HPLC põhine regulaatornukleotiidide (p)ppGpp ja ppApp tasemete analüüs bakterirakus

Väitekirja elektrooniline versioon ei sisalda publikatsiooneBakteritel on evolutsiooni käigus välja kujunenud arvukalt kohanemismehhanisme, mis aitavad neil ellu jääda ka karmides keskkonnatingimustes. Keerukad molekulaarsed võrgustikud kontrollivad adaptiivseid füsioloogilisi vastuseid, näiteks antibiootikumiresistentsust, biokile moodustumist ja bakterite minekut uinunud olekusse.  Sellised kohanemismehhanismid sõltuvad stressi tajuvate ja sellele reageerivate valkude ensümaatilistest aktiivsustest. Üheks oluliseks komponendiks stressivastuses on signaalmolekulide süntees ja lagundamine. Käesolevas töös uuriti ühte kõige laiemalt levinud adaptiivset mehhanismi, mida nimetatakse poomisvastuseks. Selle mehhanismi puhul on võtmetähtsusega RelA / SpoT homoloogsed (RSH) ensüümid, mis sünteesivad ja lagundavad alarmoon-nukleotiide ppGpp ja ppp(G)pp. Nende nukleotiidide ühiseks nimetamiseks kasutatakse tähistust (p)ppGpp. Need molekulid mõjutavad mitmeid protsesse bakterirakus, näiteks virulentsust ja antibiootikumitolerantsust. Käesoleva töö eesmärgiks oli välja töötada metoodika nukleotiidide, sealhulgas (p)ppGpp, tasemete kvantifitseerimiseks. Rakendades seda metoodikat uuriti nukleotiidide taset bakterite kasvul ning antibiootikumitöötluse käigus.   Nukleotiidide, sealhulgas (p)ppGpp taseme kvantifitseerimiseks töötati välja HPLC-l põhinev meetod. Nukleotiidide kvantifitseerimise meetodid sisaldavad kolme etappi: proovi kogumine, nukleotiidide ekstraheerimine ja kvantifitseerimine. Kogumisetapis filtreeriti bakterikultuur ja nukleotiidide ekstraheerimiseks viidi filter äädikhappesse. (p)ppGpp kvantifitseerimiseks rakendati HPLC metoodikat 5 µm 4,6 x 150 mm tugeval anioonvahetuskolonnil. Teiste nukleotiidide tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks kasutati ioon-paar pöördfaasi (IPRP) kromatograafiat Kinetex C18 2,6 µm 4,6 x 150 mm kolonnil. Kasutades väljatöötatud metoodikaid uuriti nukleotiidide tasemete muutust bakterite stressivastuse korral. Soolekepikesel (Escherichia coli) analüüsiti nukleotiidide tasemeid kasvukõvera erinevates faasides ja aminohapete nälja puhul. Aminohapete nälja puhul täheldati kiiret (p)ppGpp taseme tõusu. Translatsiooni inhibeerivate antibiootikumide (tiostreptooni, klooramfenikooli ja tetratsükliini) mõju (p)ppGpp ja teiste nukleotiidide tasemetele bakterirakus uuriti nii Gram-negatiivsetes kui ka Gram-positiivsetes bakterites, esindajateks vastavalt E.coli ja  Bacillus subtilis. (p)ppGpp kuhjumise indutseerimiseks kasutati eeltöötlust muprirotsiiniga. Seejärel lisati uuritav antibiootikum subinhibeerivas kontsentratsioonis. Mõlema bakteriliigi korral pidurdasid kõik testitud translatsiooni inhibiitorid (p)ppGpp kuhjumist. Meie uurimisrühma bioinformaatiline analüüs tuvastas, et mõnedes bakteriliikides on RSH ensüümid, millel on ainult (p)ppGpp sünteesi eest vastutav osa. Leiti, et selline ensüüm bakteris Cellulomonas marina  võib fosforüleerida ka adenosiini, tekitades  molekuli ppApp. Koos paralleelselt ilmunud töödega teistest laboritest on alust arvata, et tegemist on uudse regulaatornukleotiidiga. Selle nukleotiidi täpse rolli kindlakstegemine nõuab edasisi uuringuid.Bacteria through evolution developed numerous adaptation mechanisms that made them survive in harsh environmental conditions. Therefore, to protect themselves from environmental challenges bacteria evolved complex molecular networks that leads to suitable physiological responses by acquiring resistance to antibiotics, forming biofilms or by entering in a dormant state. These adaptation mechanisms depend on enzymatic activity of specific proteins that sense and respond to stress. The responses of these stresses are mediated by synthesis and degradation of signaling molecules that can regulate transcription and protein activities. The PhD work comprise the study of stringent response that is one of the most widely spread adaptive mechanism in bacteria. This mechanism is orchestrated by RelA SpoT Homologue (RSH) enzymes that produce and degrade a highly charged alarmone nucleotide called guanosine(penta)tetraphosphate ((p)ppGpp), comprising guanosine pentaphosphate (pppGpp) and tetraphosphate (ppGpp), collectively referred as (p)ppGpp. The (p)ppGpp-mediated signaling is one of the master regulators of bacterial physiology and plays an important role in bacterial virulence, and tolerance to antibiotics. In order to quantify the varying levels of (p)ppGpp and housekeeping nucleotides in different stress conditions as well as during normal bacterial growth, we developed a HPLC-based quantification method. Using Escherichia coli and Bacillus subtilis as the two representatives of Gram-negative and Gram-positive bacteria, I studied the effects of antibiotic treatment on the cellular levels of ppGpp, (p)ppGpp as well as housekeeping nucleotides such as ATP and GTP. Finally, using the HPLC-based approach, I discovered that a toxic Small Alarmone Synthetase RSH from Cellulomonas marina, in addition to coproducing ppGpp alarmone synthesizes a highly toxic ppGpp analogue, ppApp. Together with the recent report by Laub and Whitney labs who described Pseudomonas aeruginosa Tas1 – a divergent RSH enzyme that acts as a toxic effector of a secretion system via production of (pp)pApp (Ahmad et al., 2019) this discovery opens up a new direction in studies of RSH enzymes.https://www.ester.ee/record=b536990

