Interactions between Human Mesenchymal Stem Cells and Circulating Mononuclear Cells in Bone Regeneration

Despite the regenerative actions of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) and optimal reduction, ossification is delayed in almost 10% of all fractures, requiring surgical intervention. The gold standard for treating non-unions and delayed unions is a tissue auto- or allograft, which, nevertheless, can cause several specific problems, such as donor site morbidity, disease transmission and immunological rejection. To overcome these problems, tissue-engineered bone grafts are being developed. They are sensitive to hypoxia, however, and can quickly undergo apoptosis in the host tissue. Therefore, improved methods for inducing proper angiogenesis and tissue endothelialisation are vital. It is known that peripheral blood mononuclear cells (PB-MNCs) include endothelial progenitor cells (EPCs), which are responsible for neoangiogenesis in adult tissues, and these cells have been suggested as a potential source of bone graft vascularization. The aims of this study were to utilize the interactions between human BM-MSCs and PB-MNCs: Firstly, to develop a method of endothelialising an MSC-culture; secondly, to optimize the differentiation capacity of MSCs into bone-forming osteoblasts; and, thirdly, to characterize the cellular and molecular factors essential in these processes. The results showed that a co-culture of human MSCs and MNCs led to a powerful endothelial cell differentiation and tubular structure formation, even without any exogenous growth factors. Furthermore, the osteoblastic differentiation and bone formation in the co-culture setting was more efficient than in monocultures and was further potentiated when cultures were supplemented with exogenous VEGF. Finally, it was shown that both endothelial and pericyte differentiation were induced in MSC-MNC co-cultures and that the expression profile of various proangiogenic factors was dependent on culture conditions. In conclusion, this study demonstrates that the key events that stimulate successful bone healing can be induced in co-cultures of human MSCs and MNCs. This co-culture method can be used to enhance osteoblast, endothelial cell and pericyte differentiation and could therefore have potential in the further development of tissue-engineered bone grafts.Ihmisen mesenkymaalisten kantasolujen ja verenkierron mononukleaaristen solujen vuorovaikutukset luunmurtuman paranemisessa Luuytimen mesenkymaaliset kantasolut erilaistuvat luuta muodostaviksi osteoblasteiksi eri signaalien ohjaamina. Ne toimivat kantasolureservinä, mutta myös tärkeinä tekijöinä kudosten uusiutumisessa, kuten murtuman paranemisessa. Solujen toiminnasta ja murtuman optimaalisesta reduktiosta huolimatta n. 10 %:ssa murtumia luutuminen viivästyy, jolloin tarvitaan luusiirrettä. Tähän liittyy kuitenkin erityisiä ongelmia, kuten luovuttajakudoksen vaurioita ja immunologisia hyljintäreaktioita, minkä vuoksi onkin pyritty kehittämään kudosteknologisesti valmistettuja siirteitä. Nämä ovat kuitenkin herkkiä hapenpuutteelle, minkä vuoksi tarvitaan soluviljelymenetelmiä, joilla voitaisiin tehostaa verisuonten uudismuodostusta kudossiirteessä. Verenkierron mononukleaaristen solujen joukossa on verisuonten uudismuodostukseen osallistuvia endoteelisolujen esiasteita. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena olikin edellä mainittujen solujen vuorovaikutuksia hyödyntämällä tehostaa mesenkymaalisten kantasolujen erilaistumiskykyä luuta muodostaviksi soluiksi ja saada aikaan hapensaannin kannalta keskeinen soluviljelmän endotelisaatio. Lisäksi tavoitteena oli karakterisoida näissä prosesseissa keskeisiä molekulaarisia signaalitekijöitä. Tässä työssä osoitettiin, että ihmisen mesenkymaaliset kantasolut saivat aikaan mononukleaaristen solujen erilaistumisen juostemaisia rakenteita muodostaviksi endoteelisoluiksi ilman lisättyjä kasvutekijöitä. Työssä todettiin myös, että mesenkymaalisten kantasolujen ja mononukleaaristen solujen yhteisviljelmissä luun muodostus on tehokkaampaa kuin yksittäisviljelmissä. Lisäksi osoitettiin, että luunmuodostus tehostui edelleen, kun yhteisviljelmään lisättiin verisuonen endoteelisolukasvutekijää (VEGF). Yhteisviljelmässä tapahtui myös sekä endoteelisolujen että perisyyttien erilaistumista. Molekulaarisia mekanismeja ja eri signaalitekijöitä tutkittiin tarkemmin Transwell-kalvomenetelmää sekä kvantitatiivista RT-PCR:ää käyttäen ja todettiin, että proangiogeeniset tekijät ilmentyvät eri tavoin eri viljelyolosuhteissa. Tässä työssä kehitetyssä soluviljelymallissa pystyttiin siis saamaan aikaan monet murtuman paranemisen kannalta keskeiset solutapahtumat, ja se avaakin uusia näkökulmia tulevaisuuden kudosteknologisesti valmistettujen luusiirteiden kehitystyölle.Siirretty Doriast

