Thalidomide modulates Mycobacterium leprae-induced NF-κB pathway and lower cytokine response

AbstractIt is widely accepted that tumor necrosis factor alpha (TNF-α) plays a critical role in the development of tissue and nerve damage in leprosy and during the reactional episodes of acute inflammation. Thalidomide (N-α-phthalimidoglutarimide), a drug used to treat leprosy reaction, modulates immune response, inhibits inflammation and NF-κB activity. Here we investigated whether thalidomide inhibits NF-κB activation induced by Mycobacterium leprae, p38 and ERK1/2 MAPK activation. EMSA and supershift assays were performed to investigate NF-κB activation in response to M. leprae and its modulation following in vitro treatment with thalidomide. Luciferase assay was assayed in transfected THP-1 cells to determine NF-κB transcriptional activity. Flow cytometry and immunofluorescence were used to investigate p65 accumulation in the nucleus. Immunoblotting was used to investigate p38 and ERK1/2 phosphorylation. Following activation of PBMC and monocytes with M. leprae, the formation and nuclear localization of NF-κB complexes composed mainly of p65/p50 and p50/p50 dimers was observed. Induction of NF-κB activation and DNA binding activity was inhibited by thalidomide. The drug also reduced M. leprae-induced TNF-α production and inhibited p38 and ERK1/2 activation. Definition of the activation mechanisms in cells stimulated with M. leprae can lead to the development of new therapy applications to modulate NF-κB activation and to control the inflammatory manifestations due to enhanced TNF-α response as observed in leprosy and in leprosy reactions

Estudo do receptor LILRA2 na maturação e produção de citocinas por células dendríticas e se envolvimento na hanseníase

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:41:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) maristela_hernadez_ioc_dout_2007.pdf: 1703579 bytes, checksum: c6aea9db2011c8948799e66defbf0152 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, BrasilOs receptores da família LILR (Leukocyte Immunoglobulin- like Receptor) pertencem à superfarm1ia .das imunoglobulinas e são expressos em células de origem mielóide e linfóide. Os receptores inibidores (LILRB) apresentam longos domínios citoplasmáticos contendo de 2 a 4 domínios ITIM e são capazes de inibir ativação celular recrutando proteínas tirosinas fosfatases SHP-I. Já os receptores ativadores (LILRA) apresentam curto domínio citoplamático mas após associação com a cadeia gama do receptor Fc, que apresenta domínio ITAM, são capazes de transduzir sinais estimulatórios às células. Já foi demonstrado que LILRB I e LILRB2 podem inibir a citotoxidade de células NK e aumentar o limite de ativação de linfócitos T. Pouco se sabe a respeito da função dos receptores ativadores. No entanto. foi observado que LILRA2 estava com a expressão gênica aumentada nas lesões dos pacientes de hanseníase do polo lepromatoso. A função deste receptor foi investigada e os possíveis efeitos do Mycobacterium leprae sobre a ativação induzida por LILRA2 avaliados Foram realizados experimentos de "cross-linking" em células dendríticas derivadas de monócitos (MDDC). Inicialmente, foi observado que após a estimulação àtravés de LILRA2 ocorria aumento no conteúdo de proteínas tirosina fosforiladas, sugerindo haver transdução de sinal. Também foi observado que as MDDC estimuladas via LILRA2 apresentavam marcadores de ativação celular, como a expressão de CD83, aumento na expressão de moléculas co-estimulatórias e do MHC. Foi observado ainda que a ativação de LILRA2 não induz a secreção de níveis significativos das citocinas. No entanto, um forte efeito sinergístico na secreção de TNF e IL-IO pode ser observado quando as células eram estimuladas via LILRA2 e TLR4 ou CD40. Foi observado ainda que após o "cross-linking", as MDDC apresentam forte capacidade aloestimulatória. A presencade células LILRA2+ CD68+ nas lesões dos pacientes lepromatosos foi detectada utilizando microscopia confocal. Nos experimentos subseqüentes foi avaliado se o M. leprae ativaria as MDDC e modularia a ativação induzida por LILRA2. Inicialmente observamos que as MDDC estimuladas com M. tuberculosis, mas não com M. leprae, secretam TNF Baixas concentrações de IL-IO foram encontradas nas culturas estimuladas com M. leprae quando comparadas às culturas estimuladas com M tuberculosis. E ainda, o M. tuberculosis, mas não o M. leprae, teve efeito sinergístico com LILRA2 na produção de TNF. Na tentativa de encontrar o ligante deste receptor, foi gerado um tetrâmero e sua ligação a diversos tipos celulares foi testada. Interação do tetrâmero com monócitos estimulados com IL-4 e também MDDC foi detectada. Embora experimentos de imunoprecipitação tenham sido realizados, o ligante não foi encontrado. Até o momento, já observamos que a LILRA2 pode favorecer a maturação de MDDC, pelo menos in vitro, e contribuir para aumentada produção de citocinas. O M. leprae não parece ser um potente ativador das células dendríticas e ainda pode limitar a ativação induzida por outros receptores. A elevada expressão de moléculas coestimulatórias, a presença de IL-I O e ausência de IL-12 nas MDDC estimuladas com M. leprae ou via LILRA2 sugere que estes podem estar envolvidos na indução de tolerância observada nos pacientes lepromatososLILR (Leukocyte Immunoglobulin- like Receptor) are a family of receptors from the immunoglobulin superfamily expressed on myeloid and lymphoid cells. LILR are characterized by either 2 or 4 homologous Immunoglobulin-like dom ais. One subset of receptors, LILRB, displays long citoplasmatic tails containing immuno receptor tyrosine-based inhibitory motifs (ITIM). These receptors inhibit cell activation by recruiting protein tyrosine phosphatase SHP-1. Another subset of receptors, LILRA, contains short cytoplasmatic domain that lack recognizable docking motifs for signalling mediators. These rece ptors associate with the gamma chain of the Fc receptor, which transduces stimulatory signals b y recruiting protein tyrosine kinases through a cytoplasmatic immunoreceptor tyrosine-based activat ion motif (ITAM). A third subset of receptors has no transmembrane domain and is secret ed as a soluble receptor. Some of these receptors, LILRB1 and LILRB2, are specific receptor s for MHC class I molecules. LILRBs have been shown to inhibit cell activation in several ex perimental systems. Little is know about the activating receptors. LILRA2 was found to be up-reg ulated in lesions of lepromatous leprosy patients. In order to clarify whether this receptor might influence the immune response in leprosy, the function of this receptor was investigated. Cro ss-linking of LILRA2 on dendritic cell (DC) caused an up-regulation on protein tyrosine phospho rylation, suggesting LILRA2 stimulates intracellular signaling. Upon cross-linking, DC exp ress high levels of MHC I and II and co- stimulatory molecules, but cytokines were not detec ted on culture supernatant. However, a strong synergistic effect on TNF and IL-10 production was observed when cells were simultaneously stimulated by LILRA2 and TLR4 or CD40. LILRA2 activ ated DC also induced allogeneic T lymphocytes proliferation. By double immunofluoresc ence labeling, it was identified that LILRA2 is expressed on macrophage-like CD68+cells i n lepromatous leprosy skin lesions. The capacity of M. leprae to induce DC activation and/or to modulate LILRA2- induced activation was further investigated. In functional experiments it was observed that M. tuberculosis but not M. leprae stimulated cells induce TNF secretion. IL-10 was d etected on M. leprae -stimulated cultures, albeit at lower level than that of M. tuberculosis -stimulated cells. M. leprae had no synergistic effect on LILRA2 activated cells. To id entify LILRA2 ligand, a tetramer was generated and it’s binding to different cell types was tested. The tetramer interacted with IL-4 stimulated monocytes and DC. Although Immunoprecipi tation experiments were preformed, the ligand was not successfully identified. The data ob tained so far indicates that LILRA2 activation enhances DC maturation markers expression and cytok ine secretion by activated DC. M. leprae is not a potent DC activator. The high surface levels of co-stimulatory molecules, the presence of IL-10 and absence of IL-12 suggest that DC stimulat ed by M. leprae or LILRA2 are only partially activated and they might contribute to lepromatous leprosy toleranc

