The role and regulation of FOXO3a in cancer and chemotherapy resistance

Drug resistance is the major impediment to the success of cancer therapy. The PI3K/AKT pathway mediates a plethora of cellular functions, including cell survival, proliferation and differentiation. However, increased activation of this pathway has been correlated with drug resistance mechanisms. This pathway regulates the activity of FOXO transcription factors in a negative manner through AKT-dependent phosphorylations. The modulation of FOXO activity leads to a variety of cellular outputs, including cell cycle arrest and apoptosis that define this transcription factor as a tumour suppressor. Importantly, FOXO has also been shown to mediate the effect of many anti-cancer drugs, suggesting that it has an additional role in drug sensitivity and resistance. With this work, by studying the PI3K/AKT/FOXO axis in breast cancer, I have characterised its impact in drug sensitivity and resistance. I found that this axis is deregulated in breast cancer resistant cells. By extending my in vitro findings to clinical samples, I further elucidated the potential role of AKT and FOXO3a as indicators and predictors of treatment response in breast cancer. In addition, I have also characterised three novel downstream targets of FOXO3a - FOXP1, FOXM1 and VEGF – with important roles towards breast cancer progression and in the development of drug-resistance. By characterising these FOXO3a effectors, I unravelled a potential general mechanism by which FOXO3a represses gene target expression

The effect of L-glutamine supplementation on the digestive physiology of Senegalese sole larvae, Solea senegalensis (Kaup, 1858)