Angiogenic potential of human mesenchymal stromal cell and circulating mononuclear cell cocultures is reflected in the expression profiles of proangiogenic factors leading to endothelial cell and pericyte differentiation.

Endothelial progenitors found among the peripheral blood (PB) mononuclear cells (MNCs) are interesting cells for their angiogenic properties. Mesenchymal stromal cells (MSCs) in turn can produce proangiogenic factors as well as differentiate into mural pericytes, making MSCs and MNCs an attractive coculture setup for regenerative medicine. In this study, human bone marrow-derived MSCs and PB-derived MNCs were cocultured in basal or osteoblastic medium without exogenously supplied growth factors to demonstrate endothelial cell, pericyte and osteoblastic differentiation. The expression levels of various proangiogenic factors, as well as endothelial cell, pericyte and osteoblast markers in cocultures were determined by quantitative polymerase chain reaction. Immunocytochemistry for vascular endothelial growth factor receptor-1 and α-smooth muscle actin as well as staining for alkaline phosphatase were performed after 10 and 14 days. Messenger ribonucleic acid expression of endothelial cell markers was highly upregulated in both basal and osteoblastic conditions after 5 days of coculture, indicating an endothelial cell differentiation, which was supported by immunocytochemistry for vascular endothelial growth factor receptor-1. Stromal derived factor-1 and vascular endothelial growth factor were highly expressed in MSC-MNC coculture in basal medium but not in osteoblastic medium. On the contrary, the expression levels of bone morphogenetic protein-2 and angiopoietin-1 were significantly higher in osteoblastic medium. Pericyte markers were highly expressed in both cocultures after 5 days. In conclusion, it was demonstrated endothelial cell and pericyte differentiation in MSC-MNC cocultures both in basal and osteoblastic medium indicating a potential for neovascularization for tissue engineering applications

Evidence for the in vivo existence and mobilization of myeloid angiogenic cells and pericyte-like cells in wound patients after skin grafting

Myeloid angiogenic cells (MACs) and pericyte-like cells, derived from peripheral blood mononuclear cells (MNCs) by in vitro culturing, are suggested as relevant cell types for angiogenesis and tissue repair. However, the in vivo existence and relevance of these cells has so far remained unknown. Our aim was thus to study, if MACs and pericyte-like cells exist in circulation during the wound healing of skin graft patients, and to evaluate the cellular features of wound repair. MNCs were isolated from blood samples of healthy controls (n = 4) and patients with a traumatic full thickness skin defect (n = 4) before skin grafting and on postoperative days 1 and 6. The numbers of circulating CD14+ CD45+ CD31+ CD34- MACs and CD14+ CD45+ NG2+ pericyte-like cells were assessed by flow cytometry, and gene expression of various pro-angiogenic factors was analysed by qPCR. Wound bed biopsies were taken on postoperative days 6 and 14, and MAC (CD31, CD14 and CD45) and pericyte-related markers (NG2 and PDGFRβ) were histologically studied. MACs and pericyte-like cells were detected in both healthy controls and in patients. Before reconstruction, on average 18% of all circulating MNCs represented MACs and 2% pericyte-like cells in wound patients. Number of MACs significantly increased 1.1-1.7-fold in all patients 1 day after skin grafting (p </p

