Base-specific spin-labeling of RNA for structure determination

To facilitate the measurement of intramolecular distances in solvated RNA systems, a combination of spin-labeling, electron paramagnetic resonance (EPR), and molecular dynamics (MD) simulation is presented. The fairly rigid spin label 2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolin-1-yloxyl-3-acetylene (TPA) was base and site specifically introduced into RNA through a Sonogashira palladium catalyzed crosscoupling on column. For this purpose 5-iodouridine, 5-iodo-cytidine and 2-iodo-adenosine phosphoramidites were synthesized and incorporated into RNA-sequences. Application of the recently developed ACE (R) chemistry presented the main advantage to limit the reduction of the nitroxide to an amine during the oligonucleotide automated synthesis and thus to increase substantially the reliability of the synthesis and the yield of labeled oligonucleotides. 4-Pulse Electron Double Resonance (PELDOR) was then successfully used to measure the intramolecular spin–spin distances in six doubly labeled RNA-duplexes. Comparison of these results with our previous work on DNA showed that A- and B-Form can be differentiated. Using an all-atom force field with explicit solvent, MD simulations gave results in good agreement with the measured distances and indicated that the RNA A-Form was conserved despite a local destabilization effect of the nitroxide label. The applicability of the method to more complex biological systems is discussed

Structure-Guided Evolution of Potent and Selective CHK1 Inhibitors through Scaffold Morphing

Pyrazolopyridine inhibitors with low micromolar potency for CHK1 and good selectivity against CHK2 were previously identified by fragment-based screening. The optimization of the pyrazolopyridines to a series of potent and CHK1-selective isoquinolines demonstrates how fragment-growing and scaffold morphing strategies arising from a structure-based understanding of CHK1 inhibitor binding can be combined to successfully progress fragment-derived hit matter to compounds with activity in vivo. The challenges of improving CHK1 potency and selectivity, addressing synthetic tractability, and achieving novelty in the crowded kinase inhibitor chemical space were tackled by multiple scaffold morphing steps, which progressed through tricyclic pyrimido[2,3-b]azaindoles to N-(pyrazin-2-yl)pyrimidin-4-amines and ultimately to imidazo[4,5-c]pyridines and isoquinolines. A potent and highly selective isoquinoline CHK1 inhibitor (SAR-020106) was identified, which potentiated the efficacies of irinotecan and gemcitabine in SW620 human colon carcinoma xenografts in nude mice

Synthesis of spinlabeled oligonucleotides for lange range distance measurements with PELDOR