Senegalese sole (Solea senegalensis) is an altricial species, which undergo dramatic transformations before metamorphosing into juvenile. Therefore, larvae must capture and process exogenous food even though the digestive tract may not be fully developed. The inadequate digestion/absorption of exogenous nutrients resulting from late maturation of the enterocytes at the intestinal epithelium has hampered a successful juvenile production of this promising flatfish species. Glutamine is a conditionally essential FAA which is involved in immune function and intestinal health, and has been widely used in aquaculture. A 22-day feeding trial was conducted to evaluate the effect of dietary L-glutamine supplementation on the growth performance, survival, metamorphosis, and digestive physiology during the early life stage of Senegalese sole. Two experimental diets were established with different levels of L-glutamine enrichments – 0.0 g l-1 (CTL) and 0.5 g l-1 (GLN). Experimental treatments were randomly assigned to triplicate groups stocked at a density of 0.26 individuals cm-2, reduced to 0.14 individuals cm-2 at 19 DAH, in each tank. The results showed that growth performance and enterocyte height of fish fed L-glutaminesupplemented diet were significantly increased compared to the control group (p<0.05). Survival and metamorphosis were not significantly different between dietary groups (p>0.05). Significant improvements were observed on specific activity of pepsin-like and amylase from CTL group, whereas BB aminopeptidase was highlighted in GLN group (p<0.05). Total activity of pepsin-like, amylase and acid phosphatase from CTL group was greater (p<0.05) than GLN group, whereas BB aminopeptidase total activity and IMI assayed through this enzyme showed better results in GLN group. Specific and total activity of trypsin, aminopeptidase, and intestinal and BB alkaline phosphatase did not differ between groups. Also, acid phosphatase specific activity was not affected by dietary L-glutamine. In conclusion, dietary L-glutamine supplementation could improve the growth performance and enterocyte height at the intestinal epithelium of sole post-larvae. Further studies are needed to clarify the effect of L-glutamine supplementation on enzymatic activity.Com o contínuo aumento da população, um dos maiores desafios da atualidade baseia-se na procura de novas formas de satisfazer as necessidades alimentares, através de uma dieta saudável, rica em proteínas. Com a estabilização da produção pesqueira, resultante da sobre-exploração de grande parte dos recursos haliêuticos, e perante o progressivo aumento do consumo global de peixe, a aquacultura surge como uma alternativa viável para a produção de proteína de elevada qualidade nutricional, a um preço relativamente baixo. A produção de linguado do Senegal (Solea senegalensis) tem sido fomentada para a diversificação da aquacultura na Europa. Além de possuir um elevado valor nutritivo, esta espécie de elevado valor comercial apresenta um vasto leque de caraterísticas produtivas vantajosas, que tornam a sua produção economicamente competitiva. Devido aos avanços tecnológicos e científicos alcançados nas últimas décadas, entre os quais sobre a biologia reprodutiva, comportamento, requisitos nutricionais e fisiologia digestiva, o linguado senegalês tem vindo a exibir sinais de expansão na sua produção a nível industrial. Consequentemente, a produção de linguado senegalês tem vindo a apresentar uma elevada demanda de forma a atender as necessidades do mercado, que não são completamente satisfeitas pelas capturas pesqueiras. Posto isto, há uma necessidade urgente de aumentar a quantidade de larvas e juvenis de linguado senegalês de elevada qualidade, que passa por solucionar as complicações ainda existentes na fase larvar. A fase de transição larva-juvenil representa ainda um período crítico na produção de linguado marcado pela elevada taxa de mortalidade, especialmente aquando a metamorfose ou a passagem do alimento vivo para alimento inerte (desmame). Durante o desenvolvimento larvar, as elevadas exigências nutricionais, impostas pelo rápido crescimento e maturação dos tecidos, podem, por vezes, ser limitadas pela reduzida eficiência digestiva. A reduzida capacidade digestiva, que o linguado senegalês apresenta durante o desenvolvimento larvar, pode ser atribuída à maturação tardia do intestino, que ocorre por volta dos 25 dias após eclosão (DAE); três semanas após o início da alimentação exógena. Desta forma, há o interesse em promover um desenvolvimento mais rápido do trato digestivo nas larvas de linguado, na medida em que o epitélio intestinal, ao estar diretamente relacionado com a absorção e digestão dos nutrientes, poderá proporcionar melhores taxas de sobrevivência e assegurar um melhor desempenho produtivo. Vários estudos têm demonstrado o potencial da glutamina na fisiologia digestiva de diversos organismos aquáticos. Além de impedir a atrofia da mucosa intestinal, este aminoácido é capaz de promover a maturação intestinal através do aumento das vilosidades intestinais, bem como das células epiteliais (enterócitos) nelas presentes. Devido à versatilidade da glutamina e à miríade de efeitos benéficos associados, a sua utilização tem sido foco de investigação na área da nutrição e visa aumentar a produção comercial de organismos aquáticos. Na última década, a utilização da glutamina como suplemento dietético tem vindo a ser testada nas fases iniciais do desenvolvimento de algumas espécies, como a Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) e linguado (Cynoglossus semilaevis). No âmbito desta necessidade de promover uma rápida maturação do trato digestivo do linguado senegalês, o presente estudo, integrado no projeto DIVERSIAQUAII, teve como principal objetivo avaliar o efeito da suplementação dietética com L-glutamina ao nível da fisiologia digestiva de pós-larvas de S. senegalensis. Para tal, foram estabelecidos dois grupos experimentais: Grupo controlo (CTL), no qual as pós-larvas de linguado senegalês foram alimentadas com metanáuplios de Artemia sp. enriquecidos com Red Pepper (BERNAQUA), uma emulsão comercial (1,0 ± 0,23 mg L-glutamina/g de peso seco de Artemia sp.); e o Grupo L-glutamina (GLN), no qual as pós-larvas de linguado senegalês foram alimentadas com metanáuplios de Artemia sp. enriquecidos com L-glutamina (em pó) (2,2 ± 0,06 mg Lglutamina/ g de peso seco de Artemia sp.). Um total de 13 140 larvas (peso seco inicial de 0,37 ± 0,05 mg) de linguado senegalês foram aleatoriamente distribuídas por 6 tanques retangulares (n=3, por cada tratamento experimental). A alimentação foi fornecida ad libitum cinco vezes ao dia, desde os 12 até aos 33 DAE. Durante o período experimental foram realizadas cinco amostragens, de forma a avaliar os seguintes parâmetros: comprimento total, peso seco, estado metamórfico, altura dos enterócitos, atividade específica e total das enzimas digestivas e das localizadas na borda em escova dos enterócitos. Com base nos dados de alguns destes parâmetros, foram também determinadas a taxa de crescimento relativa e o índice de maturação intestinal. A taxa de sobrevivência foi obtida com base nos registos de mortalidade registados diariamente. Relativamente ao comprimento total e peso seco, as pós-larvas de linguado senegalês alimentadas com Artemia sp. enriquecida com L-glutamina apresentaram valores superiores aos do grupo CTL. Da mesma forma, a taxa de crescimento relativa do grupo GLN foi significativamente maior a partir dos 26 DAE, comparativamente ao grupo CTL. No entanto, tanto a sobrevivência como os estados metamórficos não diferiram entre tratamentos experimentais. A suplementação com L-glutamina na dieta das pós-larvas de linguado senegalês promoveu melhorias na altura dos enterócitos do epitélio intestinal. Em relação aos dados obtidos através da análise enzimática, a atividade específica da pepsina e da amilase do grupo CTL destacaram-se positivamente, em comparação com o grupo GLN; enquanto a atividade específica da aminopeptidase, avaliada ao nível da borda em escova dos enterócitos, foi potenciada pela suplementação de L-glutamina na dieta. A atividade total da pepsina, amilase e fosfatase ácida, exibidas pelo grupo CTL, foi superior à das pós-larvas de linguado senegalês alimentadas com uma dieta suplementada com Lglutamina. A atividade total da aminopeptidase analisada ao nível da borda em escova dos enterócitos, bem como o índice de maturação intestinal calculado a partir desta enzima, foram promovidos pelo uso de L-glutamina como suplemento dietético no protocolo alimentar das pós-larvas de linguado. Tanto a atividade específica como a atividade total da tripsina, aminopeptidase e fosfatase alcalina (intestinal e da borda em escova dos enterócitos) não diferiram entre tratamentos experimentais. Da mesma forma, não foram observados efeitos da suplementação de L-glutamina na dieta ao nível da atividade específica da fosfatase ácida. Os resultados obtidos mostram, pela primeira vez, que em pós-larvas de linguado senegalês, o uso de L-glutamina como suplemento dietético pode promover melhorias ao nível do desempenho de crescimento. Além disso, com base nos dados histológicos, os resultados obtidos nesta tese suportam a possibilidade de a suplementação com L-glutamina acelerar a maturação do intestino durante o desenvolvimento larvar de S. senegalensis. Porém, é ainda necessário desenvolver outros estudos de forma a clarificar o efeito da suplementação com Lglutamina na atividade enzimática das pós-larvas de linguado senegalês