PROGRAMA DE LIDERANÇA E VIGILÂNCIA EM TESTES ANTIMICROBIANOS (ATLAS): ANÁLISE RETROSPECTIVA DE 5 ANOS DO PERFIL DE SENSIBILIDADE DE BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS ISOLADAS EM UTIS NO BRASIL

Introdução: Infecções por bactérias Gram-negativas multirresistentes (MDR), principalmente por Enterobacterales, Pseudomosas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, tem se tornando uma preocupação crescente em todo o mundo. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de amostras clínicas de Enterobacterales, P. aeruginosa e A. baumannii de diferentes sítios de infecção provenientes de Unidades de Terapia Intensiva de 34 instituições no Brasil entre os anos de 2017 e 2021. Métodos: Os dados epidemiológicos utilizados neste estudo estão depositados na plataforma de vigilância global Atlas. Após teste de sensibilidade aos antimicrobianos por cada instituição, as amostras foram enviadas para o International Health Management Associates (IHMA). Amostras de corrente sanguínea, do trato respiratório, geniturinário, intestinal, entre outros sítios, foram analisadas e os pontos de corte do EUCAST, 2023 foram utilizados para interpretação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Resultados: Para este estudo, 741 amostras clínicas de Enterobacterales, 316 de P. aeruginosa e 185 de A. baumannii foram avaliadas, sendo que 62%, 30,7% e 95% dos isolados foram considerados MDR, respectivamente. Observamos um aumento nas taxas de resistência para Enterobacterales principalmente para cefepima (44,9%-55,7%), meropenem (24,5%-27,0%), colistina (12,4%-25,5%), amicacina (7,7%-23,4%), ceftazidima-avibactam (1,4%-4,1%) entre 2017 e 2021; ciprofloxacino (42,8%-56,2%) entre 2018 e 2021; ceftolozana-tazobactam (34,5%-47,9%) (2017, 2020 e 2021). Foi observado também um aumento nas taxas de resistência para os isolados de P. aeruginosa para cefepima (19,6%-24,7%), meropenem (14,3%-17,5%), amicacina (7,1%-19,6%), ceftazidima-avibactam (3,6%-12,3%) entre 2017 e 2021; ciprofloxacino (7,7%-29,9%) entre 2018 e 2021; ceftolozana-tazobactam (9,0%-16,5%) (2017, 2020 e 2021). Para os isolados de A. baumannii, o aumento nas taxas de resistência foi observado para amicacina (71,4%-98,6%) entre 2017 e 2021; imipenem (85,0%-98,6%), ciprofloxacino (90,0%-98,6%) e colistina (0% para 4,2%) entre 2018 e 2021. Conclusão: Um aumento da diminuição da sensibilidade aos antimicrobianos foi observada em bactérias Gram-negativas isoladas em UTIs de hospitais brasileiros durante o período deste estudo, incluindo para as novas associações com antimicrobianos, o que reforça a preocupação do surgimento e da disseminação de bactérias com o fenótipo MDR