Analyse einzelner disseminierter mammakarzinomzellen durch Suppression Subtraktive Hybridization: Identifizierung eines differentiell exprimierten ERV9-LTR Transkriptes

Das Auftreten einer Metastasierung ist von großer prognotischer Relevanz für Patienten mit einer Tumorerkrankung und hat einen bedeutenden Einfluß auf die Heilungsrate. Bisher gibt es keine Therapie, die die Ausbreitung der Krebserkrankung verhindern oder stoppen kann, unter anderem, weil der Prozess der Metastasierung noch weitgehend unklar ist. Deswegen ist es wichtig, die molekularen Mechanismen der Tumorzelldisseminierung zu verstehen: Gibt es bestimmte Gene, die in disseminierten Zellen unter- oder überexprimiert sind? Hat ihre differentielle Expression einen Einfluss auf die Disseminierung? An welchen Signalwegen sind die dazu gehörigen Proteine beteiligt? Um Antworten auf diese Fragestellungen zu erhalten, ist es von großem Interesse, disseminierte Tumorzellen direkt zu studieren. Die Detektion solcher Zellen ist allerdings schwierig, da die Zellen extrem selten sind und es an spezifischen Markern mangelt. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Marker für die Detektion epithelialer Zellen in mesenchymalem Gewebe zu finden. Dafür wurde die differentielle Genexpression zwischen vier metastatischen Zellen von Brustkrebspatienten (Tester) und Knochenmarkzellen gesunder Patienten (Driver) mit der Suppression Subtractive Hybridization (SSH) Methode analysiert. Da das Ausgangsmaterial aus global amplifizierter cDNA einzelner Zellen besondere Adaptersequenzen trägt, musste die SSH zuerst daran angepasst werden. Neun der gewonnenen Sequenzen zeigten eine differentielle Expression, die positiv im Tester und negativ im Driver war. Drei der identifizierten Sequenzen (BAF57, IGF1R und LPP) sind für ihre potentielle Beteiligung bei der Tumorentstehung bereits bekannt. Die Expression der neun Sequenzen wurde in elf Tumorzelllinien und Knochenmark geprüft. Drei Sequenzen sind nur in Zelllinien und nicht in Knochenmark nachzuweisen: IGF1R, BAF57 und eine Sequenz von uns #288 genannt, die keinem bereits bekannten Gen entspricht. Sie konnte als Fragment eines von ERV9 Long Terminal Repeat (LTR) gesteuerten Transkriptes identifiziert werden. LTRs von humanen endogenen Retroviren (HERV) enthalten Virale Promotoren, Enhancer und Polyadenylierungssignale und können die Genexpression regulieren. Es wurden bereits verschiedene zelluläre mRNA-Transkripte gefunden, die von ERV9 LTRs gesteuert werden. Die differentielle Expression der Sequenz #288 zwischen Karzinomzelllinien und Knochenmark deutet darauf hin, dass der ERV9 LTR für eine Gewebespezifizität verantwortlich zeichnen könnte. Da in Krebsgewebe auch eine höhere Transkriptionsaktivität für nicht kodierende Transkripte festgestellt wurde, stellt sich die Frage, ob die Sequenz #288 entweder einen neuen Tumormarker darstellen könnte oder an der Regulation anderer Gene beteiligt ist

Analyse einzelner disseminierter mammakarzinomzellen durch Suppression Subtraktive Hybridization: Identifizierung eines differentiell exprimierten ERV9-LTR Transkriptes

