Étude de la biodiversité microbienne associée aux champignons mycorhiziens arbusculaires dans des sites hautement contaminés par des hydrocarbures pétroliers

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) forment un groupe de champignons qui appartient à l'embranchement des Gloméromycètes (Glomeromycota). Les CMA forment des associations symbiotiques, connus sous le nom des mycorhizes à arbuscules avec plus de 80 % des plantes vasculaires terrestres. Une fois que les CMA colonisent les racines de plantes, ils améliorent leurs apports nutritionnels, notamment le phosphore et l'azote, et protègent les plantes contre les différents pathogènes du sol. En contrepartie, les plantes offrent un habitat et les ressources de carbone nécessaires pour le développement et la reproduction des CMA. Des études plus récentes ont démontré que les CMA peuvent aussi jouer des rôles clés dans la phytoremédiation des sols contaminés par les hydrocarbures pétroliers (HP) et les éléments traces métaliques. Toutefois, dans les écosystèmes naturels, les CMA établissent des associations tripartites avec les plantes hôtes et les microorganismes (bactéries et champignons) qui vivent dans la rhizosphère, l'endosphère (à l'intérieur des racines) et la mycosphère (sur la surface des mycéliums des CMA), dont certains d'entre eux jouent un rôle dans la translocation, l’immobilisation et/ou la dégradation des polluants organiques et inorganiques présents dans le sol. Par conséquent, la diversité des CMA et celle des microorganismes qui leur sont associés sont influencées par la concentration et la composition des polluants présents dans le sol, et aussi par les différents exsudats sécrétés par les trois partenaires (CMA, bactéries et les racines de plantes). Cependant, la diversité des CMA et celle des microorganismes qui leur sont associés demeure très peu connue dans les sols contaminés. Les interactions entre les CMA et ces microorganismes sont aussi méconnus aussi bien dans les aires naturelles que contaminées. Dans ce contexte, les objectifs de ma thèse sont: i) étudier la diversité des CMA et les microorganismes qui leur sont associés dans des sols contaminés par les HP, ii) étudier la variation de la diversité des CMA ainsi que celle des microorganismes qui leur sont associés par rapport au niveau de concentration en HP et aux espèces de plantes hôtes, iii) étudier les correlations (covariations) entre les CMA et les microorganismes qui leur sont associés et iv) comparer les communautés microbiennes trouvées dans les racines et sols contaminés par les HP avec celles trouvées en association avec les CMA. Pour ce faire, des spores et/ou des propagules de CMA ont été extraites à partir des racines et des sols de l'environnement racinaire de trois espèces de plantes qui poussaient spontanément dans trois bassins de décantation d'une ancienne raffinerie de pétrole située dans la Rive-Sud du fleuve St-Laurent, près de Montréal. Les spores et les propagules collectées, ainsi que des échantillons du sol et des racines ont été soumis à des techniques de PCR (nous avons ciblés les genes 16S de l'ARNr pour bactéries, les genes 18S de l'ARNr pour CMA et les régions ITS pour les autres champignons), de clonage, de séquençage de Sanger ou de séquençage à haut débit. Ensuite, des analyses bio-informatiques et statistiques ont été réalisées afin d'évaluer les effets des paramètres biotiques et abiotiques sur les communautés des CMA et les microorganismes qui leur sont associés. Mes résultats ont montré une diversité importante de bactéries et de champignons en association avec les spores et les propagules des CMA. De plus, la communauté microbienne associée aux spores des CMA a été significativement affectée par l'affiliation taxonomique des plantes hôtes et les niveaux de concentration en HP. D'autre part, les corrélations positives ou négatives qui ont été observées entre certaines espèces de CMA et microorganismes suggérèrent qu’en plus des effets de la concentration en HP et l'identité des plantes hôtes, les CMA peuvent aussi affecter la structure des communautés microbiennes qui vivent sur leurs spores et mycéliums. La comparaison entre les communautés microbiennes identifiées en association avec les spores et celles identifiées dans les racines montre que les communautés microbiennes recrutées par les CMA sont différentes de celles retrouvées dans les sols et les racines. En conclusion, mon projet de doctorat apporte de nouvelles connaissances importantes sur la diversité des CMA dans un environnement extrêmement pollué par les HP, et démontre que les interactions entre les CMA et les microorganismes qui leur sont associés sont plus compliquées que ce qu’on croyait précédemment. Par conséquent, d'autres travaux de recherche sont recommandés, dans le futur, afin de comprendre les processus de recrutement des microorganismes par les CMA dans les différents environnements.Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are an important soil fungal group that belongs to the phylum Glomeromycota. AMF form symbiosic associations known as arbuscular mycorrhiza with more than 80% of vascular plants on earth. Once AMF colonize plant roots, they promote nutrient uptake, in particular phosphorus and nitrogen, and protect plants against soil-borne pathogens. In turn, plants provide AMF with carbon resources and habitat. Furthermore, more recent studies demonstrated that AMF may also play key roles in phytoremediation of soils contaminated with petroleum hydrocarbon pollutants (PHP) and trace elements. Though, in natural ecosystems, AMF undergo tripartite associations with host plants and micoorganisms (Bacteria and Fungi) living in rhizosphere (the narrow region of soil surounding the plant roots), endosphere (inside roots) and mycosphere (on the surface AMF mycelia), which some of them play a key role on translocation, immobilization and/or degradation of organic and inorganic pollutants. Consequently, the diversity and community structures of AMF and their associated microorganisms are influenced by the composition and concentration of pollutants and exudates released by the three partners (AMF, bacteria and plant roots). However, little is known about the diversity of AMF and their associated microorganisms in polluted soils and the interaction between AMF and these microorganisms remains poorly understood both in natural and contaminated areas. In this context, the objectives of my thesis were to: i) study the diversity of AMF and their associated microorganisms in PHP contaminated soils, ii) study the variation in diversity and community structures of AMF and their associated microorganisms across plant species identity and PHP concentrations, iii) study the correlations (covariations) between AMF species and their associated microorganisms and iv) compare microbial community structures of PHP contaminated soils and roots with those associated with AMF spores in order to determine if the microbial communities shaped on the surface of AMF spores and mycelia are different from those identified in soil and roots. To do so, AMF spores and/or their intraradical propagules were harvested from rhizospheric soil and roots of three plant species growing spontaneously in three distinct waste decantation basins of a former petrochemical plant located on the south shore of the St-Lawrence River, near Montreal. The harvested spores and propagules, as well as samples of soils and roots were subjected to PCR (we target 16S rRNA genes for bacteria, 18S rRNA genes for AMF and ITS regions for the other fungi), cloning, Sanger sequencing or 454 high throughput sequencing. Then, bioinformatics and statistics were performed to evaluate the effects of biotic and abiotic driving forces on AMF and their associated microbial communities. My results showed high fungal and bacterial diversity associated with AMF spores and propagules in PHP contaminated soils. I also observed that the microbial community structures associated with AMF spores were significantly affected by plant species identity and PHP concentrations. Furthermore, I observed positive and negative correlations between some AMF species and some AMF-associated microorganisms, suggesting that in addition to PHP concentrations and plant species identity, AMF species may also play a key role in shaping the microbial community surrounding their spores. Comparisons between the AMF spore-associated microbiome and the whole microbiome found in rhizospheric soil and roots showed that AMF spores recruit a microbiome differing from those found in the surrounding soil and roots. Overall, my PhD project brings a new level of knowledge on AMF diversity on extremely polluted environment and demonstrates that interaction of AMF and their associated microbes is much complex that we though previously. Further investigations are needed to better understand how AMF select and reward their associated microbes in different environments

