Modelo experimental em ratos no reparo ósseo do fêmur utilizando células mononucleares no plasma rico em plaquetas

As células mononucleares da medula óssea têm sido utilizadas em diversas afecções na tentativa de regeneração tecidual. (O objetivo deste estudo foi o de avaliar a adesão das células mononucleares sobre defeito crítico, com a adição do plasma rico em plaquetas (PRP) e / ou TGF-β1 (Fator de crescimento transformador Beta 1), e, por fim, verificar o reparo ósseo dos sítios defeituosos dos fêmures dos ratos. Foi criado um defeito bilateral critico nos fêmures de 33 Wistar-Kyoto ratos. Células mononucleares de medula óssea, TGF-β e PRP foram adicionadas no lado tratado da lesão e soro fisiológico no lado contralateral. Determinou-se a adesão de células mononucleares sobre o defeito crítico e reparo ósseo. A presença e consequente adesão das células mononucleares administradas nos animais tratados não foi evidenciada através da técnica de PCR. As análises radiológicas evidenciam fechamento da lesão, porém, nós não podemos afirmar que foi pelos tratamentos administrados ou pela própria regeneração óssea, quando analisadas em seis e 10 semanas pós-operatórias, haja visto não apresentarem diferenças significantes entre os grupos. Conclusões: a) As células mononucleares não aderiram ao defeito crítico criado no fêmur do rato; b) Não foi possível avaliar a eficiência dos tratamentos propostos para o reparo ósseo, por não apresentarem diferenças significativas entre os grupos.Mononuclear cells from bone marrow have been used in various treatments of diseases in an attempt to regenerate tissues. The objective of this study was to evaluate the accession and proliferation of mononuclear cells in a critical defect, with the addition of platelet-rich plasma (PRP) and / or TGF-β1 (transforming growth factor beta 1), and then to evaluate bone repair at defective sites on the femurs of rats. We created a critical defect on the bilateral femurs of 33 Wistar-Kyoto rats. Mononuclear bone marrow cells, TGF-β and PRP were added to the lesion on the treated side and saline on the contralateral side. We determined the adhesion of mononuclear cells at the critical defect and bone repair. The presence and consequent adhesion of the mononuclear cells administered to the treated animals was not demonstrated by PCR. Radiographic analysis showed closure of the lesion, but we could not affirm that this resulted from the treatments administered or by normal bone regeneration itself, when the lesion was evaluated at 6 and 10 weeks postoperative, seeing that there were no significant differences between the groups. Conclusions: a)Bone marrow mononuclear cells did not adhere at the critical defect created in the rat femur; b) It was not possible to determine the efficiency of the bone repair treatments studied, as the results did not show significant differences between the groups

Avalia??o da migra??o e neurodiferencia??o de c?lulas-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) de pacientes com displasia cortical