Das Auftreten einer Metastasierung ist von großer prognotischer Relevanz für Patienten mit einer Tumorerkrankung und hat einen bedeutenden Einfluß auf die Heilungsrate. Bisher gibt es keine Therapie, die die Ausbreitung der Krebserkrankung verhindern oder stoppen kann, unter anderem, weil der Prozess der Metastasierung noch weitgehend unklar ist. Deswegen ist es wichtig, die molekularen Mechanismen der Tumorzelldisseminierung zu verstehen: Gibt es bestimmte Gene, die in disseminierten Zellen unter- oder überexprimiert sind? Hat ihre differentielle Expression einen Einfluss auf die Disseminierung? An welchen Signalwegen sind die dazu gehörigen Proteine beteiligt? Um Antworten auf diese Fragestellungen zu erhalten, ist es von großem Interesse, disseminierte Tumorzellen direkt zu studieren. Die Detektion solcher Zellen ist allerdings schwierig, da die Zellen extrem selten sind und es an spezifischen Markern mangelt. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Marker für die Detektion epithelialer Zellen in mesenchymalem Gewebe zu finden. Dafür wurde die differentielle Genexpression zwischen vier metastatischen Zellen von Brustkrebspatienten (Tester) und Knochenmarkzellen gesunder Patienten (Driver) mit der Suppression Subtractive Hybridization (SSH) Methode analysiert. Da das Ausgangsmaterial aus global amplifizierter cDNA einzelner Zellen besondere Adaptersequenzen trägt, musste die SSH zuerst daran angepasst werden. Neun der gewonnenen Sequenzen zeigten eine differentielle Expression, die positiv im Tester und negativ im Driver war. Drei der identifizierten Sequenzen (BAF57, IGF1R und LPP) sind für ihre potentielle Beteiligung bei der Tumorentstehung bereits bekannt. Die Expression der neun Sequenzen wurde in elf Tumorzelllinien und Knochenmark geprüft. Drei Sequenzen sind nur in Zelllinien und nicht in Knochenmark nachzuweisen: IGF1R, BAF57 und eine Sequenz von uns #288 genannt, die keinem bereits bekannten Gen entspricht. Sie konnte als Fragment eines von ERV9 Long Terminal Repeat (LTR) gesteuerten Transkriptes identifiziert werden. LTRs von humanen endogenen Retroviren (HERV) enthalten Virale Promotoren, Enhancer und Polyadenylierungssignale und können die Genexpression regulieren. Es wurden bereits verschiedene zelluläre mRNA-Transkripte gefunden, die von ERV9 LTRs gesteuert werden. Die differentielle Expression der Sequenz #288 zwischen Karzinomzelllinien und Knochenmark deutet darauf hin, dass der ERV9 LTR für eine Gewebespezifizität verantwortlich zeichnen könnte. Da in Krebsgewebe auch eine höhere Transkriptionsaktivität für nicht kodierende Transkripte festgestellt wurde, stellt sich die Frage, ob die Sequenz #288 entweder einen neuen Tumormarker darstellen könnte oder an der Regulation anderer Gene beteiligt ist

Nosocomial outbreak of neonatal Salmonella enterica serotype Enteritidis meningitis in a rural hospital in northern Tanzania

BACKGROUND: Clinicians at Haydom Lutheran Hospital, a rural hospital in northern Tanzania noted an unusually high case-fatality rate of pediatric meningitis and suspected an outbreak of an unknown agent or an organism resistant to the empirical therapy. METHODS: We established a provisional microbiology laboratory to investigate the suspected outbreak. Blood and spinal fluid specimens were taken from children below the age of seven years with suspected meningitis. The blood and spinal fluid specimens were inoculated in commercial blood culture bottles and locally prepared Thayer-Martin medium in slanted tubes, respectively. The bacterial isolates were sent to Norway for further investigation, including susceptibility testing and pulsed-field gel-electrophoresis (PFGE). RESULTS: Among 24 children with suspected meningitis and/or septicemia, five neonates had meningitis caused by Salmonella enterica serotype Enteritidis, all of whom died. Two children had S. Enteritidis septicemia without meningitis and both survived. Genotyping with PFGE suggested a clonal outbreak. The salmonella strain was resistant to ampicillin and sensitive to gentamicin, the two drugs commonly used to treat neonatal meningitis at the hospital. CONCLUSION: The investigation reminds us that nontyphoidal salmonellae can cause meningitis associated with very high case-fatality rates. Resistance to multiple antimicrobial agents increases the risk of treatment failure and may have contributed to the fatal outcome in all of the five patients with salmonella meningitis. The investigation indicated that the outbreak was nosocomial and the outbreak subsided after hygienic measures were instituted. Establishing a provisional microbiological laboratory is a valuable and affordable tool to investigate and control outbreaks even in remote rural areas

Molecular epidemiology of multidrug-resistant Shigella dysenteriae type 1 causing dysentery outbreaks in Central African Republic, 2003-2004.

Shigella dysenteriae type 1 (Sd1) represents a particular threat in developing countries because of the severity of the infection and its epidemic potential. Antimicrobial susceptibility testing and molecular subtyping by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and plasmid profiling (PP) of Sd1 isolates collected during two dysentery outbreaks (2013 and 445 cases of bloody diarrhoea) in Central African Republic (CAR) during the period 2003-2004 were reported. Eleven Sd1 comparison strains (CS) acquired by travellers or residents of Africa (n=10) or Asia (n=1) between 1993 and 2003 were also analysed. The 19 Sd1 isolates recovered from CAR outbreaks were multidrug resistant, although susceptible to quinolones and fluoroquinolones. Molecular subtyping by PFGE was more discriminatory than PP. The PFGE using XbaI and NotI restriction enzymes indicated that the two outbreaks were due to two different clones and also revealed a genetic diversity among the CS recovered from outbreak or sporadic cases between 1993 and 2003. This study was the result of a fruitful collaboration between field physicians and microbiologists. The data collected will serve as the basis for establishing long-term monitoring of Sd1 in CAR

