Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons using microbial consortia for bioremediation of contaminated soils

Orientador: Lucia Regina DurrantTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: A biodegradação de poluentes de petróleo em um solo contaminado foi acompanhada neste estudo, avaliando o comportamento da microbiota do solo durante a utilização de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) como fontes de carbono. Através da biomassa microbiana, da taxa de respiração no solo, bem como do quociente metabólico (eficiência em degradar os compostos recalcitrantes em questão), foi possível uma avaliação do impacto na microbiota nativa do solo contaminado e nos diferentes microcosmos bioaumentados com os consórcios de bactérias, fungos, e uma mistura destes consórcios por 12 semanas. Tanto a microbiota nativa quanto os solos bioaumentados demonstraram uma rápida resposta à adaptação neste ambiente contaminado pelo aumento da biomassa e das taxas metabólicas. Durante o período de biodegradação dos HPAs, valores de evolução de CO2 foram diminuindo e a biomassa se manteve em crescimento estável, indicando menos gasto de energia para os microrganismos sobreviverem neste solo impactado, como resposta à boa competitividade e eficiência da microbiota nativa e bioaumentada. A biodegradação dos HPAs e a presença de metabólitos intermediários foram também avaliados, apresentando uma rápida redução das concentrações dos HPAs de baixo peso molecular (menores que 4 anéis aromáticos) em comparação com os de alto peso molecular, devido à sua biodisponibilidade e alta atividade microbiana de degradação. Todavia, a bioaumentação não demonstrou ser melhor que a microbiota nativa na degradação dos HPAs. É provável que o mecanismo de cooperação metabólica por co-metabolismo tenha sido realizado pela comunidade do solo, uma vez que vários HPAs complexos foram degradados. Diversos estudos apontam a presença de HPAs de menor peso molecular e seus respectivos produtos como indutores da degradação dos HPAs de maior peso molecular. Os metabólitos intermediários produzidos foram assimilados pelos microrganismos em processo cooperativo no solo, sendo responsáveis pela indução de enzimas e suas respectivas vias degradativas. Os distúrbios causados no solo pela poluição com HPAs normalmente estimulam o crescimento de microrganismos capazes de sobreviver nestes compostos, causando mudanças na estrutura microbiana do solo devido às suas adaptações nos processos co-metabólicos para a manutenção da comunidade. Neste trabalho, um solo impactado com HPAs, estocado por vários anos sob refrigeração foi analisado quanto à habilidade da microbiota nativa em crescer em alguns HPAs, individualmente, ou ainda em mistura complexa. Perfis moleculares de microbiota foram observados pela técnica de PCR-DGGE utilizando fragmentos do gene RNA ribossômico 16S durante 4 semanas. O número de bandas observadas foi interpretado como os membros dominantes na comunidade, e os diferentes perfis mostraram diferentes dinâmicas de degradação dos HPAs em meio contendo ou não fatores essenciais de crescimento (micronutrientes e vitaminas). Espécies ativas metabolicamente mostraram-se predominantes na interação com a comunidade e na cooperação catabólica. Após enriquecimento do solo original por 6 meses, apenas duas bandas foram visulizadas em gel, correspondendo à duas colônias morfologicamente diferentes isoladas em meio ágar, sendo identificadas como sendo do gênero Pseudomona, mais provavelmente Pseudomonas stutzeri (98% de similaridade). Esta espécie possui alta capacidade de transformação natural no solo, gerando mutantes. Diferenças genéticas entre as colônias de P. stutzeri foram confirmadas por PFGE, as quais apresentaram bandas para os genes catabólicos nahA-dioxigenase, catecol-1,2 e 2,3-dioxigenases, responsáveis por codificar as respectivas enzimas atuantes nas principais vias metabólicas de degradação dos HPAsAbstract: The biodegradation of petroleum derivatives in a contaminated soil was evaluated in this study monitoring the behavior of the soil microbiota when using polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) as carbon sources. Analyzing C-biomass, respiration rates (CO2 evolution) and metabolic quotient (which means the efficiency in degrading PAHs), it was possible to evaluate the impact of the contaminated soil in the native microbiota and soil bioaugmented with bacterial and fungal consortia or a mixture of these consortia for 12 weeks in microcosms. Even the native microbiota or the bioaugmented soils performed a rapid response regarding to their adaptation into contaminated environment due to the increase of biomass and respiration rates. During the PAH biodegradation period, CO2 evolution values remained steady, indicating less loss of energy to the survival microorganism into the impacted soil, a good competitiveness, and also an efficiency of both native and bioaugmented populations. The biodegradation of PAHs and the production of metabolic intermediates were assessed, and low-molecular-weight (LMW) PAHs (less than 4 rings) had fast reduction in their concentrations comparing with the high-molecular-weight (HMW) PAHs, probably due to their bioavailability and the high microbial activity. Bioaugmentations were not better than native microbiota in the PAHs degradation performances, and it is believed that the cooperative mechanism under co-metabolism could be responsible for the degradation of HMW-PAHs. Metabolic intermediates were assimilated by microorganisms in a cooperative process, inducing some key-catabolic pathways enzymes. The pollution of soil by PAHs could stimulate the growth of organisms capable of surviving in the presence of these compounds, changing the soil microbial structure due a catabolic adaptation process. In this study, another PAH-impacted soil, collected from a manufacturing gas plant and stored for several years was analyzed regarding to the remained ability of the native microbiota to grow on individual PAHs or on its mixtures. Molecular profiles of the microbial community were observed using PCR-DGGE of the 16S rDNA fragment for 4 weeks. The number of bands was interpretated as dominant members into the community, and differences in profiles showed different PAH degradation dynamics in mineral medium with or without micronutrients and vitamins. Catabolically activated species were predominant in the community, and after several enrichment steps for 6 months, only two bands were observed in DGGE, corresponding to two colonies showing morphological differences, identified as Pseudomonas genus, very close to Pseudomonas stutzeri (98% of similarity). This specie has high capacity of natural transformation in soil, generating some mutants. Genetical differences were found between colonies using PFGE, and the presence of catabolic genes as nahA-dioxygenase, cathecol-1,2- and 2,3- dioxygenases were confirmed by PCR products in agarose gel electrophoresesDoutoradoDoutor em Ciência de Alimento

