c-kit+, a partir de 82 ratinhos. 77656 células foram isoladas para a população Sca-1+, a partir de 30 ratinhos, tenho esta população sido mais fácil de isolar, como previsto pela literatura. A partir das amostras obtidas no Capitulo 2, foram isoladas fracções membranares e nucleares de cada população, através do método de centrifugação diferencial, no Capítulo 3. As populações foram isoladas com sucesso, facto verificado através de Western Blott, uma vez que para a fracção membranar o marcador de membrana (Sca-1 e c-kit) é observado em maior quantidade que o marcador nuclear (phospho-Histona H3), e na fracção nuclear apenas o marcador nuclear é observado. Devido a escassez de amostras de Células Estaminais Cardíacas c-kit+, uma amostra de wholecell, isto é, extracto proteico não fraccionado contendo proteínas provenientes de todos os componentes celulares, foi também efectuada, através de 3 diferentes métodos de extracção de proteínas, uma optimização que permitiu perceber a necessidade de elevadas quantidades de células c-kit+com vista à obtenção de quantidades de proteína suficientes para a visualização por SDS-PAGE, fundamental para a última parte do trabalho desenvolvido. O estudo do proteoma das Células Estaminais Cardíacas foi desenvolvido no Capítulo 4. A partir das fracções membranares e nucleares de Células Estaminais Cardíacas c-kit+ e Sca-1+procedeu-se a separação das proteínas por SDS-PAGE, e seguidamente a digestão com tripsina das bandas do gel, obtendo um conjunto de péptidos a analisar por MALDI-FTICR. Após a análise dos espectros através de ferramentas bioinformáticas, identificaram-se 134 proteínas, 58 para as Células Estaminais Cardíacas c-kit+, e 74 para as Células Estaminais Cardíacas Sca-1+. Das 35 proteínas identificadas para a fracção wholecell de Células Estaminais Cardíacas c-kit+, 8,3% estão envolvidas nos mecanismos de proliferação celular (Stress- Induced Phosphoprotein-1, Alpha-Enolase, ProteinChibbyHomolog 1), e 11,1 % são proteínas não caracterizadas e de função desconhecida. Na fracção membranar desta população de Células Estaminais Cardíacas identificaram-se as mesmas proteínas não caracterizadas e de função desconhecida, e ainda 10% de proteínas envolvidas nos mecanismos de proliferação. Na identificação de proteínas nucleares desta população de Células Estaminais Cardíacas foram identifcadas proteínas de função ubiquitária Para a população de Células Estaminais Cardíacas Sca-1+, das 45 proteínas identificadas, 2% estão relacionadas com a proliferação celular e 4% com os processos de diferenciação celular. Todas as proteínas identificadas para a fracção membranar de Células Estaminais Cardíacas c-kit+ foram encontradas nesta fracção, demonstrando a similaridade de ambas as populações de células estaminais. No entanto, mais estudos serão necessários para determinar quais as diferenças mais relevantes entre os proteoma das duas populações de Células Estaminais Cardíacas. As proteínas identificadas na fracção nuclear de Células Estaminais Cardíacas Sca-1+ estão maioritariamente relacionadas com a regulação da transcrição e são comuns a maioria das células mamíferas, destacando-se 10% de proteínas relacionadas com a regulação da proliferação celular. Proteínas não caracterizadas foram encontradas em todas as amostras. Estas proteínas, devido a serem aparentemente muito abundantes nestas populações devem ser alvo de estudos futuros, que possibilitarão determinar o seu envolvimento em processos relevantes para a biologia de células estaminais. Ainda, algumas diferenças entre as proteínas identificadas envolvidas nos processos de proliferação e diferenciação de células estaminais deverão ser futuramente exploradas através de estudos funcionais que permitirão estabelecer um fenótipo característico de cada população destas células

Coup-TFII expression defines two different septum transversum cell compartments crucial to cardiac septation and compact ventricular wall growth

COUP-TFII encodes for an orphan nuclear receptor expressed by multiple embryonic tissues. COUP-TFII functions include the regulation of mesodermal progenitor differentiation and cell fate specification, and is required for completion of cardiovascular development as shown by the early death (E9.5) of COUP-TFII-null mice. In this study, we show that COUP-TFII, which is strongly expressed in the atrial myocardium, is also expressed in two different compartments of the septum transversum (ST, E9.5), a mesodermal folding adjacent to cardiac inflow myocardium. The first ST compartment is COUP-TFII+/Isl1+; cells in this compartment concentrate in the posterior part of the ST, overlap with SHF, and are continuous with the dorsal mesenchymal protrusion (DMP, also known as spina vestibuli). The second compartment is characteristically COUP-TFII+/Isl1-, and comprises the majority of proepicardial cells. To dissect the role of COUP-TFII+ ST cells in cardiac development, we conditionally deleted COUP-TFII in the ST using two different Cre constructs (Wt1Cre; G2-Gata4Cre). We show that COUP-TFII deletion in the ST is most severe in G2-Gata4Cre;COUP-TFII-/- mice, containing various cardiovascular progenitor lineages. Mutant mice display atrial septation and atrioventricular septal defects as well as a severe disruption of compact ventricular myocardial growth and coronary vascularization. We conclude that COUP-TFII plays critical, pleiotropic, tissue-dependent roles during cardiac septation, growth and vascularization.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC-ISCIII