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS ([email protected]) on 2016-06-22T19:22:17Z No. of bitstreams: 1 TES_DANIEL_RODRIGO_MARINOWIC_COMPLETO.pdf: 16202491 bytes, checksum: 5bb7aaf0de3a700a163c7437ecf2adef (MD5)Made available in DSpace on 2016-06-22T19:22:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_DANIEL_RODRIGO_MARINOWIC_COMPLETO.pdf: 16202491 bytes, checksum: 5bb7aaf0de3a700a163c7437ecf2adef (MD5) Previous issue date: 2016-03-03Changes in the cerebral cortex development are presented as a group of distinct defects with a not well-defined pathogenesis. The focal cortical dysplasia (FCD) is one of the most frequent form of cortical development malformation, that encompasses multiple types of changes both in the cortical architecture and cytological abnormalities. It is an underlying pathology of a significant proportion of partial epilepsy refractory to drug treatment. Especially the limited number of cases and the lack of suitable experimental models rarely document the mechanisms involved with the genesis of FCD. The scarse predictive preclinical models that can be used to study the pathophysiology and to translate the therapeutic discovery from animal models to human use, strengthens the need to study the brain development from cells originated from patients that harbor these central nervous systems diseases. The generation of iPSC cells and the differentiation into specific cells and tissues will provide important testing and an unique ability to study the development and progress of CNS diseases. The objective of this study was to establish a cellular model of focal cortical dysplasia through the generation of induced pluripotent stem cells (iPSC) from fibroblasts derived from affected patients. Human fibroblasts were obtained from skin biopsies from two patients and cultured up to the fifth passage. Immunofluorescence analysis of AKT/mTOR signaling pathways was performed in the dysplastic brain tissue. iPSC cells were generated from fibroblasts through transfection with a viral vector containing the genes OCT4, KLF4, SOX2, and C-MYC and characterized by immunohistochemistry. Cell migration co-cultured with fibroblast and iPSC was investigated. Morphological and molecular characterization of neurodifferentiated iPSC were performed by immunohistochemistry and PI3K/ATK/mTOR signaling pathway analysis. Both patients were diagnosed with FCD type IIb. The AKT and mTOR phosphorylated and non-phosphorylated was higher in brain sections from patient 01. iPSC clones from patients and controls were generated from skin fibroblasts. Both iPSC from patients and controls showed polarization and morphology similar to nerve cells. In the cell migration assay, fibroblasts derived from FCD migrate with greater intensity within 24 hours (p<0,0001) and 48 hours (p<0,001), and iPSC cells did not present difference in cell migration. During neurodifferentiation, iPSC cells from patients with FCD showed lower values of 4EBP-1, ?-catenin, CIAP-1, CIAP-2 and PI3K, and higher values of MCL 1 gene expression. Changes in cell migration in adult tissue, uncontrolled cell proliferation, cell adhesion protein deficiency, and alterations in the expression of genes responsible for apoptosis and PI3K pathway that are implicated with an complete and well successful CNS formation. Alterations in some of these were detected in cells and iPSC from patients with FCD and may be related to the ethiopathology of the disease.As altera??es do desenvolvimento do c?rtex cerebral apresentam-se como um grupo de malforma??es com uma distin??o e patog?nse ainda n?o bem definidas. A displasia cortical focal (DCF) ? uma das formas mais frequentes de malforma??es do desenvolvimento cortical, sendo a patologia subjacente a uma parcela