Collaboration and competition in groups of humans and robots: effects on socioemotional and task-oriented behaviors

Advancements in technology have allowed the emergence of novel forms of social interaction. More specifically, in the last decades, the emergence of social robots has triggered a multidisciplinary effort towards achieving a better understanding of how humans and robots interact. In this dissertation, our goal was to contribute towards that effort by considering the role of goal orientation displayed by the robot (i.e. competitive vs. cooperative) and the role displayed by each player (partners and opponents). Sixty participants engaged in a typical Portuguese card-game called Sueca (two robots and two humans). Each participant played three games with each of the other players and the goal orientation was manipulated by the set of pre-validated verbal utterances displayed by the robot. The interactions were video-recorded, and we used a coding scheme based on Bales Interaction Process Analysis (1950) for small groups to analyze socioemotional positive, negative and task-oriented behaviors. A MultiLevel Modelling analysis yielded a significant effect of the role for all dimensions. Participants directed more socioemotional positive and task-oriented behaviors towards the human playing as a partner than as opponent and also interacted more with the other human in comparison to both robots. Comparing both robots, participants displayed more positive and task-oriented behaviors when interacting with robots as opponents than as partners. These results suggest the occurrence of different behavioral patterns in competitive and collaborative interactions with robots, that might be useful to inform the future development of more socially effective robots.O desenvolvimento de novas tecnologias tem proporcionado a emergência de novas formas de interação social. Mais especificamente, nas últimas décadas, o desenvolvimento de robôs sociais tem despoletado um esforço interdisciplinar orientado para o estabelecimento de uma melhor compreensão acerca da forma como pessoas e robôs interagem. Com esta dissertação, pretendemos contribuir para esse esforço considerando o efeito da orientação estratégica exibida pelo robô (i.e. competitivo vs. colaborativo) e o efeito do papel assumido pelos jogadores (parceiro ou oponente). Sessenta participantes jogaram à Sueca (dois robôs e dois humanos). Cada participante jogou três jogos em parceria com cada um dos outros jogadores e a orientação estratégica foi manipulada através do conjunto pré-validado de interações verbais exibido pelos robôs. As interações foram filmadas e analisadas usando o guião de análise sugerido por Bales (1950) que inclui interações socioemocionais negativas, positivas e relacionadas com a tarefa. Uma análise Multi-nível dos resultados revelou um efeito principal do papel para todas as dimensões. Os participantes dirigiram mais comportamentos positivos e relacionados com a tarefa para os humanos no papel de parceiros do que oponentes e interagiram mais frequentemente com o humano do que com os robôs. Os participantes também direcionaram mais interações positivas e relacionadas com a tarefa para os robôs quando estes assumiram o papel de oponentes, em comparação com quando jogaram como parceiros. Estes resultados sugerem a ocorrência de diferentes padrões comportamentais quando interagindo com robôs competitivos e colaborativos que poderão ser úteis para informar o desenvolvimento de robôs mais socialmente eficazes