Multiple linear and principal component regressions for modelling ecotoxicity bioassay response

The ecotoxicological response of the living organisms in an aquatic system depends on the physical, chemical and bacteriological variables, as well as the interactions between them. An important challenge to scientists is to understand the interaction and behaviour of factors involved in a multidimensional process such as the ecotoxicological response.With this aim, multiple linear regression (MLR) and principal component regression were applied to the ecotoxicity bioassay response of Chlorella vulgaris and Vibrio fischeri in water collected at seven sites of Leça river during five monitoring campaigns (February, May, June, August and September of 2006). The river water characterization included the analysis of 22 physicochemical and 3 microbiological parameters. The model that best fitted the data was MLR, which shows: (i) a negative correlation with dissolved organic carbon, zinc and manganese, and a positive one with turbidity and arsenic, regarding C. vulgaris toxic response; (ii) a negative correlation with conductivity and turbidity and a positive one with phosphorus, hardness, iron, mercury, arsenic and faecal coliforms, concerning V. fischeri toxic response. This integrated assessment may allow the evaluation of the effect of future pollution abatement measures over the water quality of Leça River

Necrose gordurosa subcutânea do recém-nascido: manifestações clínicas de dois casos

Subcutaneous fat necrosis of the newborn is an unusual form of panniculitis, with few cases described in medical literature. The disease affects newborns at term or post-term, with normal general health. We describe two cases of newborns affected by the disease. One of them already had lesions since birth. Also, we discuss the use of puncture for diagnostic assistance.A Necrose Gordurosa Subcutânea do Recém-Nascido é uma paniculite incomum com poucos casos descritos na literatura médica. A doença acomete recém-nascidos a termo ou pós-termo, com saúde geral normal. Relatamos dois casos de recém-nascidos acometidos pela doença. Um deles já apresentava lesões ao nascer. Também discutimos o uso da punção para auxílio diagnóstico.Federal University of São Paulo Paulista Medical SchoolFederal University of São Paulo Paulista Medical School dermatology departmentFederal University of São Paulo Paulista Medical School pathology departmentFederal University of São Paulo Paulista Medical School department of dermatologyUNIFESP, Paulista Medical SchoolUNIFESP, EPM, dermatology departmentUNIFESP, EPM, pathology departmentUNIFESP, EPM, department of dermatologySciEL

Satisfação com o atendimento e aconselhamento na compra de medicamentos não sujeitos a receita médica

A liberalização do mercado de medicamentos não sujeitos a receita médica(MNSRM), que constituem o principal componente de automedicação1,2, levou ao aumento do número de profissionais e de locais onde estes são vendidos 3. Sendo que a satisfação do cliente se tem vindo a tornar um ponto-chave na avaliação da qualidade e pertinência de um serviço4, o apuramento da satisfação do comprador nos diferentes locais de venda de medicamentos não sujeitos a receita médica apresenta-se como um bom meio de medida da qualidade do atendimento e aconselhamento em cada um deles.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Avaliação de Transtornos de Depressão e Ansiedade e Correlação com o Tratamento de Pacientes com Psoríase Vulgar

Introduction: Psoriasis is a chronic inflammatory multisystemic disease with several comorbidities, namely anxiety and depression disorders. Methods: In this study, the prevalence of these psychiatric entities was investigated by the PHQ-9 and GAD-7 questionnaries and related to the socio-demographic variables and to the forms of clinical treatment. Results: A total of 90 patients (56 females) were analyzed. Of these, 41 patients (45.56%) used topical treatment only, 28 patients (31.11%) used oral methotrexate and 21 patients (23.33%) used immunobiological agents (anti-TNF-alfa agents). It was observed that 47 patients (52.23%) presented some degree of depression (mild, moderate or severe) and 53 patients (58.89%) presented some degree of anxiety disorder (mild, moderate or severe). There was no statistical relationship between the anxiety and depression scores and the PASI score, as well as age, employability or schooling. There was a statistical association between psychiatric comorbidities and the female gender (p <0.0001). It was also observed a lower prevalence of depression (p = 0.0336) on patients using immunobiological treatments. Conclusion: The findings confirm published data, showing association of psychiatric conditions with psoriasis, especially in relation to TNF-alpha, so that anti-TNF therapies may become an alternative for the treatment of depression or anxiety disorders associated with psoriasis.Introdução: A psoríase é uma doença crónica inflamatória multissistêmica com diversas comorbidades, entre elas estão os transtornos de ansiedade e de depressão. Metodologia: Avaliar a prevalência de ansiedade e depressão, respectivamente pelos questionários GAD-7 and PHQ-9 em relação com variáveis socio-demográficas e formas de tratamento. Resultados: Foram avaliados 90 pacientes (56 do género feminino), 41 pacientes (45,56%) utilizavam apenas tratamento tópico, 28 pacientes (31,11%) utilizavam metotrexato via oral e 21 (23,33%) utilizavam imunobiológicos (agentes anti-TNF-alfa). Observou-se que 47 pacientes dos avaliados (52,23%) apresentaram algum grau de depressão (leve, moderado ou severo) e que 53 pacientes (58,89%) apresentaram algum grau de transtorno de ansiedade (leve, moderado ou severo). Não houve relação estatística significante entre o quadro de ansiedade e de depressão e o score PASI, assim como a faixa etária, a empregabilidade ou a escolaridade. Houve associação estatística entre o quadro psiquiátrico e o género feminino (p<0,0001) e menor prevalência de depressão (p=0,0336) com o uso de imunobiológicos. Conclusão: Os achados ratificam os achados encontrados na literatura, nos quais o quadro psiquiátrico possui também uma ampla associação com a fisiopatogenia inflamatória da psoríase, em especial em relação ao TNF-alfa, de modo que terapias anti-TNF possam vir a ser uma alternativa para o tratamento de depressão ou de transtornos de ansiedade associados à psoríase