Positive and negative viral associations in patients with acute respiratory tract infections in primary care: the ECOVIR study

IntroductionAcute respiratory infections (ARIs) are the most common viral infections encountered in primary care settings. The identification of causal viruses is still not available in routine practice. Although new strategies of prevention are being identified, knowledge of the relationships between respiratory viruses remains limited.Materials and methodsECOVIR was a multicentric prospective study in primary care, which took place during two pre-pandemic seasons (2018–2019 and 2019–2020). Patients presenting to their General practitioner (GP) with ARIs were included, without selecting for age or clinical conditions. Viruses were detected on nasal swab samples using a multiplex Polymerase Chain Reaction test focused on 17 viruses [Respiratory Syncytial Virus-A (RSV-A), RSV-B, Rhinovirus/Enterovirus (HRV), human Metapneumovirus (hMPV), Adenovirus (ADV), Coronaviruses (CoV) HKU1, NL63, 229E, OC43, Influenza virus (H1 and H3 subtypes), Influenza virus B, Para-Influenza viruses (PIVs) 1–4, and Bocavirus (BoV)].ResultsAmong the 668 analyzed samples, 66% were positive for at least one virus, of which 7.9% were viral codetections. The viral detection was negatively associated with the age of patients. BoV, ADV, and HRV occurred more significantly in younger patients than the other viruses (p < 0.05). Codetections were significantly associated with RSV, HRV, BoV, hMPV, and ADV and not associated with influenza viruses, CoV, and PIVs. HRV and influenza viruses were negatively associated with all the viruses. Conversely, a positive association was found between ADV and BoV and between PIVs and BoV.ConclusionOur study provides additional information on the relationships between respiratory viruses, which remains limited in primary care

Etude des codétections virales dans les prélèvements respiratoires : apport de la quantification virale normalisée pour la compréhension des infections respiratoires virales multiples.

