Fonction et évolution de la régulation du gène Hoxa11 au cours du développement des membres chez les vertébrés

Le développement des membres nécessite la fonction des gènes des complexes HoxA et HoxD, qui sont exprimés de façon différentielle le long de l’axe proximo-distal, colinéaire avec leur position sur le chromosome. Cette stratégie régulatrice est essentielle afin de spécifier l’identité de chaque segment au cours du développement des membres. Précédemment, nous avons montré que l’expression des gènes HoxA dans la partie distale du membre dépend de plusieurs régions cis-régulatrices localisées à longue distance mais qui en 3D sont en contact avec les gènes Hoxa9 à Hoxa13. Cependant, Hoxa11 n’est pas exprimé dans la partie distale du membre et une série d’évidence indique qu’un mécanisme restreint son expression à la partie proximale du membre. Au cours de l’évolution, la transition de la nageoire au membre fût l’une des adaptations morphologiques cruciales lors du passage d’un mode de vie aquatique à un mode de vie terrestre. Alors que la grande majorité des tétrapodes actuels possèdent des membres pentadactyles, les données fossiles nous indiquent que les premiers tétrapodes étaient polydactyles. Dans le chapitre 2, nous avons montré qu’un changement dans la régulation du gène Hoxa11 au cours de l’évolution des vertébrés a vraisemblablement joué un rôle dans l’acquisition/stabilisation du stade pentadactyle chez les tétrapodes. Chez le poisson zèbre, les gènes hoxa11 et hoxa13 sont exprimés dans des domaines chevauchants dans la nageoire. En revanche, chez la souris, les domaines d’expression de Hoxa11 et Hoxa13 sont mutuellement exclusifs dans le bourgeon de membre. Hoxa11 est exprimé dans la partie proximale du bourgeon de membre (futur zeugopode) alors que Hoxa13 est exprimé dans la partie la plus distale (futur autopode). Nous avons montré que l’absence d’expression distale de Hoxa11 dans le bourgeon de membre est due à la présence d’une région régulatrice localisée dans l’intron de Hoxa11. Sous le contrôle des protéines HOXA13 et HOXD13, cette région régulatrice induit une transcription antisense, empêchant ainsi la transcription de Hoxa11 dans l’autopode. De plus nous avons montré que cette région régulatrice est absente chez le poisson zèbre, indiquant que son émergence a eu lieu lors de la transition de la nageoire au membre. Nous avons procédé à la délétion de cette région régulatrice chez la souris et observé une expansion distale du domaine d’expression de Hoxa11 dans le bourgeon de membre. Nous avons aussi montré que l’expression de Hoxa11 dans le domaine d’expression de Hoxa13 engendre la formation d’un membre polydactyle chez la souris (lignée de souris Prx1Cre ; RosaHoxa11/Hoxa11 ou A11KI). Ainsi, nos résultats indiquent que l’émergence d’une région régulatrice dans l’intron de Hoxa11, au cours de l’évolution, a permis la restriction du domaine d’expression de Hoxa11 à la région proximale du membre via un mécanisme de répression impliquant les protéines HOX13 et la transcription antisense. De plus, basé sur le phénotype de polydactylie observé après expression de Hoxa11 dans la région distale du bourgeon de membre, nos résultats suggèrent que l’évolution de la régulation de Hoxa11 (ayant entrainé la séparation des domaines d’expression de Hoxa11 et Hoxa13) a contribué à la transition des membres polydactyles des premiers tétrapodes aux membres pentadactyles des tétrapodes actuels. Dans le chapitre 3, nous avons étudié les causes moléculaires du développement de la polydactylie résultant de l’expression distale de Hoxa11 chez les souris A11KI. La polydactylie est souvent engendrée par l’expression ectopique de Shh dans la partie antérieure du bourgeon de membre. En revanche, nos résultats suggèrent que l’activation ectopique de Shh dans le bourgeon de membre des souris A11KI est une conséquence du développement de la polydactylie et non la cause. L’analyse du transcriptome des membres A11KI indique que l’expression distale de Hoxa11 a pour conséquence une diminution de l’expression des gènes donnant l’identité antérieure au bourgeon de membre ainsi qu’une antériorisation de l’expression de gènes « postérieurs ». Par ailleurs, nous avons montré que HOXA11 se lie à la région régulatrice de Grem1, gène dont l’expression est essentielle à la croissance du membre et la formation des doigts. Nos résultats indiquent que l’expression distale de Hoxa11 a pour conséquence un renforcement de la boucle SHH-GREM1-FGF qui est probablement la cause de la polydactylie des souris A11KI. De plus, notre étude du double mutant Xt/Xt ; A11KI, nous a permis de montrer que la polydactylie, résultant de l’expression distale de Hoxa11, est dépendante de Gli3. En effet les doubles mutants Xt/Xt ; A11KI développent des membres oligodactyles (nombre de doigts inférieur à 5). L’analyse moléculaire de ce double mutant nous a aussi permis d’établir que l’expression de Grem1 est affectée dans les bourgeons de membres, suggérant fortement que l’oligodactylie observée est le résultat d’une altération de la boucle SHH-GREM1-FGF, ayant pour conséquence un défaut d’expansion des cellules progénitrices des doigts. Ainsi pour conclure, nos résultats indiquent que l’expression distale de Hoxa11 contribue à la régulation de la boucle SHH-GREM1-FGF. En présence de Gli3, l’expression distale de Hoxa11 a une action positive sur l’expression de Grem1, entrainant le développement d’un membre polydactyle. En l’absence de Gli3, Hoxa11 distal réprime l’expression de Grem1 causant la