Role of the stringent response in antibiotic tolerance of Escherichia coli

The stringent response is a near-universal bacterial adaptation system control mediated by accumulation of two guanine nucleotides ppGpp and pppGpp, collectively known as (p)ppGpp. The response monitors several environmental stress inputs, such as nutrient limitation and heat shock and remodels bacterial physiology in order to overcome the challenges. In Echerichia coli (p)ppGpp levels controlled by two enzymes – RelA and SpoT, the namesakes of RelA SpoT Homologue (RSH) protein family. The stringent response is associated to induction of virulence, antibiotic resistance and was recently suggested to be the driving force behind the formation of so-called persister cells – antibiotictolerant phenotypic variants in antibiotic-sensitive population. Since drug resistance and tolerance constitute a significant public health threat, understanding the connection amongst (p)ppGpp, antibiotic treatment and persistence is of great importance

"I'm not what you think I am": The power of threat and challenge responses to negative age-based meta-stereotypes on thriving at work and spillover effect

Age diversity in the workplace is no longer an option or an ethical duty, but necessary for the economic functioning of societies. However, age-based negative attitudes (ageism) persist, with important consequences. This research is composed of two studies with distinct but related objectives. Study 1 aimed to identify, in a Portuguese sample (N=123), which age-based stereotypes are most associated with each age group. A reluctance to attribute negative stereotypes to both younger and older people was observed. Study 2 aimed to assess work-related consequences of ageism for the target, namely the relationship between the activation of age-based threat and challenge responses at work on thriving at work and negative spillover, through the longitudinal intensive daily diary methodology. Data were collected during seven workdays via participants' cellphones (N=44, 301 observations). Although no variation across time was found, hindering multilevel longitudinal analyses, a negative association between threat response and thriving at work was found, and a positive association with negative spillover. Additional analyses showcased value in considering thriving dimensions (learning and vitality) separately. Challenge was not a predictor of either thriving or spillover unlike expected. Although preliminary and limited, the findings of the study can serve as a guide for future studies, and for organizations to rethink the benefits of diversity and design more age-inclusive processes. Overall, it aims to bring awareness to the topic of workplace ageism and its potential harmful effects both at work and outside.A diversidade etária no trabalho já não é opcional ou um dever, mas necessária para o funcionamento económico das sociedades. No entanto, as atitudes negativas baseadas na idade (idadismo) persistem, com importantes consequências. Esta investigação é composta por dois estudos com objetivos distintos mas relacionados. O Estudo 1 visava identificar, numa amostra portuguesa (N=123), quais os estereótipos etários mais associados a cada grupo etário. Observou-se relutância em atribuir estereótipos negativos tanto a pessoas mais jovens como a mais velhas. O Estudo 2 visava avaliar consequências do idadismo para o alvo, nomeadamente a relação entre ativações de ameaça e de desafio, e o thriving no trabalho e spillover negativo, através de dados recolhidos diariamente via app. Os dados foram recolhidos durante sete dias de trabalho através dos telemóveis dos participantes (N=44, 301 observações). Embora não tenha existido variação ao longo do tempo, impedindo análises longitudinais, encontrou-se uma associação negativa entre ameaça e prosperidade, e uma associação negativa com o spillover. Análises adicionais salientaram mais-valia em separar as dimensões de thriving (aprendizagem e vitalidade). O desafio não foi um preditor de thriving ou spillover, ao contrário do esperado. Embora preliminares e limitadas, as conclusões do estudo podem servir de guia para estudos futuros, e para as organizações repensarem os benefícios da diversidade e conceberem processos mais inclusivos em termos etários. Globalmente, pretende sensibilizar para o tema do idadismo no trabalho e os seus potenciais efeitos nocivos, tanto no trabalho como fora dele

Aplicação de modelos em painel para identificar os fatores explicativos da atividade empreendedora no setor da saúde humana e ação social no distrito de Bragança