Acute respiratory infections are the most abundant infections in the general population. They are mainly due to respiratory viruses, which infect patients in epidemic ways, generating a variety of pathologies that vary according to the age of the patient. Recent molecular techniques can provide precise qualitative virological diagnosis, which is still only available in hospitals. Detection of several viruses in respiratory samples, or viral co-detection, is frequent, and the question of significance and clinical interpretation arises when vaccines and specific antivirals are being developed and will be soon available.We used samples from two patient cohorts with very different profiles to develop quantitative PCR techniques for RSV (respiratory syncitial virus) and HRV (human rhinovirus), the two viruses most frequently found in viral codetections.Using the "Guérande" hospital cohort (n=719) of infants hospitalized for acute bronchiolitis, we found a very high rate of viral codetection (over 50%), with over 90% presence of RSV in respiratory samples, and a RSV/HRV co-infection rate of almost a third. The risk of being infected with HRV was higher in the absence of RSV, suggesting interferences or exclusion mechanisms between these two viruses.The "ECOVIR" cohort, conducted in primary care, included 685 patients of all ages presenting to their general practitioner's office. Respiratory samples were positive for at least one virus in 67% of cases, and 8% were positive for at least two viruses. Viral codetections were associated with RSV and HRV, but also with bocavirus and metapneumovirus. We analyzed the associations between the different respiratory viruses, and found that HRV was negatively associated with all viruses except adenovirus and bocavirus.In the final part of this thesis, we analyzed the respiratory viral loads of RSV and HRV in samples from both cohorts, and sequenced rhinoviruses in positive samples in Multiplex PCR. We found that the risk of viral co-detection was higher in hospitalized versus ambulatory patients. We also found a positive correlation between HRV and RSV respiratory viral loads and cell abundance, reflecting the lytic activity of the viruses. We found higher respiratory viral loads in infants and the elderly, explaining the greater clinical impact of these viruses in these fragile populations. Finally, we demonstrated a lower HRV viral load in cases of co-infection with RSV, further confirming a negative interference between these two viruses, to the detriment of HRV.Many parameters therefore influence the natural history of respiratory viral infections, and quantifying respiratory viral loads can go a long way towards explaining this. This thesis work has begun to provide some answers; future projects involving the monitoring of respiratory viral loads for each patient during the course of an infection, or the respiratory inflammatory environment during these coinfections, could provide further support for our research.Les infections respiratoires aiguës sont les infections les plus abondantes dans la population générale. Elles sont majoritairement dues à des virus respiratoires, qui infectent les patients de façon épidémique, engendrant des pathologies variées et différentes selon l’âge des patients. Les techniques moléculaires récentes permettent un diagnostic virologique qualitatif précis, accessible encore uniquement en milieu hospitalier. La détection de plusieurs virus dans les prélèvements respiratoires, ou codétection virale, est fréquente, et la question de la significativité et de l’interprétation clinique se pose, à l’heure où les vaccins et les antiviraux spécifiques se développent et vont être très prochainement accessibles.Nous avons utilisé les prélèvements issus de deux cohortes de patients, aux profils très différents, pour mettre au point des techniques de PCR quantitatives du VRS (virus respiratoire syncitial) et de l’HRV (rhinovirus humain), ces deux virus étant les plus fréquemment retrouvés dans les codétections virales.Grâce à la cohorte hospitalière « Guérande » (n=719), de nourrissons hospitalisés pour bronchiolite aiguë, nous avons retrouvé un taux de codétection virale très important (plus de 50%), avec une présence de plus de 90% du VRS dans les échantillons respiratoires, et un taux de coinfections VRS/HRV de près d’un tiers. Le risque d’être infecté par le HRV était plus élevé en l’absence de VRS, suggérant des interférences ou des mécanismes d’exclusion entre ces deux virus.La cohorte « ECOVIR », réalisée en soins primaires, a permis d’inclure 685 patients de tous âges se présentant au cabinet de leur médecin généraliste. Les prélèvements respiratoires étaient pour 67% d’entre eux positifs à au moins un virus, et 8% étaient positifs à au moins deux virus. Les codétections virales étaient associées au VRS, à l’HRV mais également au bocavirus et au metapneumovirus. Nous avons analysé les associations entre les différents virus respiratoires, et avons retrouvé que l’HRV était associé négativement à tous les virus, à l’exception de l’adénovirus et du bocavirus.Dans la dernière partie de ce travail de thèse, nous avons analysé les charges virales respiratoires du VRS et de l’HRV dans les prélèvements issus des deux cohortes, et séquencé les rhinovirus des prélèvements positifs en PCR Multiplex. Nous avons trouvé que le risque de codétection virale était plus important chez les patients hospitalisés versus les patients ambulatoires. Nous avons également retrouvé une corrélation positive entre les charges virales respiratoires de l’HRV et du VRS et l’abondance cellulaire, reflet de l’activité lytique des virus. Nous avons retrouvé des charges virales respiratoires plus élevées chez les nourrissons et les personnes âgées, expliquant l’impact clinique plus important de ces virus dans ces populations fragiles. Nous avons enfin mis en évidence une charge virale HRV plus faible en cas de coinfection avec le VRS, confirmant encore une interférence négative entre ces deux virus, au détriment de l’HRV.De nombreux paramètres influencent donc l'histoire naturelle des infections virales respiratoires, et la quantification des charges virales respiratoires peut grandement l'expliquer. Ce travail de thèse a permis de commencer à apporter des réponses ; de futurs projets portant sur le suivi des charges virales respiratoires pour chaque patient au cours d’une infection, ou encore sur l’environnement inflammatoire respiratoire lors de ces coinfections pourraient permettre d’étayer nos recherches

Etude des codétections virales dans les prélèvements respiratoires : apport de la quantification virale normalisée pour la compréhension des infections respiratoires virales multiples.