Metodologias para produção, extração e caracterização de compostos antibacterianos

This doctoral project is based on two parts, one using text and data mining and another in laboratory providing strategies based on advanced analytical methodologies for the discovery of bioactive compounds (BC), with potential applications on pharmaceutical and biotechnological tools from fungi organisms. The primary goal of this project was using a text mining technique for identifying the topics of a relevant scientific text related to fungi bioactive compounds and evolutionary connection among these topics, as well as using visualization tools for presenting both the topics and the association among them, as a convenient way to help users to determine relevant topics. In the second part of this thesis, firstly, fungi species were cultivated in lab using a batch reactor. Then, these fungi organisms were extracted by using environmentally friendly extraction techniques, such as High-Pressure Extraction (HPE). Secondly, the extracted compounds were characterized using elemental analysis (CNHS), nuclear magnetic resonance (NMR) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Thirdly, the bioactivity was evaluated through antimicrobial assays based on European pharmacopeia. Finally, the project findings will provide relevant data to stakeholders involved in the economic recovery plan through the sustainable resource management.Este trabalho de doutoramento é baseado em duas partes, uma usando mineração de dados e texto e outra em laboratório, fornecendo estratégias baseadas em metodologias analíticas avançadas para a descoberta de compostos bioativos (CB), com potenciais aplicações em ferramentas farmacêuticas e biotecnológicas de organismos fúngicos. O objetivo principal deste projeto foi usar uma técnica de mineração de texto para identificar os tópicos de um texto científico relevante relacionado com compostos bioativos de fungos e a conexão evolutiva entre esses tópicos, bem como usar ferramentas de visualização para apresentar os tópicos e a associação entre eles, como uma maneira conveniente de ajudar os utilizadores a determinar tópicos relevantes. Na segunda parte desta tese, inicialmente, as espécies de fungos foram cultivadas em laboratório usando um reator descontínuo. Em seguida, esses organismos fúngicos foram extraídos usando técnicas de extração verdes, como a Extração de Alta Pressão (HPE). Em segundo lugar, os compostos extraídos foram caracterizados por análise elementar (CNHS), ressonância magnética nuclear (RMN) e espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR). Em terceiro lugar, a bioatividade foi avaliada através de ensaios antimicrobianos baseados na farmacopeia europeia. Finalmente, as conclusões do projeto fornecerão dados relevantes às partes interessadas e envolvidas no plano de recuperação económica através da gestão de recursos sustentáveis.Programa Doutoral em Químic