Neuroendocrine tumor of the anal canal

AbstractWe report a rare case of neuroendocrine tumor of the anal canal and its poor prognosis, plus discuss the need of immunohistochemical for an acurate diagnosis and to guide treatment

SAÚDE COLETIVA EM MATO GROSSO: NOTAS SOBRE A REMASCO

O Instituto de Saúde Coletiva da Universidade Federal de Mato Grosso promove a formação em Saúde Coletiva, desde 1993, no âmbito da pós-graduação e, a partir de 2010, em nível de graduação, o que fomentou a criação da Semana Acadêmica de Saúde Coletiva, em 2011, e do Encontro Estadual de Saúde Coletiva (ENESCO MT), em 2017. Este trabalho tece algumas notas sobre a Reunião Científica dos Estudantes Matogrossenses de Saúde Coletiva (REMASCO), criada e realizada em 2020, enquanto atividade pré-evento do ENESCO e como um espaço de aglutinação e interlocução entre estudantes da área. Destarte, aponta para a potencialidade da ação que, assentada na extensão universitária e no aporte da promoção da saúde, instaura-se como espaço de divulgação de informação/conhecimento de/sobre saúde

In Vitro

The roots of Cochlospermum regium, popularly known as “algodãozinho-do-cerrado,” are used for the treatment of genitourinary infections. However, the removal of their subterranean structures results in the death of the plant, and the use of the leaves becomes a viable alternative. Therefore, the antimicrobial activity of Cochlospermum regium leaf’s ethanolic extract and its action on the biofilm formation of microorganisms associated with urinary infection were evaluated. The total phenolic compounds, flavoids, and tannins were quantified using the reagents Folin-Ciocalteu, aluminum chloride, and vanillin, respectively. The antimicrobial activity was evaluated by the broth microdilution method and the effect of the extract in the biofilm treatment was measured by the drop plate method. Cytotoxicity was evaluated by the method based on the reduction of MTS and the mutagenicity by the Ames test. The ethanolic extract of C. regium leaves presented 87.4 mg/EQ of flavonoids, 167.2 mg/EAG of total phenolic compounds, and 21.7 mg/ECA of condensed tannins. It presented reduction of the biofilm formation for E. coli and C. tropicalis and antimicrobial action of 1 mg/mL and 0.5 mg/mL, respectively. The extract showed no cytotoxicity and mutagenicity at the concentrations tested. This study demonstrated that C. regium leaves are a viable option for the treatment of genitourinary infections and for the species preservation

A atenção farmacêutica e a interprofissionalidade na saúde do idoso: uma revisão integrativa e sistemática

A atenção farmacêutica é a prática na qual o farmacêutico utiliza o ato profissional para orientar sobre o uso correto e seguro de medicamentos. Essa atuação pode ser otimizada mediante o trabalho interprofissional e práticas colaborativas para sustentar ações integradas e mais resolutivas. Tendo em vista que, a saúde do idoso ainda é considerada um complexo problema de saúde pública devido a vulnerabilidade à polifarmácia, objetivamos analisar as evidências na literatura sobre a atenção farmacêutica no contexto interprofissional e colaborativo para o acompanhamento farmacoterapêutico ao idoso. O estudo realizou a revisão sistemática integrativa qualitativa do tipo descritiva e exploratória. A análise foi constituída por 16 artigos, e analisando-os, pode-se afirmar que, há um número limitado de publicações que inserem o profissional farmacêutico na adesão dos idosos frente ao tratamento farmacológico e na prática colaborativa interprofissional. O estudo indica que as intervenções elucidam positivamente a relação da equipe de saúde com o idoso e, as possíveis contribuições do farmacêutico nesse processo estimulando a adotarem uma postura mais colaborativa para alcançar propósitos significativos na qualidade de vida dos idosos