Evidence for the in vivo existence and mobilisation of myeloid angiogenic cells and pericyte-like cells in wound patients after skin grafting

Myeloid angiogenic cells (MACs) and pericyte-like cells, derived from peripheral blood mononuclear cells (MNCs) by in vitro culturing, are suggested as relevant cell types for angiogenesis and tissue repair. However, the in vivo existence and relevance of these cells has so far remained unknown. Our aim was thus to study, if MACs and pericyte-like cells exist in circulation during the wound healing of skin graft patients, and to evaluate the cellular features of wound repair. MNCs were isolated from blood samples of healthy controls (n = 4) and patients with a traumatic full thickness skin defect (n = 4) before skin grafting and on postoperative days 1 and 6. The numbers of circulating CD14+CD45+CD31+CD34− MACs and CD14+CD45+NG2+ pericyte-like cells were assessed by flow cytometry, and gene expression of various pro-angiogenic factors was analysed by qPCR. Wound bed biopsies were taken on postoperative days 6 and 14, and MAC (CD31, CD14 and CD45) and pericyte-related markers (NG2 and PDGFRβ) were histologically studied. MACs and pericyte-like cells were detected in both healthy controls and in patients. Before reconstruction, on average 18% of all circulating MNCs represented MACs and 2% pericyte-like cells in wound patients. Number of MACs significantly increased 1.1−1.7-fold in all patients 1 day after skin grafting (p < 0.01). In addition, histological analysis demonstrated effective vascularization of skin grafts, as well as presence of pericytes, and CD14 and CD45 expressing myeloid cells during wound healing. In conclusion, our data shows, for the first time, the presence and mobilisation of MACs and pericyte-like cells in human circulation.publishedVersionPeer reviewe

A distinctive DNA methylation pattern in insufficient sleep

Short sleep duration or insomnia may lead to an increased risk of various psychiatric and cardio-metabolic conditions. Since DNA methylation plays a critical role in the regulation of gene expression, studies of differentially methylated positions (DMPs) might be valuable for understanding the mechanisms underlying insomnia. We performed a cross-sectional genome-wide analysis of DNA methylation in relation to self-reported insufficient sleep in individuals from a community-based sample (79 men, aged 39.3 +/- 7.3), and in relation to shift work disorder in an occupational cohort (26 men, aged 44.9 +/- 9.0). The analysis of DNA methylation data revealed that genes corresponding to selected DMPs form a distinctive pathway: "Nervous System Development" (FDR P value <0.05). We found that 78% of the DMPs were hypomethylated in cases in both cohorts, suggesting that insufficient sleep may be associated with loss of DNA methylation. A karyoplot revealed clusters of DMPs at various chromosomal regions, including 12 DMPs on chromosome 17, previously associated with Smith-Magenis syndrome, a rare condition comprising disturbed sleep and inverse circadian rhythm. Our findings give novel insights into the DNA methylation patterns associated with sleep loss, possibly modifying processes related to neuroplasticity and neurodegeneration. Future prospective studies are needed to confirm the observed associations.Peer reviewe

Work stress and risk of cancer: meta-analysis of 5700 incident cancer events in 116 000 European men and women

Peer reviewe

Job Strain and Alcohol Intake: A Collaborative Meta- Analysis of Individual-Participant Data from 140 000 Men and Women