Decellularized fetal skeletal muscle as an in vitro system to study a congenital muscular dystrophy

Laminin-α2-congenital muscular dystrophy (LAMA2-CMD) is caused by mutations in the LAMA2 gene, which encodes for the α2 chain of laminin-211, a glycoprotein present in extra-cellular matrix (ECM). Studies in our laboratory using a mouse model of the disease (dyW mice) have shown defects in fetal myogenesis. To better understand the impact of both extracellular environment and the cellular niche dur-ing the onset of LAMA2-CMD, wildtype C2C12 myoblast (C2C12-WT) and Lama2-null my-oblasts (C2C12-KO) were cultured in flasks and in decellularized fetal skeletal muscle obtained from embryonic day 18.5 healthy and dyW-/- fetuses. Our findings suggest that the absence of laminin-α2 results in alterations in the expression levels of genes that encode for other ECM proteins. Additionally, our results also show that proliferation and differentiation are also affected. Indeed, although C2C12-KO cells cultured in decellularized matrices showed a higher expression level of myogenin, a differentiation marker, and a higher tendency to formed aligned cells in matrices, only C2C12-WT cells were able to fuse and form multinucleated myotubes. The use of this novel 3D method allowed to reach a better understanding of the precise effects of laminin-α2 deficiency, which will be a requisite for the development of new therapies in the future.A distrofia muscular congénita laminina-α2 (LAMA2-CMD) é causada por mutações no gene LAMA2, que codifica a cadeia α2 da laminina, uma glicoproteína presente na matriz extracelu-lar (ECM). Estudos no nosso laboratório usando o ratinho modelo (dyW) para a doença LAMA2-CMD demonstraram defeitos na miogénese fetal. Para entender melhor o impacto tanto do ambiente extracelular como das células no desen-cadear da LAMA2-CMD, mioblastos C2C12 selvagens (C2C12-WT) e mioblastos nulos para Lama2 (C2C12-KO) foram cultivados em frascos e em músculo esquelético fetal descelulari-zado proveniente de fetos selvagens e fetos dyW-/- colhidos no estádio de 18.5 dias de desen-volvimento. Os nossos resultados demonstram que a ausência de laminina-α2 resulta em alterações nos níveis de expressão de genes que codificam outras proteínas da ECM. Além disso, os processos de proliferação e diferenciação são também afetados. De facto, apesar das C2C12-KO cultiva-das em matrizes descelularizadas exibirem um nível de expressão mais elevado de miogenina, um marcador da diferenciação, e uma maior tendência para alongar e alinhar, apenas as células C2C12-WT são capazes de fundir e formar miotubos multinucleados. A utilização deste modelo 3D permitiu entender melhor os efeitos causados pela ausência de laminina-α2, o que poderá contribuir para o futuro desenvolvimento de novas terapias

Design of a Novel Phage Display Vector to Improve Enrichment of Phages with Antigen-Specific Nanobodies and to Identify the Nanobody Clones of Highest Affinity