Rapid Mitochondrial Genome Evolution through Invasion of Mobile Elements in Two Closely Related Species of Arbuscular Mycorrhizal Fungi

<div><p>Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are common and important plant symbionts. They have coenocytic hyphae and form multinucleated spores. The nuclear genome of AMF is polymorphic and its organization is not well understood, which makes the development of reliable molecular markers challenging. In stark contrast, their mitochondrial genome (mtDNA) is homogeneous. To assess the intra- and inter-specific mitochondrial variability in closely related <i>Glomus species</i>, we performed 454 sequencing on total genomic DNA of <i>Glomus sp.</i> isolate DAOM-229456 and we compared its mtDNA with two <i>G. irregulare</i> isolates. We found that the mtDNA of <i>Glomus sp.</i> is homogeneous, identical in gene order and, with respect to the sequences of coding regions, almost identical t<i>o G. irregulare</i>. However, certain genomic regions vary substantially, due to insertions/deletions of elements such as introns, mitochondrial plasmid-like DNA polymerase genes and mobile open reading frames. We found no evidence of mitochondrial or cytoplasmic plasmids in <i>Glomus</i> species, and mobile ORFs in <i>Glomus</i> are responsible for the formation of four gene hybrids in <i>atp6</i>, <i>atp9</i>, <i>cox2</i>, and <i>nad</i>3, which are most probably the result of horizontal gene transfer and are expressed at the mRNA level. We found evidence for substantial sequence variation in defined regions of mtDNA, even among closely related isolates with otherwise identical coding gene sequences. This variation makes it possible to design reliable intra- and inter-specific markers.</p></div

A) Schematic alignment representation of two mitochondrial intergenic regions (<i>rnl-cox2</i> and <i>cox3-nad6</i>) showing the presence of numerous insertions and deletions (indels).