Acute respiratory infections are the most abundant infections in the general population. They are mainly due to respiratory viruses, which infect patients in epidemic ways, generating a variety of pathologies that vary according to the age of the patient. Recent molecular techniques can provide precise qualitative virological diagnosis, which is still only available in hospitals. Detection of several viruses in respiratory samples, or viral co-detection, is frequent, and the question of significance and clinical interpretation arises when vaccines and specific antivirals are being developed and will be soon available.We used samples from two patient cohorts with very different profiles to develop quantitative PCR techniques for RSV (respiratory syncitial virus) and HRV (human rhinovirus), the two viruses most frequently found in viral codetections.Using the "Guérande" hospital cohort (n=719) of infants hospitalized for acute bronchiolitis, we found a very high rate of viral codetection (over 50%), with over 90% presence of RSV in respiratory samples, and a RSV/HRV co-infection rate of almost a third. The risk of being infected with HRV was higher in the absence of RSV, suggesting interferences or exclusion mechanisms between these two viruses.The "ECOVIR" cohort, conducted in primary care, included 685 patients of all ages presenting to their general practitioner's office. Respiratory samples were positive for at least one virus in 67% of cases, and 8% were positive for at least two viruses. Viral codetections were associated with RSV and HRV, but also with bocavirus and metapneumovirus. We analyzed the associations between the different respiratory viruses, and found that HRV was negatively associated with all viruses except adenovirus and bocavirus.In the final part of this thesis, we analyzed the respiratory viral loads of RSV and HRV in samples from both cohorts, and sequenced rhinoviruses in positive samples in Multiplex PCR. We found that the risk of viral co-detection was higher in hospitalized versus ambulatory patients. We also found a positive correlation between HRV and RSV respiratory viral loads and cell abundance, reflecting the lytic activity of the viruses. We found higher respiratory viral loads in infants and the elderly, explaining the greater clinical impact of these viruses in these fragile populations. Finally, we demonstrated a lower HRV viral load in cases of co-infection with RSV, further confirming a negative interference between these two viruses, to the detriment of HRV.Many parameters therefore influence the natural history of respiratory viral infections, and quantifying respiratory viral loads can go a long way towards explaining this. This thesis work has begun to provide some answers; future projects involving the monitoring of respiratory viral loads for each patient during the course of an infection, or the respiratory inflammatory environment during these coinfections, could provide further support for our research.Les infections respiratoires aiguës sont les infections les plus abondantes dans la population générale. Elles sont majoritairement dues à des virus respiratoires, qui infectent les patients de façon épidémique, engendrant des pathologies variées et différentes selon l’âge des patients. Les techniques moléculaires récentes permettent un diagnostic virologique qualitatif précis, accessible encore uniquement en milieu hospitalier. La détection de plusieurs virus dans les prélèvements respiratoires, ou codétection virale, est fréquente, et la question de la significativité et de l’interprétation clinique se pose, à l’heure où les vaccins et les antiviraux spécifiques se développent et vont être très prochainement accessibles.Nous avons utilisé les prélèvements issus de deux cohortes de patients, aux profils très différents, pour mettre au point des techniques de PCR quantitatives du VRS (virus respiratoire syncitial) et de l’HRV (rhinovirus humain), ces deux virus étant les plus fréquemment retrouvés dans les codétections virales.Grâce à la cohorte hospitalière « Guérande » (n=719), de nourrissons hospitalisés pour bronchiolite aiguë, nous avons retrouvé un taux de codétection virale très important (plus de 50%), avec une présence de plus de 90% du VRS dans les échantillons respiratoires, et un taux de coinfections VRS/HRV de près d’un tiers. Le risque d’être infecté par le HRV était plus élevé en l’absence de VRS, suggérant des interférences ou des mécanismes d’exclusion entre ces deux virus.La cohorte « ECOVIR », réalisée en soins primaires, a permis d’inclure 685 patients de tous âges se présentant au cabinet de leur médecin généraliste. Les prélèvements respiratoires étaient pour 67% d’entre eux positifs à au moins un virus, et 8% étaient positifs à au moins deux virus. Les codétections virales étaient associées au VRS, à l’HRV mais également au bocavirus et au metapneumovirus. Nous avons analysé les associations entre les différents virus respiratoires, et avons retrouvé que l’HRV était associé négativement à tous les virus, à l’exception de l’adénovirus et du bocavirus.Dans la dernière partie de ce travail de thèse, nous avons analysé les charges virales respiratoires du VRS et de l’HRV dans les prélèvements issus des deux cohortes, et séquencé les rhinovirus des prélèvements positifs en PCR Multiplex. Nous avons trouvé que le risque de codétection virale était plus important chez les patients hospitalisés versus les patients ambulatoires. Nous avons également retrouvé une corrélation positive entre les charges virales respiratoires de l’HRV et du VRS et l’abondance cellulaire, reflet de l’activité lytique des virus. Nous avons retrouvé des charges virales respiratoires plus élevées chez les nourrissons et les personnes âgées, expliquant l’impact clinique plus important de ces virus dans ces populations fragiles. Nous avons enfin mis en évidence une charge virale HRV plus faible en cas de coinfection avec le VRS, confirmant encore une interférence négative entre ces deux virus, au détriment de l’HRV.De nombreux paramètres influencent donc l'histoire naturelle des infections virales respiratoires, et la quantification des charges virales respiratoires peut grandement l'expliquer. Ce travail de thèse a permis de commencer à apporter des réponses ; de futurs projets portant sur le suivi des charges virales respiratoires pour chaque patient au cours d’une infection, ou encore sur l’environnement inflammatoire respiratoire lors de ces coinfections pourraient permettre d’étayer nos recherches

Study of viral cοdetectiοns in respiratory specimens : nοrmalized viral loads quantitatiοn to understand multiple viral respiratory infectiοns.