significativa de epilepsias parciais refrat?rias ao tratamento medicamentoso. A displasia cortical focal engloba m?ltiplos tipos de altera??es tanto na arquitetura cortical quanto em anormalidades citol?gicas. Palmini e colaboradores classificaram as displasias corticais focais de acordo com observa??es na subst?ncia branca e na arquitetura da camada cortical. Os mecanismos envolvidos na g?nese da DCF s?o pouco investigados, principalmente pelo n?mero limitado de casos e a falta de modelos experimentais adequados e suas causas provavelmente est?o relacionadas a muta??es som?ticas. A falta de modelos pr?-cl?nicos preditivos que possam ser utilizados no estudo da fisiopatologia e o hist?rico enfraquecido quando se trata em traduzir a descoberta terap?utica de modelos animais para o uso humano, fortalece a necessidade de estudar o desenvolvimento cerebral a partir de c?lulas originadas do pr?prio paciente. A gera??o de c?lulas iPSC e diferencia??o tecidual espec?fica de c?lulas de pacientes acometidos por doen?as neurol?gicas relevantes possui um valor inestim?vel para a realiza??o de testes al?m de fornecerem uma capacidade adicional e ?nica para estudar o desenvolvimento inicial e a progress?o das patologias associadas ao SNC. O objetivo do presente trabalho ? estabelecer um modelo celular de Displasia Cortical Focal atrav?s da gera??o de c?lulas-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) a partir de fibroblastos de pacientes afetados. Fibroblastos humanos foram obtidos de bi?psias de pele de dois pacientes com DCF e foram cultivados at? a quinta passagem. Foi realizada an?lise imunopatol?gica e das vias de sinaliza??o AKT/mTOR no tecido cerebral displ?sico. C?lulas iPSC foram geradas a partir dos fibroblastos atrav?s da exposi??o a vetores virais contendo os genes OCT4, KLF4, SOX2, e C-MYC e caracterizadas por imunohistoqu?mica. Foi realizado ensaio de migra??o celular dos fibroblastos (24h, 48h e 72h) e das iPSC (3 dias e 7 dias). As c?lulas iPSC foram neurodiferenciadas e analisadas nos per?odos de 14 dias, 22 dias e 35 dias. Nesses per?odos, foram realizadas an?lises morfol?gicas, imunohistoqu?mica (polariza??o) e moleculares (genes relacionados a via PI3K/ATK/mTOR). Ambos os pacientes foram diagnosticados com DCF tipo IIb. O paciente 01 apresentou valores maiores que o paciente 02 em rela??o ? ?rea marcada das vias AKT e mTOR, tanto na via fosforilada como n?o fosforilada no tecido cerebral, com diferen?as estatisticamente significativas. Clones iPSC dos pacientes e controles foram gerados e caracterizados a partir dos fibroblastos de pele. Tanto as iPSC dos pacientes quanto do controle apresentaram morfologia e polariza??o semelhante a c?lulas nervosas ap?s protocolo de neurodiferencia??o. No ensaio de migra??o celular, fibroblastos com DCF migraram com mais intensidade em 24 horas (p<0,0001) e 48 horas (p<0,001). As c?lulas iPSC n?o apresentaram diferen?a no potencial de migra??o celular nos per?odos analisados. Durante o protocolo de neurodiferencia??o, as c?lulas iPSC dos pacientes com DCF apresentaram valores menores de express?o dos genes 4EBP-1, ?-Catenina, CIAP-1, CIAP-2 e PI3K, e valores mais elevados da express?o de MCL 1. Altera??es na migra??o celular no tecido adulto e em processos como de prolifera??o celular acentuada, defici?ncia de prote?na de ades?o celular, altera??o na express?o de genes respons?veis pelo controle de apoptose e altera??o na via PI3K respons?vel no sistema nervoso central pela sobreviv?ncia celular, controle de apoptose, migra??o neuronal, desenvolvimento morfol?gico dos neur?nios e forma??o das neurotransmiss?es, puderam ser evidenciadas nas c?lulas dos pacientes com DCF em rela??o aos pacientes controle e podem estar relacionadas com a forma??o do c?rebro com displasia