Abstract Background: The relationship between work-related stress and alcohol intake is uncertain. In order to add to the thus far inconsistent evidence from relatively small studies, we conducted individual-participant meta-analyses of the association between work-related stress (operationalised as self-reported job strain) and alcohol intake

Job Strain and Alcohol Intake: A Collaborative Meta-Analysis of Individual-Participant Data from 140 000 Men and Women

Peer reviewe

Mesenkymaalisten kantasolujen induktio luuta muodostaviksi osteoblasteiksi biomateriaalilla

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Luu on hyvin uusiutumiskykyinen kudos. Luusolut erilaistuvat kantasoluistaan erilaisten signaalien ohjaamina. Tiedetään kuitenkin useita patologisia tiloja, joissa luun kudosteknologia on tarpeen. Luun kudosteknologiassa on lähiaikoina tutkittu paljon synteettisiä biohajoavia polymeerejä polylaktidia (PLA), polyglykolidia (PGA) ja näiden kopolymeeria poly(laktidi-ko-glykolidia) (PLGA). Tässä tutkimuksessa käytimme PLGA:a sekä komposiittimateriaalia PLGA-bioaktiivinen lasi. Seurasimme kuinka mesenkymaaliset kantasolut tarttuivat, proliferoituivat ja erilaistuivat näillä biomateriaaleilla ja tutkimme oliko polymeerien NaOH-pintakäsittelyllä vaikutusta solujen tarttumiseen. Teimme lisäksi mesenkymaalisille kantasoluille esikäsittelyjä fibroblastikasvutekijä 2:lla ja 8:lla (FGF-2 ja FGF-8), luun morfogeneettinen proteiini 4:llä (BMP-4) ja lisäkilpirauhashormonilla ja tutkimme onko niillä luun muodostusta lisäävää vaikutusta in vitro. Tutkimme myös vaikuttaako BMP-4 solujen erilaistumiseen annosteltuna biomateriaalin päälle solujen istuttamisvaiheessa. Menetelmät: Solujen kasvatus tapahtui perinteisin soluviljelymetodein staattisessa ympäristössä. Mesenkymaalisia kantasoluja kasvatettiin seerumirikkaassa α-MEM-elatusnesteessä ilman kasvutekijöitä ennen kokeiden aloitusta. Hiiren solut olivat peräisin NMRI-hiirten luuytimestä ja ihmisen solut olivat rikastettu luuydinnäytteestä. Osteoblastien erilaistumista ja luunmuodostusta karakterisoitiin eri värjäysmenetelmin tiettyjen viljelyjaksojen (3-4 viikon) jälkeen. Käytettyjä värjäysmenetelmiä olivat värjäys alkaalisen fosfataasin (ALP) suhteen, sekä von Kossa-värjäys. Tutkimustulokset: Molemmat biomateriaalityypit osoittautuivat soluyhteensopiviksi. FGF-2- ja FGF-8 -esikäsittelyt lisäsivät mesenkymaalisten kantasolujen proliferaatiota ja osteogeenisyyttä voimakkaasti, kun taas BMP-4:llä ja lisäkilpirauhashormonilla ei ollut vaikutusta kontrolliin verrattuna. NaOH-käsittelyllä ei näyttänyt olevan merkittävää vaikutusta mesenkymaalisten kantasolujen tarttumiseen ja osteogeenisyyteen. BMP-4 lisättynä biomateriaaliin solujen istutusvaiheessa ei stimuloinut solujen erilaistumista osteoblasteiksi tässä tutkimuksessa. Johtopäätökset: FGF-2 ja FGF-8 lisäävät mesenkymaalisen kantasolun proliferaatio- ja erilaistumiskykyä. Ne ovat optimaalisia kasvutekijöitä lisättynä viljelmään hieman ennen osteoblasti-induktiota. BMP-4 ja lisäkilpirauhashormoni eivät ole optimaalisia tekijöitä annettuna viljelmän alkuvaiheessa, vaan mahdollisesti vaikuttavat osteoblastien erilaistumiseen ja luun muodostukseen myöhemmässä vaiheessa kuin FGF:t