Les infections respiratoires aiguës sont les infections les plus abondantes dans la population générale. Elles sont majoritairement dues à des virus respiratoires, qui infectent les patients de façon épidémique, engendrant des pathologies variées et différentes selon l’âge des patients. Les techniques moléculaires récentes permettent un diagnostic virologique qualitatif précis, accessible encore uniquement en milieu hospitalier. La détection de plusieurs virus dans les prélèvements respiratoires, ou codétection virale, est fréquente, et la question de la significativité et de l’interprétation clinique se pose, à l’heure où les vaccins et les antiviraux spécifiques se développent et vont être très prochainement accessibles.Nous avons utilisé les prélèvements issus de deux cohortes de patients, aux profils très différents, pour mettre au point des techniques de PCR quantitatives du VRS (virus respiratoire syncitial) et de l’HRV (rhinovirus humain), ces deux virus étant les plus fréquemment retrouvés dans les codétections virales.Grâce à la cohorte hospitalière « Guérande » (n=719), de nourrissons hospitalisés pour bronchiolite aiguë, nous avons retrouvé un taux de codétection virale très important (plus de 50%), avec une présence de plus de 90% du VRS dans les échantillons respiratoires, et un taux de coinfections VRS/HRV de près d’un tiers. Le risque d’être infecté par le HRV était plus élevé en l’absence de VRS, suggérant des interférences ou des mécanismes d’exclusion entre ces deux virus.La cohorte « ECOVIR », réalisée en soins primaires, a permis d’inclure 685 patients de tous âges se présentant au cabinet de leur médecin généraliste. Les prélèvements respiratoires étaient pour 67% d’entre eux positifs à au moins un virus, et 8% étaient positifs à au moins deux virus. Les codétections virales étaient associées au VRS, à l’HRV mais également au bocavirus et au metapneumovirus. Nous avons analysé les associations entre les différents virus respiratoires, et avons retrouvé que l’HRV était associé négativement à tous les virus, à l’exception de l’adénovirus et du bocavirus.Dans la dernière partie de ce travail de thèse, nous avons analysé les charges virales respiratoires du VRS et de l’HRV dans les prélèvements issus des deux cohortes, et séquencé les rhinovirus des prélèvements positifs en PCR Multiplex. Nous avons trouvé que le risque de codétection virale était plus important chez les patients hospitalisés versus les patients ambulatoires. Nous avons également retrouvé une corrélation positive entre les charges virales respiratoires de l’HRV et du VRS et l’abondance cellulaire, reflet de l’activité lytique des virus. Nous avons retrouvé des charges virales respiratoires plus élevées chez les nourrissons et les personnes âgées, expliquant l’impact clinique plus important de ces virus dans ces populations fragiles. Nous avons enfin mis en évidence une charge virale HRV plus faible en cas de coinfection avec le VRS, confirmant encore une interférence négative entre ces deux virus, au détriment de l’HRV.De nombreux paramètres influencent donc l'histoire naturelle des infections virales respiratoires, et la quantification des charges virales respiratoires peut grandement l'expliquer. Ce travail de thèse a permis de commencer à apporter des réponses ; de futurs projets portant sur le suivi des charges virales respiratoires pour chaque patient au cours d’une infection, ou encore sur l’environnement inflammatoire respiratoire lors de ces coinfections pourraient permettre d’étayer nos recherches.Acute respiratory infections are the most abundant infections in the general population. They are mainly due to respiratory viruses, which infect patients in epidemic ways, generating a variety of pathologies that vary according to the age of the patient. Recent molecular techniques can provide precise qualitative virological diagnosis, which is still only available in hospitals. Detection of several viruses in respiratory samples, or viral co-detection, is frequent, and the question of significance and clinical interpretation arises when vaccines and specific antivirals are being developed and will be soon available.We used samples from two patient cohorts with very different profiles to develop quantitative PCR techniques for RSV (respiratory syncitial virus) and HRV (human rhinovirus), the two viruses most frequently found in viral codetections.Using the "Guérande" hospital cohort (n=719) of infants hospitalized for acute bronchiolitis, we found a very high rate of viral codetection (over 50%), with over 90% presence of RSV in respiratory samples, and a RSV/HRV co-infection rate of almost a third. The risk of being infected with HRV was higher in the absence of RSV, suggesting interferences or exclusion mechanisms between these two viruses.The "ECOVIR" cohort, conducted in primary care, included 685 patients of all ages presenting to their general practitioner's office. Respiratory samples were positive for at least one virus in 67% of cases, and 8% were positive for at least two viruses. Viral codetections were associated with RSV and HRV, but also with bocavirus and metapneumovirus. We analyzed the associations between the different respiratory viruses, and found that HRV was negatively associated with all viruses except adenovirus and bocavirus.In the final part of this thesis, we analyzed the respiratory viral loads of RSV and HRV in samples from both cohorts, and sequenced rhinoviruses in positive samples in Multiplex PCR. We found that the risk of viral co-detection was higher in hospitalized versus ambulatory patients. We also found a positive correlation between HRV and RSV respiratory viral loads and cell abundance, reflecting the lytic activity of the viruses. We found higher respiratory viral loads in infants and the elderly, explaining the greater clinical impact of these viruses in these fragile populations. Finally, we demonstrated a lower HRV viral load in cases of co-infection with RSV, further confirming a negative interference between these two viruses, to the detriment of HRV.Many parameters therefore influence the natural history of respiratory viral infections, and quantifying respiratory viral loads can go a long way towards explaining this. This thesis work has begun to provide some answers; future projects involving the monitoring of respiratory viral loads for each patient during the course of an infection, or the respiratory inflammatory environment during these coinfections, could provide further support for our research