Avalia??o da indiferencia??o celular e indu??o de neurodiferencia??o em co-cultivo de fibroblastos NIH 3T3 com c?lulas mononucleares do sangue de cord?o umbilical

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437015.pdf: 2405577 bytes, checksum: 64fe8d7f54de71f570c0f7a29d9c6838 (MD5) Previous issue date: 2012-01-16Cellular therapy represent a new frontier for the treatment of several diseases, including diseases related to central nervous system. Human umbilical cord blood is an attractive source of stem cells; however, it has a heterogeneous population with a small amount of mesenchymal stem cells. Currently, cell reprogramming induced by different methodologies can confer pluripotency to differentiated adult cells. The objective of the study was to evaluate the reprogramming potential of fibroblasts and neural differentiation after co-culture with umbilical cord blood mononuclear cells. This study was approved by the Ethics Committee of PUCRS (CEP 11/05504). Cells were obtained from four human umbilical cord blood. Cell suspensions were fractionated at gradient of density 1077. The mononuclear cells of each sample were cultured for 7 days and later, the culture was infected with 105 cells of mouse fibroblast cell line NIH 3T3 and co-cultured for 6 days. To evaluate the pluripotency it was performed RNA extraction and later, amplification using primers specific for pluripotency genes. The differentiation was also confirmed by the adipogenic and osteogenic differentiation. Neural differentiation of the reprogrammed cells was obtained by the method described by Song et. al (2008) and evaluated by immunofluorescence. Population growth was quantified by hemocytometer. All co-cultured cells showed adipogenic and osteogenic differentiation capacity. After co-cultivation cells began transcribing the pluripotency gene KLF4. Statistically significant differences in the parameters area, diameter, optical density and fractal dimension were observed by confocal microscopy in reprogrammed and neural differentiated cells. The population of reprogrammed cells doubled every three days until the addition of the last medium of neural differentiation, when cultures became quiescent until the end of the neural differentiation. The contact in form of co-cultivation of fibroblasts with umbilical cord blood mononuclear fraction for six days promoted the reprogramming of these cells to a indifferentiation stage, allowing the induction of neural differentiation later.As terapias celulares representam uma nova fronteira para o tratamento de diversas doen?as, inclusive patologias relacionadas ao sistema nervoso central. O sangue de cord?o umbilical humano ? uma atrativa fonte de c?lulas-tronco, por?m, apresenta uma popula??o heterog?nea com pouca quantidade de c?lulas-tronco mesenquimais. Atualmente, a reprograma??o celular induzida atrav?s de metodologias distintas, pode conferir pluripot?ncia ?s c?lulas adultas diferenciadas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de reprograma??o de fibroblastos e a diferencia??o neural ap?s co-cultivo com fra??o mononuclear de sangue de cord?o umbilical. Foram obtidas c?lulas da fra??o mononuclear de quatro cord?es umbilicais humanos de pacientes atendidas no Centro Obst?trico do Hospital S?o Lucas da PUCRS. As suspens?es celulares foram fracionadas em gradiente de densidade 1077. A fra??o mononuclear de cada amostra foi cultivada por sete dias e ap?s, contaminada com 105 c?lulas da linhagem de fibroblasto de camundongos NIH 3T3 e co-cultivadas por 6 dias. Para avalia??o da pluripot?ncia, foi realizada extra??o de RNA e posterior amplifica??o utilizando oligonulceot?deos espec?ficos para os genes de pluripot?ncia Oct3/4, Sox2 e KLF4. O fen?tipo mesenquimal foi confirmado pela diferencia??o adipog?nica e osteog?nica. A neurodiferencia??o das c?lulas reprogramadas seguiu o m?todo descrito por Song et. al (2008) e foi avaliada por imunofluoresc?ncia. O crescimento populacional foi quantificado em hemocit?metro. Todas as c?lulas co-cultivadas mostraram capacidade de diferencia??o adipog?nica e osteog?nica. Ap?s o co-cultivo, as c?lulas passaram a transcrever o gene de pluripot?ncia KLF4. Diferen?as estatisticamente significativas nos par?metros ?rea, di?metro, densidade ?ptica e dimens?o fractal foram observadas por microscopia confocal nas c?lulas reprogramadas e neurodiferenciadas. A popula??o de c?lulas reprogramadas duplicou a cada tr?s dias at? o momento da adi??o do ultimo meio de neurodiferencia??o, quando as culturas tornaram-se quiescentes at? o final do per?odo de neurodiferecia??o. O contato em forma de co-cultivo dos fibroblastos com a fra??o mononuclear de cord?o umbilical por seis dias promoveu a reprograma??o dessas c?lulas a um est?gio com certa plasticidade, permitindo a indu??o posterior de neurodiferencia??o

Male fertility preservation in oncology: patients’ profile and clinical guidance importance = Preservação de fertilidade masculina em oncologia: perfil dos pacientes e importância da orientação clínica

OBJETIVO: Conhecer o perfil dos homens portadores de neoplasias malignas que preservaram sua fertilidade através da técnica de criopreservação de sêmen. METODOLOGIA: A amostra foi composta por 150 pessoas do sexo masculino que realizaram a criopreservação de sêmen no período de janeiro de 2014 a dezembro de 2017. Trata-se de um estudo quantitativo, descritivo, transversal onde foram utilizados dados secundários de um banco de dados de um Centro de Medicina Reprodutiva situado em Porto Alegre, Rio Grande do Sul. RESULTADOS: Os resultados demostraram que o perfil dos homens com câncer que realizaram a criopreservação de sêmen é, em sua maioria, de jovens adultos, solteiros, sem filhos, que estão preocupados em manter sua capacidade reprodutiva após a terapêutica oncológica. CONCLUSÃO: O conhecimento do perfil de pacientes que buscam a preservação dos gametas em casos de doenças oncológicas pode contribuir para o entendimento e possível sugestão de indicação pelos profissionais envolvidos neste tipo de abordage