Although phage display-based enrichments became a standard procedure, they still suffer from some drawbacks. Nonspecific phage binding limits the enrichment that can be achieved per se-lection round and therefore, in most cases, at least three or four rounds are required to identify the antigen binding nanobodies (Nbs) from the library. Moreover, the release of the phages captured via their antigen-specific Nb on the immobilized antigen is accomplished most often, by a pH shock that will also release the a-specific absorbed phages, thereby generating an unwanted back-ground. However, the biggest shortcoming is the difficulty to identify the Nb of best binding affinity. We now have to ferment and purify all individual Nb clones to homogeneity and measure their affinity parameters one after the other. This is very tedious, certainly, as the identified Nbs often share a high degree of amino acid sequence identity, which makes it impossible to predict the one having the best affinity. The objective of this thesis aimed to modify the phage display vector so that one round of selection will be sufficient, while the affinity of all antigen-positive Nbs can be compared immediately after ELISA. Firstly, a vector containing the Calmodulin Binding Peptide (CBP) tag was created, by substitut-ing the hemagglutinin (HA) tag present in a pMECS-GG plasmid by the CBP tag. Moreover, 6 Nbs with well-known and variable kinetic binding rates were also inserted into the vector pMECS-CBP. Next, the vector was used in a phage display setting, where two mini libraries comprising the 6 Nbs were made. One library had the conventional pMECS vector while the other was made using the pMECS-CBP vector. Although an enrichment of 1000 times was achieved using pMECS, pMECS-CBP failed to show any enrichment, supporting the hypothesis that Nb-CBP encountered serious expression problems. To investigate the validity of this hypothesis, periplasmic expression of Nb-CBP was performed and compared with that of the Nb without the tag. While the Nb yielded almost 4 mg per liter of culture media, the Nb-CBP could only be obtained at 0.63 mg per liter culture. Moreover, the Nb-CBP couldn’t be detected on a western blot. Several methods were used, such as adding lysozyme to improve the periplasmic extraction step, expressing 5 different colonies to check if there was a homogeneity of expression between them. In all meth-ods, the amount produced always remained below 1 mg per liter and Nb-CBP protein couldn’t be detected in any step of expression by Coomassie stained SDS-PAGE or western blot. Additionally, a high yield expressing-protein (SIRPα) was cloned into the CBP vector to identify whether the expression problem was caused by the peptide tag itself or by the Nb-CBP combina-tion. Even though SIRPα was obtained at a yield of 8.7 mg/L of culture when expressed from a vector not containing the CBP, its expressed yield using the CBP vector, dropped to 0.7 mg/L of culture, indicating that the CBP tag is incompatible with good periplasmic expression. Lastly, a nucleotide alignment of our CBP tag with a previously reported one, revealed differences in two Arginine codons, two Alanine codons and one Lysine codon. Moreover, our sequence employed two codons, AGA and CGG, rarely used in E. coli, which might be linked to the re-duced expression levels that we observed during this thesis

In an industry where M&A is the new black, should Pandora A/S acquire Aritzia Inc.?