Devenir respiratoire de l'asthme du nourrisson. Résultats d'une cohorte de suivi à 3 ans

L’asthme du nourrisson, enjeu de santé publique face à sa grande fréquence et sa morbidité, a une définition clinique. Lorsque la maladie est sévère, et non contrôlée, malgré un traitement optimal, des examens complémentaires sont réalisés afin d’éliminer un diagnostic différentiel, et de guider l’attitude thérapeutique. Dans ce contexte, nous avons cherché à évaluer le niveau de contrôle de l’asthme à 3 ans chez des nourrissons présentant un asthme du nourrisson sévère, non contrôlé, admis en hôpital de jour pour bilan, et identifier les facteurs de non-contrôle de cet asthme à 3 ans de l’inclusion. Patients et méthodes : Nous avons réalisé une étude rétrospective unicentrique au sein du CHU de Rouen. Chaque patient était admis en hôpital de jour pédiatrique pour réalisation d’une fibroscopie bronchique dans le cadre d’un asthme du nourrisson sévère non contrôlé. Nous avons recueilli les résultats des bilans clinique, biologique et radiologique réalisés lors de l’hospitalisation de jour, puis les données du suivi ambulatoire à 1, 2 et 3 ans (t+1, t+2, t+3), afin d’étudier l’évolution de cet asthme, et d’identifier des facteurs de non-contrôle de celui-ci. Résultats : Nous avons inclus 135 patients, et 63 patients avaient toujours un suivi spécialisé dans notre centre à 3 ans. La médiane d’âge à l’inclusion était de 12 mois. 32% des patients suivis présentaient encore un asthme sévère non contrôlé à t+3. Il existe une diminution significative des traitements de fond à t+3 (pDiscussion : Notre étude est unique quant à sa population très jeune, présentant un asthme très sévère (80% d’enfants inclus avec antécédents d’hospitalisation, 8% en réanimation), et étudiant les facteurs de non-contrôle à 3 ans. Notre approche par la thérapeutique est également originale, permettant d’étudier l’évolution de la « pression thérapeutique » dans les premières années de cette maladie fréquente dont la physiopathologie reste encore peu connue. Conclusion : Nous avons montré des facteurs de persistance de non-contrôle d’asthme du nourrisson sévère : tabagisme passif, sexe féminin, première bronchiolite à un très jeune âge et IgE totales augmentées

Etude des codétections virales dans les prélèvements respiratoires : apport de la quantification virale normalisée pour la compréhension des infections respiratoires virales multiples.