<p>The red arrows indicate the approximate position of the PCR primers that yield strain-specific markers, while the green arrows indicate the position of PCR primers that produce a size-specific marker. The yellow and orange arrows indicate potential regions to design, respectively, specific and size-specific markers in <i>G. irregulare</i> 494. <b>B</b>) Agarose gel electrophoresis figure showing the PCR results of the proposed markers on <i>Glomus sp.</i> 229456 (<i>Gs</i>) and <i>G. irregulare</i> DAOM197198 (<i>Gi</i>) respectively for each marker. Marker 1 shows the <i>Glomus sp.</i> specific amplification (156 bp), while marker 2 shows the <i>G. irregulare</i> 197198 specific marker (263 bp). The size-specific marker 3 yield a length of 160 bp for <i>Glomus sp.</i> and 226 bp for <i>G. irregulare</i> 197198. Finally, the size-specific marker 4 yield a length of 159 bp for <i>Glomus sp.</i> and 131 bp for <i>G. irregulare</i> 197198.</p

The <i>Glomus sp.</i> 229456 mitochondrial genome circular-map was opened upstream of <i>rnl</i>.

<p>Genes on the outer and inner circumference are transcribed in a clockwise and counterclockwise direction, respectively. Gene and corresponding product names are <i>atp6, 8, 9,</i> ATP synthase subunit 6; <i>cob</i>, apocytochrome b; <i>cox1–3</i>, cytochrome c oxidase subunits; <i>nad1–4, 4L, 5–6</i>, NADH dehydrogenase subunits; <i>rnl, rns</i>, large and small subunit rRNAs; A–W, tRNAs, the letter corresponding to the amino acid specified by the particular tRNA followed by their anticodon. Open reading frames smaller than 100 amino acids are not shown.</p

Gene and intron content in AMF and selected fungal mtDNAs.

a<p>Includes <i>nad1</i>, <i>nad2</i>, <i>nad3</i>, <i>nad4</i>, <i>nad4L</i>, <i>nad5</i> and <i>nad6</i>.</p>b<p>Only ORFs greater than 100 amino acids in length are listed, not including intronic ORFs and <i>dpo</i> and <i>rpo</i> fragments.</p>c<p>Intron I and Intron II denote introns of group I and group II, respectively.</p>d<p><i>S. cerevisiae</i> strain FY 1679 <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0060768#pone.0060768-Foury1" target="_blank">[57]</a>.</p

Comparative view of the three mitochondrial genomes linear map where the exons (black), introns (white), rDNA (gray), <i>dpo</i> plasmid insertions (red), ORFs (blue) and mobile endonuclease (yellow) are represented.

<p>Divergence in intron insertion pattern is indicated by projections. A hyper-variable region in the <i>cox3-rnl</i> intergene is boxed in grayscale.</p

Unrooted maximum likelihood trees obtained with the GTR+G model (5 distinct gamma categories).

<p>The first number at branches indicates ML bootstrap values with 1000 bootstrap replicates and the second number indicates posterior probability values of a MrBayes analysis with four independant chains. Bayesian inference predict similar trees (not shown). The concatenated tree of the <i>atp6</i>, <i>atp9</i>, <i>cox2</i> and <i>nad3</i> ‘core’ genes (without the duplicated C*-terminal portion) (1489 alignment positions) of selected AMF representatives (grayscale boxed) are compared with those of the <i>atp6</i> (298 alignment positions), where the red box with the asterisk point out to the reference <i>Allomyces spp.</i> HGT event (<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0060768#pone-0060768-g004" target="_blank">Figure 4</a>) (A), <i>atp9</i> (51 alignment positions) (B), <i>cox2</i> (106 alignment positions) (C) and <i>nad3</i> (120 alignment positions) (D) C*-terminals. The <i>Glomus sp.</i> native C*-terminals are in blue, while the inserted C-terminals are in red.</p