The present dissertation aims at performing a thorough analysis of the feasibility of a friendly acquisition deal between Pandora A/S and Aritzia Inc., where Pandora A/S is the acquirer firm, whereas Aritzia Inc. is the target. Pandora A/S is a global jewelry manufacturer and retailer, while Aritzia is a women’s apparel designer, manufacturer and retailer; an overview of each company’s business is presented. The analysis performed herewith also comprises an economic outlook of the jewelry and apparel industries, followed by the valuation of the companies as separate entities and as a combined entity, resorting to differing valuation approaches, such as the Discounted Cash Flow Valuation and the Relative Valuation methods. The deal would take place in a global environment with a strong M&A activity in the fashion industry, with the amount of deals and their value reaching record-high numbers. The suggested deal entails synergies valued at USD 395.19 million and will take the form of an all-share transaction, with a purchase price of USD 1,877 million, corresponding to a premium of 20.35%. By 2023, expectations are that the deal will potentially yield an accretion of 5.87%.A presente dissertação tem como objetivo realizar uma análise minuciosa da viabilidade da realização de um negócio de aquisição amigável entre a Pandora A/S e a Aritzia Inc., no qual a Pandora A/S atua como empresa aquisitiva, e a Aritzia Inc. como empresa-alvo da compra. A Pandora A/S é uma produtora e retalhista mundial de joalharia, enquanto que a Aritzia elabora o design, produz e vende produtos de vestuário feminino; é aqui apresentada uma visão global do negócio de cada empresa. A análise realizada inclui, também, uma visão global das indústrias de joalharia e vestuário, seguida da avaliação das empresas enquanto entidades individuais, e também enquanto uma só entidade fundida, recorrendo a diferentes abordagens de avaliação. A transação teria lugar num ambiente global pautado por uma forte atividade de Fusões e Aquisições na indústria da moda, sendo que o número de transações e o valor que estas tomam têm atingido valores recorde. O negócio aqui sugerido ocasiona sinergias avaliadas em USD 395.19 milhões, e adota a forma de um negócio totalmente financiado por ações, com um preço de aquisição de USD 1,877 milhões, a que corresponde um prémio de 20.35%. Em 2023, expecta-se que a transação terá associado um lucro por ação de 5.87%