Bagaço de cana: fonte para produção de enzimas ligninocelulolíticas

The production of ligninocelullolytic enzymes by Pleurotus ssp was evaluated by submerged fermentation on sugarcane bagasse. Among these enzymes, Laccase and Manganeseperoxidase have been detached. The most producer of Laccase were Pleurotus sp BCCB068, reaching activity of 6,23 U/L on the 15th day and Pleurotus sajor-caju, 3,52 U/L on the 10th day of cultivation. Manganese-peroxidase was detected in the medium with Pleurotus sp BCCB068 (31.56 U/L) on the 5th day and 23.58 U/L with Pleurotus tailandia on the 15th day of incubation. The production of celulollityc enzymes was not significative. These results showed that sugarcane bagasse residues are feasible source of ligninolytic enzymes and have applicability in the biotechnological field. Key words: biodegradation, enzymes, recycling.A produção de enzimas lignocelulolíticas através de Pleurotus ssp foi estudada em fermentação submersa utilizando bagaço de cana. Entre estas enzimas, lacase e manganês peroxidase foram detectadas. Os maiores produtores de lacase foram as linhagem Pleurotus sp BCCB068, com 6,23 U/L no 15º dia e a linhagem Pleurotus sajor-caju, com 3,52 U/L no 10º dia de incubação. Manganês peroxidase foi detectada com Pleurotus sp BCCB068 (31.56 U/L) no 5º dia e 23,58 U/L com Pleurotus tailandia no 15º dia de incubação. A produção de enzimas celulolíticas não foi significativa. Estes resultados mostram que o resíduo de bagaço de cana é uma possível fonte de enzimas ligninolíticas e possui aplicabilidade na área biotecnológica. Palavras-chave: biodegradação, enzimas, reciclagem

Degradation of lignosulfonic and tannic acids by ligninolytic soil fungi cultivated under icroaerobic conditions

Soil fungi were evaluated regarding their ability to degrade lignin-related compounds by producing the ligninolytic enzymes. Lignosulfonic and tannic acids were used as sole carbon sources during 30 days under microaerobic and very-low-oxygen conditions. The fungi produced lignin-peroxidase, manganese-peroxidase and laccase . Expressive degradations was observed by C18 reversed-phase HPLC, indicating the biodegradation potential of these fungi, showing more advantages than obligate anaerobes to decontaminate the environment when present naturally.Fungos isolados de solo foram avaliados quanto à habilidade em degradarem compostos derivados de lignina pela produção de enzimas ligninolíticas. Os ácidos lignosulfônicos e tânico foram usados separadamente como única fonte de carobono para cultivo dos fungos em 30 dias sob condições microaeróbias. Os fungos foram capazes de crescer e usar tais compostos como fonte de carbono e mostraram produção de lignina-peroxidase, manganês-peroxidase e lacase. Degradações expressivas dos ácidos lignosulfônico e tânico foram verificadas por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE), indicando grande potencial de uso em processos de biorremediação de macromoléculas aromáticas similares à lignina em ambientes naturais sob condições baixas de oxigenação.693699Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP

BIODEGRADAÇÃO DE CARBOXIMETILCELULOSE UTILIZANDO FUNGO PLEUROTUS: PRODUÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS E AÇÚCARES FERMENTESCÍVEIS PARA A INDÚSTRIA DE ETANOL

In this present study, white-rot fungi Pleurotus sp BCCB068 were evaluated as regards the degradation of the cellulose matrix with production of enzymes using submerged fermentation.The crude extract obtained from the fungi growths was used as enzyme source for carboxymethylcellulose hydrolysis, reached 54.8% of degradation during 0-60 minutes of reaction period, with formation of oligosaccharides, as well as several sugar monomers (cellobiose, mannose, maltose, fructose and glucose). These results indicate great potential of these fungal strains to degrade cellulosic materials and produce sugar monomers to be used in ethanol industries.No presente estudo, o fungo Pleurotus sp BCCB068 foi utilizado para a degradação de matriz de celulose para produção de enzimas usando fermentação submersa. O hidrolisado obtido foi aplicado como fonte enzimática para a hidrolise de carboximetilcelulose, onde foi degradado 54,8%, durante o período de 0 a 60 minutos de hidrolise, formando oligossacarídeos, como também vários monômeros de açúcar (celobiose, manose, maltose, frutose e glicose). Estes resultados indicaram  um grande potencial deste fungo para degradar materiais celulósicos e na obtenção de monômeros de açúcar para utilização nas industrias de etanol

Degradation of lignosulfonic and tannic acids by ligninolytic soil fungi cultivated under icroaerobic conditions

Soil fungi were evaluated regarding their ability to degrade lignin-related compounds by producing the ligninolytic enzymes. Lignosulfonic and tannic acids were used as sole carbon sources during 30 days under microaerobic and very-low-oxygen conditions. The fungi produced lignin-peroxidase, manganese-peroxidase and laccase . Expressive degradations was observed by C18 reversed-phase HPLC, indicating the biodegradation potential of these fungi, showing more advantages than obligate anaerobes to decontaminate the environment when present naturally