Em Portugal vem-se assistindo ao despertar dos agentes privados para a necessidade de oferta de bens e serviços no setor da saúde humana e ação social. Tal oferta, no entanto, depende de fatores económico, sociais e regionais distintos. Com base em dados estatísticos regionais longitudinais, este trabalho tem como objetivo identificar os fatores determinantes da evolução da atividade empreendedora privada neste sector num distrito particular do interior Norte do país - o distrito de Bragança - de 1985 a 2009. A aplicação da metodologia econométrica de dados em painel permite identificar e mensurar os indicadores que estão na origem de tal evolução. Conclui-se que o número de estabelecimentos privados tem crescido nos doze concelhos do distrito sendo que a estrutura da população residente, em particular os níveis de dependência da população idosa e o aumento da longevidade da população, influenciam muito forte e positivamente esta tendência.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

O impacto da Guerra da Água nos Movimentos Sociais da Bolívia

Por décadas na cidade de Cochabamba na Bolívia a população por conta do posicionamento geográfico já propício para escassez de água sofria por conta de uma má distribuição de água deixando as pessoas já acostumadas em buscar soluções autonomamente, como irrigações comunitárias para melhorar a escassez. Em 2000 a população lutou e venceu a privatização da empresa que era responsável pelo abastecimento de água, a SEMAPA, o governo de Cochabamba aprovou lei que determinava a exploração da água sendo um direito privado. Com muita luta sangrenta e manifestações a população rural e da cidade com apoio e liderança da Coordenadora de Águas de Cochabamba, conseguiram revigorar essa nova lei, um fato nunca antes acontecido nos países da América Latin

Dinâmica empresarial do setor da saúde humana e ação (apoio) social no distrito de Bragança

Em Portugal, o Serviço Nacional de Saúde não tem conseguido acompanhar, e responder, satisfatoriamente ao crescimento da procura de cuidados de saúde, sendo-lhe atribuídos problemas em termos de cobertura, acessibilidade e ineficiência. Estes factos têm preocupado e orientado os prestadores privados para o mercado sendo inegável o despertar recente dos agentes da oferta para atividades privadas no setor da saúde humana e ação/apoio social. É, assim, importante que se conheça, e perceba, a dinâmica empresarial do setor da saúde e ação/apoio social, de forma a melhorar a atividade empresarial dos cuidados de saúde numa determinada localização. Com base em dados estatísticos regionais longitudinais, oriundos da base de dados Quadros de Pessoal, o trabalho de investigação subjacente a esta dissertação, tem como objetivos a análise e explicação da evolução da atividade empreendedora privada no setor da saúde humana e ação/apoio social no distrito de Bragança, de 1985 a 2009. A aplicação de indicadores de estatística descritiva permitiu descrever a evolução da atividade empreendedora privada, no setor, ao longo do tempo e a aplicação da metodologia econométrica de dados em painel, através da estimação de modelos de efeitos fixos e aleatórios, permitiu identificar e mensurar os indicadores sócio demográficos que estão na origem de tal evolução. Conclui-se que o número de estabelecimentos privados, e respetivo pessoal ao serviço, no setor da saúde humana e ação/apoio social tem crescido nos doze concelhos do distrito de Bragança sendo que a estrutura da população residente, em particular os níveis de dependência da população idosa e o aumento da longevidade da população, influenciam muito forte e positivamente esta tendência. In Portugal, the National Health Service has failed to monitor and respond satisfactorily to the growth in the searching for health care services and problems of coverage, accessibility and inefficiency have been attributed to its lack of action. These facts have been cause of concern for the private health care providers and have guided them to the market, and one cannot deny the recent awakening of agents offering for private practice in the human health sector/social support. It is, therefore, important to know and understand the business dynamics of the health sector and human action/social support in order to improve the health care business activity in a given location. Based on statistical regional longitudinal data taken from the lists of Permanent Staff, the research work behind this dissertation aims at analyzing and explaining the evolution of the private entrepreneurial activity in the human health setor and human action /social support in the district of Bragança, from 1985 to 2009. The application of descriptive statistical indicators has allowed to describe the evolution of the private entrepreneurial activity in this setor over the time, and it has also allowed the application of econometric methodology panel data, by estimating the models of fixed and random effects. In addition, it has permitted us to identify and measure the socio demographic indicators which have originated such evolution. We conclude that the number of private institutions and respective personnel working in the health setor and human action / social support has grown in the twelve counties in the district of Bragança. We are certain that the structure of the resident population, particularly the levels of dependence of the aged population and the increase in life expectancy, influence very deep and positively this tendency. En Portugal, el Servicio Nacional de Salud no ha logrado acompañar ni corresponder, satisfactoriamente, al crecimiento de la procura de cuidados de salud, siéndole atribuidos problemas en términos de cobertura, accesibilidad y ineficiencia. Estos hechos han preocupado y orientado los proveedores privados para el mercado siendo innegable el despertar reciente de los agentes de la oferta para actividades privadas en el sector de la salud humana y acción social/apoyo social. Por consiguiente, es importante que se conozca y que se comprenda la dinámica empresarial del sector de la salud y acción/apoyo social, de manera a mejorar la actividad empresarial de los cuidados de salud en una dada localización. Con base en datos estadísticos regionales longitudinales, provenientes de la base de datos Dotación de Personal, el trabajo de investigación subyacente a esta disertación, tiene como objetivos la análisis y explicación de la actividad emprendedora privada en el sector de la salud humana y acción social/apoyo social en el distrito de Braganza, de 1985 a 2009. La aplicación de indicadores de estadística descriptiva ha permitido describir la evolución de la actividad emprendedora privada, en el setor, a lo largo del tiempo y la aplicación de la metodología econométrica de datos en panel, a través la estimación de modelos de efectos fijos y aleatorios y a incluso permitido identificar y mensurar los indicadores socio demográficos que están en el origen de tal evolución. Se concluye que el número de establecimientos privados en el setor de la salud humana y acción/apoyo social, y respetivo personal a su servicio, ha aumentado en los doce ayuntamientos del distrito de Braganza, siendo que la estructura de la población residente, particularmente los niveles de dependencia de los ancianos y el aumento de la longevidad de la población, influyen muy fuerte y positivamente esta tendencia