Effects of dyes on candida spp. viability

Several dyes are widely recognized for their anti-microbial properties, although there spectrum of activity and security profiles are not always defined. Gentian violet (GeV) has been traditionally used to treat mucocutaneous candidosis. However, information concerning its antimicrobial spectrum required to support its clinical value is scarce. Methylene blue (MB) is widely used in clinic. Nevertheless, its antiseptic activity, although reported in the literature, is also not yet fully understood. The aim of this study is to evaluate the in vitro activity of GeV and MB against different Candida species. Nineteen strains of Candida will be studied. Clinical strains were isolated from clinical resistant cases of Candida infections. The anti-Candida activity of GeV and MB was evaluated according to CLSI protocol M27-A3. The mechanism of action it was evaluated by flow cytometry. About GeV, the minimal inhibitory concentrations (MIC) and minimal lethal concentrations (MLC) were approximately the same for all strains studied, except for C. glabrata. C. albicans and C. tropicalis were the most sensitive species. The antifungal effect was not influenced by alcohol at 20% and 96%. GeV showed a potent fungicidal activity against all strains of Candida. GeV doesn’t cause primary lesion of cytoplasmic membrane. Not all tested strains were susceptible to MB. The C. glabrata and C. krusei were resistant to the highest concentration used (5 mg/mL). In contrast to GeV, MB cause membrane lesion. Recurrent vulvovaginal candidosis, especially if resistant to classical therapeutic protocols ask for new approaches. GeV and MB continue to stand up as potential drugs to be used topically isolated or in addition to oral antifungal drugs in clinical resistant vulvovaginal candidosis.As infecções por Candida têm aumentado significativamente nos últimos anos, em larga medida como consequência do aumento dos casos de imunossupressão. C. albicans e C. glabrata são as espécies mais frequentemente isoladas. Estima-se que aproximadamente 75% de todas as mulheres terão pelo menos um episódio de candidose vulvovaginal durante toda a sua vida e que 5-10% destas irá experimentar episódios subsequentes. Embora a C. albicans seja responsável por 80-90% de todas as infecções, as vaginites causadas por Candida não-albicans têm aumentado durante os últimos anos, estimando-se que apenas cerca de 50% dos casos de candidose vulvovaginal causada por Candida não-albicans respondem à terapia oral ou local convencional com azóis. Nos últimos anos têm surgido estudos que relatam a crescente resistência de espécies não-albicans aos antifúngicos clássicos. Este problema emergente salienta a necessidade do estudo de alternativas eficazes para tratar a candidose vulvovaginal. Neste contexto, os tratamentos tradicionais têm sido revistos e novas modalidades terapêuticas têm sido procuradas e propostas. Vários corantes são reconhecidos pelas suas propriedades anti-microbianas. Contudo o seu perfil de actividade e de segurança não está, na maioria dos casos, definido. Da confirmação da sua actividade antimicrobiana e da segurança da sua aplicação in vivo, depende a confirmação do seu interesse no tratamento de infecções mucocutâneas, assim como no tingimento de roupa de uso hospitalar ou uso íntimo, com vista à prevenção da re-infecção e no revestimento de materiais médicos, ou outros produtos que se pretendam estéreis. O violeta de genciana tem sido tradicionalmente usado no tratamento da candidose mucocutânea. Contudo, a informação existente sobre o seu espectro antimicrobiano não é suficiente para que se possa definir o seu valor clínico. O azul-de-metileno apresenta ampla aplicação na clínica. Porém, a sua actividade anti-séptica, apesar de referida na literatura, não é ainda completamente compreendida. O objectivo deste estudo é avaliar a actividade in vitro do violeta de genciana e do azul-de-metileno em diferentes espécies de Candida, comparar a sua actividade com a de antifúngicos clássicos e contribuir para o conhecimento do mecanismo de acção destes produtos. Foram estudadas dezanove estirpes de Candida: C. tropicalis (n=4), C. albicans (n=5), C. parapsilosis (n=4), C. glabrata (n=4) e C. krusei (n=2). As estirpes clínicas foram isoladas de casos graves de candidose vulvovaginal. O efeito antifúngico foi avaliado pela determinação da concentração mínima inibitória (CMI) com base no micrométodo descrito na referência CLSI M27-A3, após 48 horas de incubação a 37 ºC. O crescimento da levedura foi visualmente comparado para cada concentração com a amostra controlo. O efeito fungicida foi verificado com base na determinação da concentração mínima letal (CML), adoptando-se o protocolo proposto por Canton (2003). Foram incluídos controlos de crescimento em etanol. Todas as determinações foram realizadas em duplicado e apenas resultados concordantes de três experiências independentes foram considerados. O protocolo do CLSI M27-A3 também foi utilizado para a avaliação do efeito da anfotericina B e fluconazol sobre as estirpes de Candida testadas. Por fim, o mecanismo de acção do corante sobre as leveduras foi avaliado por citometria de fluxo com base na metodologia descrita por Pina Vaz (2010). No caso do violeta de genciana, as CMI e CML foram aproximadamente as mesmas para todas as estirpes estudadas, excepto para a C. glabrata. Os valores de CMI variaram entre 0,03 μg/mL e 0,24 μg/mL e de CML variam entre 0,03 μg/mL e 0,98 μg/mL. C. albicans e C. tropicalis foram as espécies mais sensíveis. O efeito antifúngico não foi influenciado pelo etanol a 20% e a 96%. O violeta de genciana mostrou uma potente actividade fungicida contra todas as estirpes de Candida. Para o azul-de-metileno, as CMI variaram entre 0,039 mg/mL e 0,078 mg/mL e as CML entre 0,039 mg/mL e 0,3125 mg/mL para as estirpes sensíveis. Uma estirpe de C. parapsilosis foi apenas inibida pelo corante. As C. glabrata e C. krusei são resistentes às máximas concentrações utilizadas (5 mg/mL). Os resultados da citometria de fluxo revelaram baixa marcação celular por iodeto de propídio, mostrando que o mecanismo principal de morte celular após exposição ao violeta de genciana não é a lesão primária da membrana. As leveduras expostas ao azul-de-metileno sofreram marcação pelo iodeto de propídio, mostrando que este corante provoca lesão primária da membrana. O violeta de genciana apresenta actividade fungicida mesmo para as estirpes resistentes ao fluconazol. O azul-de-metileno apresenta um perfil de acção semelhante ao do fluconazol. A candidose vulvovaginal recorrente que não é controlada com protocolos terapêuticos clássicos precisa de abordagens diferentes. O violeta de genciana e o azul-de-metileno parecem ser drogas com potencial para serem usadas nos casos de candidose vulvovaginal recorrentes