Acute respiratory infections are the most abundant infections in the general population. They are mainly due to respiratory viruses, which infect patients in epidemic ways, generating a variety of pathologies that vary according to the age of the patient. Recent molecular techniques can provide precise qualitative virological diagnosis, which is still only available in hospitals. Detection of several viruses in respiratory samples, or viral co-detection, is frequent, and the question of significance and clinical interpretation arises when vaccines and specific antivirals are being developed and will be soon available.We used samples from two patient cohorts with very different profiles to develop quantitative PCR techniques for RSV (respiratory syncitial virus) and HRV (human rhinovirus), the two viruses most frequently found in viral codetections.Using the "Guérande" hospital cohort (n=719) of infants hospitalized for acute bronchiolitis, we found a very high rate of viral codetection (over 50%), with over 90% presence of RSV in respiratory samples, and a RSV/HRV co-infection rate of almost a third. The risk of being infected with HRV was higher in the absence of RSV, suggesting interferences or exclusion mechanisms between these two viruses.The "ECOVIR" cohort, conducted in primary care, included 685 patients of all ages presenting to their general practitioner's office. Respiratory samples were positive for at least one virus in 67% of cases, and 8% were positive for at least two viruses. Viral codetections were associated with RSV and HRV, but also with bocavirus and metapneumovirus. We analyzed the associations between the different respiratory viruses, and found that HRV was negatively associated with all viruses except adenovirus and bocavirus.In the final part of this thesis, we analyzed the respiratory viral loads of RSV and HRV in samples from both cohorts, and sequenced rhinoviruses in positive samples in Multiplex PCR. We found that the risk of viral co-detection was higher in hospitalized versus ambulatory patients. We also found a positive correlation between HRV and RSV respiratory viral loads and cell abundance, reflecting the lytic activity of the viruses. We found higher respiratory viral loads in infants and the elderly, explaining the greater clinical impact of these viruses in these fragile populations. Finally, we demonstrated a lower HRV viral load in cases of co-infection with RSV, further confirming a negative interference between these two viruses, to the detriment of HRV.Many parameters therefore influence the natural history of respiratory viral infections, and quantifying respiratory viral loads can go a long way towards explaining this. This thesis work has begun to provide some answers; future projects involving the monitoring of respiratory viral loads for each patient during the course of an infection, or the respiratory inflammatory environment during these coinfections, could provide further support for our research.Les infections respiratoires aiguës sont les infections les plus abondantes dans la population générale. Elles sont majoritairement dues à des virus respiratoires, qui infectent les patients de façon épidémique, engendrant des pathologies variées et différentes selon l’âge des patients. Les techniques moléculaires récentes permettent un diagnostic virologique qualitatif précis, accessible encore uniquement en milieu hospitalier. La détection de plusieurs virus dans les prélèvements respiratoires, ou codétection virale, est fréquente, et la question de la significativité et de l’interprétation clinique se pose, à l’heure où les vaccins et les antiviraux spécifiques se développent et vont être très prochainement accessibles.Nous avons utilisé les prélèvements issus de deux cohortes de patients, aux profils très différents, pour mettre au point des techniques de PCR quantitatives du VRS (virus respiratoire syncitial) et de l’HRV (rhinovirus humain), ces deux virus étant les plus fréquemment retrouvés dans les codétections virales.Grâce à la cohorte hospitalière « Guérande » (n=719), de nourrissons hospitalisés pour bronchiolite aiguë, nous avons retrouvé un taux de codétection virale très important (plus de 50%), avec une présence de plus de 90% du VRS dans les échantillons respiratoires, et un taux de coinfections VRS/HRV de près d’un tiers. Le risque d’être infecté par le HRV était plus élevé en l’absence de VRS, suggérant des interférences ou des mécanismes d’exclusion entre ces deux virus.La cohorte « ECOVIR », réalisée en soins primaires, a permis d’inclure 685 patients de tous âges se présentant au cabinet de leur médecin généraliste. Les prélèvements respiratoires étaient pour 67% d’entre eux positifs à au moins un virus, et 8% étaient positifs à au moins deux virus. Les codétections virales étaient associées au VRS, à l’HRV mais également au bocavirus et au metapneumovirus. Nous avons analysé les associations entre les différents virus respiratoires, et avons retrouvé que l’HRV était associé négativement à tous les virus, à l’exception de l’adénovirus et du bocavirus.Dans la dernière partie de ce travail de thèse, nous avons analysé les charges virales respiratoires du VRS et de l’HRV dans les prélèvements issus des deux cohortes, et séquencé les rhinovirus des prélèvements positifs en PCR Multiplex. Nous avons trouvé que le risque de codétection virale était plus important chez les patients hospitalisés versus les patients ambulatoires. Nous avons également retrouvé une corrélation positive entre les charges virales respiratoires de l’HRV et du VRS et l’abondance cellulaire, reflet de l’activité lytique des virus. Nous avons retrouvé des charges virales respiratoires plus élevées chez les nourrissons et les personnes âgées, expliquant l’impact clinique plus important de ces virus dans ces populations fragiles. Nous avons enfin mis en évidence une charge virale HRV plus faible en cas de coinfection avec le VRS, confirmant encore une interférence négative entre ces deux virus, au détriment de l’HRV.De nombreux paramètres influencent donc l'histoire naturelle des infections virales respiratoires, et la quantification des charges virales respiratoires peut grandement l'expliquer. Ce travail de thèse a permis de commencer à apporter des réponses ; de futurs projets portant sur le suivi des charges virales respiratoires pour chaque patient au cours d’une infection, ou encore sur l’environnement inflammatoire respiratoire lors de ces coinfections pourraient permettre d’étayer nos recherches