Mesenkymaalisten kantasolujen induktio luuta muodostaviksi osteoblasteiksi biomateriaalilla

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Luu on hyvin uusiutumiskykyinen kudos. Luusolut erilaistuvat kantasoluistaan erilaisten signaalien ohjaamina. Tiedetään kuitenkin useita patologisia tiloja, joissa luun kudosteknologia on tarpeen. Luun kudosteknologiassa on lähiaikoina tutkittu paljon synteettisiä biohajoavia polymeerejä polylaktidia (PLA), polyglykolidia (PGA) ja näiden kopolymeeria poly(laktidi-ko-glykolidia) (PLGA). Tässä tutkimuksessa käytimme PLGA:a sekä komposiittimateriaalia PLGA-bioaktiivinen lasi. Seurasimme kuinka mesenkymaaliset kantasolut tarttuivat, proliferoituivat ja erilaistuivat näillä biomateriaaleilla ja tutkimme oliko polymeerien NaOH-pintakäsittelyllä vaikutusta solujen tarttumiseen. Teimme lisäksi mesenkymaalisille kantasoluille esikäsittelyjä fibroblastikasvutekijä 2:lla ja 8:lla (FGF-2 ja FGF-8), luun morfogeneettinen proteiini 4:llä (BMP-4) ja lisäkilpirauhashormonilla ja tutkimme onko niillä luun muodostusta lisäävää vaikutusta in vitro. Tutkimme myös vaikuttaako BMP-4 solujen erilaistumiseen annosteltuna biomateriaalin päälle solujen istuttamisvaiheessa. Menetelmät: Solujen kasvatus tapahtui perinteisin soluviljelymetodein staattisessa ympäristössä. Mesenkymaalisia kantasoluja kasvatettiin seerumirikkaassa α-MEM-elatusnesteessä ilman kasvutekijöitä ennen kokeiden aloitusta. Hiiren solut olivat peräisin NMRI-hiirten luuytimestä ja ihmisen solut olivat rikastettu luuydinnäytteestä. Osteoblastien erilaistumista ja luunmuodostusta karakterisoitiin eri värjäysmenetelmin tiettyjen viljelyjaksojen (3-4 viikon) jälkeen. Käytettyjä värjäysmenetelmiä olivat värjäys alkaalisen fosfataasin (ALP) suhteen, sekä von Kossa-värjäys. Tutkimustulokset: Molemmat biomateriaalityypit osoittautuivat soluyhteensopiviksi. FGF-2- ja FGF-8 -esikäsittelyt lisäsivät mesenkymaalisten kantasolujen proliferaatiota ja osteogeenisyyttä voimakkaasti, kun taas BMP-4:llä ja lisäkilpirauhashormonilla ei ollut vaikutusta kontrolliin verrattuna. NaOH-käsittelyllä ei näyttänyt olevan merkittävää vaikutusta mesenkymaalisten kantasolujen tarttumiseen ja osteogeenisyyteen. BMP-4 lisättynä biomateriaaliin solujen istutusvaiheessa ei stimuloinut solujen erilaistumista osteoblasteiksi tässä tutkimuksessa. Johtopäätökset: FGF-2 ja FGF-8 lisäävät mesenkymaalisen kantasolun proliferaatio- ja erilaistumiskykyä. Ne ovat optimaalisia kasvutekijöitä lisättynä viljelmään hieman ennen osteoblasti-induktiota. BMP-4 ja lisäkilpirauhashormoni eivät ole optimaalisia tekijöitä annettuna viljelmän alkuvaiheessa, vaan mahdollisesti vaikuttavat osteoblastien erilaistumiseen ja luun muodostukseen myöhemmässä vaiheessa kuin FGF:t