formation d’un membre oligodactyle. Ce travail a permis une meilleure compréhension de l’importance des changements de régulation des gènes Hox survenus au cours de l’évolution et dans le développement des membres, notamment sur le contrôle du nombre de doigts et la mise en place de la pentadactylie chez les tétrapodes.Limb development requires the proper function of genes belonging to the HoxA and HoxD gene clusters, which are differentially expressed along the proximal-distal in a collinear fashion corresponding to their position along the chromosome. This regulatory strategy is essential to specify the identify of each limb segment during limb development. We have previously shown that the expression of HoxA genes in the distal limb relie on several remote transcriptional enhancers which come into 3D contact with the Hoxa9 to Hoxa13 genes. However, Hoxa11 is not expressed in the distal limb and multiple lines of evidence suggest that a mechanism exists to specifically prevent Hoxa11 expression in distal limb In the course of evolution, the fin to limb transition represents one of the most crucial morphological adaptations associated with the switch from an aquatic to terrestrial lifestyle. While most modern tetrapods are pentadactyl, fossil records indicate that the first tetrapods were polydactylous. In chapter 2, we have shown that a change in Hoxa11 gene regulation over the course of vertebrate evolution has likely played a role in the acquisition/stabilization of the pentadactyl state in tetrapods. In zebrafish, hoxa11 and hoxa13 genes are expressed in overlapping domains in the fin bud. On the other hand, in the mouse, Hoxa11 and Hoxa13 have mutually exclusive expression domains in the limb bud. Hoxa11 is expressed in the proximal region of the limb bud (future zeugopod) whereas Hoxa13 is expressed in the most distal region (future autopod). We have shown that the absence of Hoxa11 expression in the distal limb bud is due to the presence of an enhancer located in the intron of Hoxa11. Under the control of HOXA13 and HOXD13 proteins, this enhancer induces antisense transcription which consequently prevents the transcription of Hoxa11 in the autopod. Moreover, we have shown that this enhancer is absent in zebrafish, suggesting that its emergence occurred during the fin to limb transition. We proceeded to delete this enhancer in the mouse and observed a distal expansion of the Hoxa11 expression domain in the limb bud. We have also shown in the mouse that the expression of Hoxa11 in the Hoxa13 expressing domain of the limb bud results in the formation of a polydactylous limb (Prx1Cre ; RosaHoxa11/Hoxa11 or A11KI mouse line). As such, our results indicate that the emergence of this enhancer in the intron of Hoxa11, throughout evolution, has permitted the restriction of the Hoxa11 expression domain to the proximal region of the limb by a mechanism of repression implicating HOX13 proteins and the antisense transcription. In addition, based on the polydactyly phenotype resulting from the expression of Hoxa11 in the distal region of the limb, our results suggest that the evolution of Hoxa11 regulation (which separated the expression domains of Hoxa11 and Hoxa13) has contributed to the transition from polydactyly in early tetrapods to pentadactyly in extant tetrapods. In chapter 3, we have studied the molecular causes for the development of the polydactylous limb which results from the distal expression of Hoxa11 in the A11KI mouse line. Polydactyly is often caused by the ectopic expression of Shh in the anterior limb bud. To the contrary, our results suggest that ectopic Shh expression in limb buds of the A11KI mouse line is a consequence and not a cause of the polydactyly. Transcriptome analysis of A11KI limb buds has shown that the distal expression of Hoxa11 results in both the downregulation of genes involved in establishing the anterior identity of the limb bud as well as the anteriorization of genes posteriorly expressed. Moreover, we have shown that HOXA11 binds the regulatory region of Grem1, a gene whose expression is essential for limb bud growth and digit formation. Our results indicate that the distal expression of Hoxa11 reinforces the SHH-GREM1-FGF feedback loop which is probably the cause of polydactyly in the A11KI mouse line. Furthermore, studying the double mutant Xt/Xt ; A11KI allowed us to show that the polydactyly phenotype, resulting from distal Hoxa11 expression, is dependent on Gli3. Indeed, the double mutant Xt/Xt ; A11KI mice develop oligodactylous limbs (digit number less than 5). Molecular analysis of this double mutant allowed us to establish that expression of Grem1 is affected in limb buds and this strongly suggests that the observed oligodactyly is due to alteration of the SHH-GREM1-FGF feedback loop, which in turn causes a defect in expansion of the digit progenitor cells. Therefore, to conclude, our results demonstrate that the distal expression of Hoxa11 contributes to the regulation of the SHH-GREM1-FGF feedback loop. In the presence of Gli3, distal Hoxa11 expression positively regulates Grem1 expression, resulting in the development of a polydactylous limb. In the absence of Gli3, distal Hoxa11 represses Grem1 expression and causes the formation of an oligodactylous limb. This work has provided a better understanding of the importance of changes in Hox genes regulation acquired over the course of evolution and for limb development, notably for the control of digit number and to establish the pentadactyl state in modern tetrapods