Impacto do período de confinamento devido ao COVID-19 na saúde oral das crianças: investigação

Objetivos: Avaliar se o período de confinamento vivido entre os meses março e maio de 2020, influenciou, de algum modo, o cuidado na saúde oral das crianças. Métodos: Foi realizado um questionário online para indivíduos maiores de 18 anos com grau de parentalidade com crianças de idades compreendidas entre os 3 e os 12 anos de idade. As respostas ao questionário foram recolhidas e armazenadas numa base de dados criada a partir do programa ExcelÒ e as análises estatísticas foram realizadas no programa IBM© SPSS© Statistics vs. 26.0 (p=0,05). Resultados: Foram obtidas 169 respostas ao questionário online. 36,7% dos inquiridos afirmaram que o número de escovagens durante o período de confinamento se alterou: 26% dos inquiridos declararam que o número de escovagens diminuiu; 84,6% dos inquiridos responderam afirmativamente à questão: “O seu filho alguma vez foi a uma consulta de Medicina Dentária?” e 38,5% indicaram que levavam as crianças a consulta médico dentária pelo menos uma vez por ano. Conclusão: Existe uma grande preocupação dos pais/responsáveis em cuidar da saúde oral das crianças. Todavia, 26% dos inquiridos respondeu que as escovagens se alteraram, diminuindo, durante o período de confinamento vivido de março a maio de 2020. O presente estudo tinha como objetivo principal perceber se existiu um impacto no cuidado da saúde oral das crianças verificando-se, possivelmente, pela quebra das rotinas diárias habituais. No presente estudo conseguiu-se perceber que os pais procuraram participar ativamente nos cuidados de higiene oral das crianças, o que vem reforçar a ideia inicial desta investigação.Objectives: To assess whether the period of confinement experienced between March and May 2020, somehow influenced the oral health care of children. Methods: An online questionnaire was conducted for individuals over 18 years of age with a parenthood degree with children aged between 3 and 12 years of age. The answers to the questionnaire were stored in a database created using the ExcelÒ and the data analysis used in the study is IBM© SPSS© Statistics vs. 25.0 (p=0.05). Results: 169 responses to the online questionnaire were obtained. 36,7% of respondents said that the number of brushings during the confinement period had changed; 26% of respondents stated that the number of their children’s brushing decreased during the confinement period; 84,6% of respondents answered affirmatively to the question: “Has your child ever been to a dental appointment?” and 38,5% indicated that they took their children to a dental appointment at least once a year. Conclusion: There is a great concern of parents/guardians in taking care of children's oral health. The percentage of children who have had a dental appointment reflects greater sensitivity and attention to oral health. However, 26% of respondents answered that brushings decreased, during the period of confinement lived from March to May 2020. The main objective of the present study was to understand if there was an impact on the oral health care of children, possibly due to the break of the usual daily routine. In this study, it was possible to understand that the parents sought to actively participate in the children's oral hygiene care, which reinforces our initial idea