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde eine wirksame synthetische und spektroskopische Methode entwickelt, um Abstände in DNA- und RNA-Duplexen mittels Elektronen-Paramagnetische-Resonanz (EPR) zu messen und um in Zukunft die dreidimensionale Struktur biologisch relevanter RNAs bestimmen zu können. Die Synthese von iodierten Nukleotid-Bausteinen für die Oligonukleotidsynthese, an denen mit Hilfe der Palladium katalysierten Sonogashira-Kreuzkupplung sich EPR-aktive Nitroxid-Acetylene einführen lassen, wurde erfolgreich durchgeführt. Diese Phosphoramidite sollten die folgenden Kriterien erfüllen: Alle vier Basen (A, C, G und U) sollten modifiziert werden und das eingeführte Spinlabel 2,2,5,5- Tetramethyl-3-ethinyl-pyrrolin-N-oxyl (TPA) sollte entweder in die minor oder die major groove hineinragen. Im Falle der Pyrimidine (U und C) war nur die Orientierung in die major groove möglich, da das Iodid nur am C5 eingeführt werden kann. Obwohl 5-Iodo-desoxyuridin- und 5-Iodo-uridin-phosphoramidit käuflich sind, wurden diese Bausteine selber hergestellt, wobei die iodierten Bausteine mit hohen Ausbeuten erhalten wurden. Die Synthese von 5-Iodo-cytidin erfolgte aus Cytidin, insbesondere durch die Iodierung mit Iod, Iodsäure in Essigsäure und Tetrachlorkohlenstoff. Die einzige Möglichkeit, dass das Nitroxid eine Orientierung innerhalb der minor groove annimmt, war die Derivatisierung am C2 der Purine. Der Austausch von Iodo gegen eine Aminofunktion für Guanosin war wegen des Verschwindens einer potentiellen Wasserstoffbrücke ungünstig, im Gegensatz zu Adenosin. Die Synthese von 2-Iodo-adenosin-phosphoramidit wurde durchgeführt, wobei die Amino-Gruppe am C2 eines modifizierten Guanosins durch Iod mittels einer radikalischen Reaktion mit Iod, Iodmethan und Kupferiodid substituiert wurde. Die Synthese von 7-Deaza-adenosin (7-Iodo-tubercidin) und von 7-Deaza-guanosin wurde durch eine Lewissäure katalysierte Vorbrüggen-Glykosylierung zwischen der geschützen Nukleobase und der acetylierten Ribofuranose erzielt. Die Iodierung erfolgte für das geschützte Tubercidin mit N-Iodsuccinimid, während sie für Guanosin trotz zahlreicher Versuche leider scheiterte. Da natürlich vorkommende DNA und RNA nicht paramagnetisch sind, müssen sie durch die Einführung eines Spinlabels EPR-fähig gemacht werden. Dafür wurde das Spinlabel TPA ausgewählt, da es sich mit einer hohen Stabilität und Starrheit auszeichnet. Dafür wurde zuerst die Palladium(II) katalysierte Sonogashira-Kupplung in DNA-Strängen wärend der Oligonukleotidsynthese für 5-Iodo-desoxy-uridin optimiert: Sehr reine Proben mit einem oder zwei Spinlabels in einem Strang konnten hergestellt werden. Diese Methode wurde anschließend erfolgreich auf RNA mit geringfügigen Änderungen für U, C und A übertragen, um die Ausbeute der Kupplung zu verbessern. Die benutzte Chemie hat sich als entscheidend erwiesen, da es zu berücksichtigen gilt, wie sich die Reagenzien, die bei der RNA-Festphasensynthese eingesetzt werden, auf das Spinlabel auswirken. Es wurde festgestellt, dass die Oxidationsstufe des klassischen TBDMS-Festphasenzyklus mit Iod, Pyridin und Wasser für die Reduktion eines beträchtlichen Teils des Nitroxids verantwortlich ist, insbesondere im Falle von 2-Iodo-adenosin. Deshalb wurde beschlossen, die patentierte ACE-Chemie zu verwenden, in der das Phosphor-Atom während des Festphasenzyklus mit tert-Butylperoxid in Toluol oxidiert wird. Die Synthese der geeigneten Bausteine wurde hierfür durchgeführt, 5-Iodo-uridin-phosphoramidit ist bei Dharmacon kommerziell erhältlich. Leider scheiterte die Synthese von 7-Iodo-tubercidin-phosphoramidit auf der Stufe der Einführung des Orthoesters. Auf diese Weise wurden sehr reine doppelgelabelte DNA und RNA Duplexe erhalten, deren Stabilität durch UV-Spektroskopie überprüft wurde. Der Unterschied in den Tm-Werten überstieg nicht 3,2°C für DNA und 5,1°C für RNA im Vergleich zu den unmodifizierten Duplexen. CD-Spektren wurden ebenso aufgenommen und zeigten, dass die B- bzw. A-Form erhalten blieb. In Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Prisner wurden die Abstände zwischen den zwei Nitroxiden in den synthetisierten fünf DNA- und sechs RNA-Duplexen mit Puls-Elektron-Doppel-Resonanz (PELDOR) gemessen. Diese experimentellen Werte wurden mit den theoretischen Werten verglichen, die mit Molecular Dynamics Simulationen erhalten wurden (Arbeitskreis Stock). Die mit beiden Methoden erhaltenen Ergebnisse stimmen überein. Erfolgreich wurde auch die Synthese von reinen spingelabelten biologisch relevanten RNAs wie TAR-RNA, der vier-Wege Kreuzung IIIa,b,c des Hepatitis C Virus und dem U4-U6 Komplex des Spleißosoms im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt. Die größte synthetisierte RNA betrug 65 Nukleobasen. Leider konnten wegen zu hoher Flexibilität oder nicht richtiger Faltung der RNA keine definierten Abstände gefunden werden.An efficient synthetic and spectroscopic tool was developed to measure distances in DNA- and RNA-duplexes using EPR, and therefore to be able to study, in the future, the three-dimensional structure of RNAs of biological importance. The rigid spin label 2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolin-1-yloxyl-3-acetylene (TPA) was base and site specifically introduced into DNA and RNA through a Sonogashira palladium catalyzed cross-coupling on column. For this purpose 5-iodo-deoxyuridine, 5-iodo-uridine, 5-iodo-cytidine and 2-iodo-adenosine phosphoramidites were synthesized and incorporated into DNA and RNA-sequences respectively. We took in consideration the orientation of the nitroxide spin label in the oligonucleotides, which can be directed for duplexes either into the major (for dU, U, C and potentially for A) or into the minor groove (for A and G). 5-Iodo-deoxyuridine and 5-iodouridine-phosphoramidite are commercially available but can be easily obtained in two or three steps from 5-iodo-deoxyuridine or 5-iodouridine respectively using standard methods. The key step for the synthesis of 5-iodocytidine was the iodination of the partially protected cytidine with iodic acid and iodine. For the minor groove modification, the nucleoside 2-iodoadenosine was synthesized in four steps from guanosine. In particular, the substitution of the exocyclic amine at C2 was performed with iodine, copper iodide and methylene iodide via a radical mechanism. Protected 7-deaza-adenosine and 7-deazaguanosine were synthesized through a Vorbrüggen glycosylation between the protected nucleobase and the acetylated ribofuranose. The iodination at C7 was successfully performed with N-iodosuccinimide for 7-deaza-adenosine but failed for 7-deazaguanosine depite several attempts. Chosen for its stability and rigidity, TPA was first introduced into DNA-duplexes to optimized the palladium(II) catalysed Sonogashira cross-coupling during the solid-phase oligonucleotide synthesis. Very pure samples with one or two spin-labels could be produced. In the case of RNA, the reagents used during the automated synthesis proved to be determining, as a significant amount of nitroxide was reduced into the corresponding amine. Indeed, during the classical TBDMS-solid-phase cycle, the oxidation step, performed with iodine/pyridine/water, was partly responsible for this side-reaction. That is why the patented ACE-chemistry was chosen: in this case, the oxidation of the phosphor-atom is obtained with tert-butyl peroxide in toluene. The corresponding building blocks (2-iodo-A and 5-iodo-C) were synthesised, 5-iodo-uridine-phosphoramidite was commercially available. Unfortunately the synthesis of 7-iodo-tubercidine-phosphoramidite failed at the orthoester stage. Whether the spin label disturbs the DNA/RNA structure was checked by UV-melting and CD studies. The difference in the Tm-values did not exceed 3.2°C for DNA and 5.1°C for RNA in comparison to the unmodified strands. CD-spectra showed that the B- for DNA and A-form for RNA were conserved. In cooperation with the Prisner group, the distances between two nitroxides in the synthesized DNA and RNA duplexes were measured with pulsed electron-electron double resonance (PELDOR). The experimental values corresponded with the values obtained with molecular dynamics simulations. The synthesis of spinlabeled RNAs of biological importance, like TAR-RNA, the four-way junction IIIa,b,c of HCV or the U4-U6 complex of the spliceosom was also successfully performed. The biggest synthesized RNA contained 65 nucleobases. Unfortunately, no defined distances could be measured because of the high flexibilty of the chosen systems