HOX13-dependent chromatin accessibility underlies the transition towards the digit development program

Hox genes encode transcription factors (TFs) that establish morphological diversity in the developing embryo. The similar DNA-binding motifs of the various HOX TFs contrast with the wide-range of HOX-dependent genetic programs. The influence of the chromatin context on HOX binding specificity remains elusive. Here, we used the developing limb as a model system to compare the binding specificity of HOXA13 and HOXD13 (HOX13 hereafter), which are required for digit formation, and HOXA11, involved in forearm/leg development. We find that upon ectopic expression in distal limb buds, HOXA11 binds sites normally HOX13-specific. Importantly, these sites are loci whose chromatin accessibility relies on HOX13. Moreover, we show that chromatin accessibility specific to the distal limb requires HOX13 function. Based on these results, we propose that HOX13 TFs pioneer the distal limb-specific chromatin accessibility landscape for the proper implementation of the distal limb developmental program

Downregulation of Grem1 expression in the distal limb mesoderm is a necessary precondition for phalanx development

[Background]: The phalanges are the final skeletal elements to form in the vertebrate limb and their identity is regulated by signaling at the phalanx forming region (PFR) located at the tip of the developing digit ray. Here, we seek to explore the relationship between PFR activity and phalanx morphogenesis, which define the most distal limb skeletal elements, and signals associated with termination of limb outgrowth. [Results]: As Grem1 is extinguished in the distal chick limb mesoderm, the chondrogenesis marker Aggrecan is up-regulated in the metatarsals and phalanges. Fate mapping confirms that subridge mesoderm cells contribute to the metatarsal and phalanges when subridge Grem1 is down-regulated. Grem1 overexpression specifically blocks chick phalanx development by inhibiting PFR activity. PFR activity and digit development are also disrupted following overexpression of a Gli3 repressor, which results in Grem1 expression in the distal limb and downregulation of Bmpr1b. [Conclusions]: Based on expression and fate mapping studies, we propose that downregulation of Grem1 in the distal limb marks the transition from metatarsal to phalanx development. This suggests that downregulation of Grem1 in the distal limb mesoderm is necessary for phalanx development. Grem1 downregulation allows for full PFR activity and phalanx progenitor cell commitment to digit fate.National Institute of Child Health and Human Development, Grant/Award Number: HD03255

Distal Limb Patterning Requires Modulation of cis-Regulatory Activities by HOX13

The combinatorial expression of Hox genes along the body axes is a major determinant of cell fate and plays a pivotal role in generating the animal body plan. Loss of HOXA13 and HOXD13 transcription factors (HOX13) leads to digit agenesis in mice, but how HOX13 proteins regulate transcriptional outcomes and confer identity to the distal-most limb cells has remained elusive. Here, we report on the genome-wide profiling of HOXA13 and HOXD13 in vivo binding and changes of the transcriptome and chromatin state in the transition from the early to the late-distal limb developmental program, as well as in Hoxa13-/-; Hoxd13-/- limbs. Our results show that proper termination of the early limb transcriptional program and activation of the late-distal limb program are coordinated by the dual action of HOX13 on cis-regulatory modules