Sonogashira cross-coupling during the solid-phase synthesis (example of 2-iodoadenosine)

<p><b>Copyright information:</b></p><p>Taken from "Base-specific spin-labeling of RNA for structure determination"</p><p></p><p>Nucleic Acids Research 2007;35(9):3128-3143.</p><p>Published online 22 Apr 2007</p><p>PMCID:PMC1891445.</p><p>© 2007 The Author(s)</p

Correlation of the PELDOR and MD distances for RNAs – (squares) and DNAs – (open circles)

<p><b>Copyright information:</b></p><p>Taken from "Base-specific spin-labeling of RNA for structure determination"</p><p></p><p>Nucleic Acids Research 2007;35(9):3128-3143.</p><p>Published online 22 Apr 2007</p><p>PMCID:PMC1891445.</p><p>© 2007 The Author(s)</p

Phosphoramidites prepared for incorporation of iodinated bases into protected RNA oligomers

<p><b>Copyright information:</b></p><p>Taken from "Base-specific spin-labeling of RNA for structure determination"</p><p></p><p>Nucleic Acids Research 2007;35(9):3128-3143.</p><p>Published online 22 Apr 2007</p><p>PMCID:PMC1891445.</p><p>© 2007 The Author(s)</p

Synthetic pathway to 2-iodoadenosine phosphoramidite (ACE® chemistry); () HC(OMe)NMe, DMF, 50°C, 69% (compound ); () TIPS-Cl, pyridine, 0°C, 72%

<p><b>Copyright information:</b></p><p>Taken from "Base-specific spin-labeling of RNA for structure determination"</p><p></p><p>Nucleic Acids Research 2007;35(9):3128-3143.</p><p>Published online 22 Apr 2007</p><p>PMCID:PMC1891445.</p><p>© 2007 The Author(s)</p

Spin labeling of oligonucleotides with the nitroxide TPA and use of PELDOR, a pulse EPR method, to measure intramolecular distances

In this protocol, we describe the facile synthesis of the nitroxide spin-label 2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolin-1-oxyl-3-acetylene (TPA) and then its coupling to DNA/RNA through Sonogashira cross-coupling during automated solid-phase synthesis. Subsequently, we explain how to perform distance measurements between two such spin-labels on RNA/DNA using the pulsed electron paramagnetic resonance method pulsed electron double resonance (PELDOR). This combination of methods can be used to study global structure elements of oligonucleotides in frozen solution at RNA/DNA amounts of similar to 10 nmol. We especially focus on the Sonogashira cross-coupling step, the advantages of the ACE chemistry together with the appropriate parameters for the RNA synthesizer and on the PELDOR data analysis. This procedure is applicable to RNA/DNA strands of up to similar to 80 bases in length and PELDOR yields reliably spin-spin distances up to similar to 6.5 nm. The synthesis of TPA takes similar to 5 days and spin labeling together with purification similar to 4 days. The PELDOR measurements usually take similar to 16 h and data analysis from an hour up to several days depending on the extent of analysis.</p