Cybersecurity: perspectives from banking & capital markets, insurance and wealth & asset management sectors

This study focus on the perspective of cybersecurity in the financial services industry namely the Banking & Capital Markets, Insurance and Wealth & Asset Management sectors. Suffering the highest costs of cybersecurity and dealing with increasing sophisticated attacks, organizations within this industry must consider cyberattacks in their strategic planning. The comparison analysis suggests that the main vulnerability appointed by the three sectors are careless employees, their lack of training as well budget constraints and minor executive support. Moreover, the Board should acknowledge itself about information security in order to establish effective preventive and reactive measures. At last, cyber insurance interest is improving within the three sectors

The role of a newly discovered family of transcription factors, APIAP2, during the development of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Malaria is a vector borne disease that causes 1 million deaths annually. Gene expression control of Plasmodium parasites is poorly understood. A recently identified group of AP2/ERF-like proteins, ApiAP2 proteins, may represent the main transcriptional regulators. Gene expression in gametocytes (sexual precursor cells) is regulated by translational repression through the storage of certain mRNAs (for example transcripts encoding the surface proteins P25 and P28 ) in translationally silent P granule-like complexes. Only after fertilization are they activated, providing essential proteins for ookinete transformation during its early mosquito stage development. The main objective of this study was to understand whether the 3’ untranslated region (UTR), widely believed to target mRNAs to translationally quiescent P bodies, are responsible for the silencing of certain ApiAP2 molecules in female gametocytes. Using a combination of bioinformatics, imaging, molecular and genetic tools we aimed to GFP-tag AP2 C-termini and at the same time replace the endogenous 3’ UTR with a known one that allow translation in gametocytes. We successfully generated a stable transgenic Plasmodium berghei line, AP2-O::GFP (PBANKA_090590), that expresses AP2-O under the control of its endogenous promoter with an altered 3’ UTR. Infection patterns (growth kinetics, parasite morphology and sporozoite numbers) of this mutant line were analysed and shown to be comparable to wild type parasites. Furthermore, AP2-O::GFP expression was restricted to early mosquito stages (i.e. female gamete and ookinete) when AP2-O is naturally expressed. These experiments indicate that the 3’ UTR of AP2-O is not sufficient to trigger silencing in female gametocytes.A malária é uma doença causada por um parasita do género Plasmodium e transmitida pela picada de um mosquito do género Anopheles. De acordo com o último relatório da Organização Mundial de Saúde (OMS) esta doença ameaça sensivelmente metade da população mundial, ceifando um milhão de vidas anualmente. As crianças com idade inferior a cinco anos são as mais afectadas por este flagelo. Actualmente encontram-se descritas mais de 5000 espécies de Plasmodium que infectam não só o Homem mas também animais como macacos, pequenos roedores, aves e répteis. Entre as quatro espécies que infectam o Homem, a mais virulenta e prevalente é Plasmodium falcifarum. Nas últimas décadas tem-se verificado um aumento preocupante das resistências aos fármacos. Deste modo, actualmente vários programas de investigação científica dedicam-se ao estudo de potenciais alvos para vacinas. Consoante o estádio que a vacina ambiciona bloquear e o efeito surtido, assim a sua designação. Se o objectivo for bloquear a fase hepática, será uma vacina profiláctica, se o bloqueio for direccionado para a fase sanguínea será uma vacina ―curativa‖ e se procurar interromper a infecção no mosquito é considerada uma vacina de bloqueio de transmissão. Neste último exemplo a vacina não tem como objectivo proteger o indivíduo imunizado mas sim desencadear uma resposta imunitária humoral que será capaz de bloquear o desenvolvimento do parasita num mosquito que pique, posteriormente, o indivíduo vacinado, reduzindo-se o número de parasitas com capacidade infecciosa na comunidade.No entanto, para desenvolver este tipo de tecnologia é necessário um conhecimento mais profundo da biologia molecular do parasita, nomeadamente ao nível do seu desenvolvimento sexual (fase do mosquito). O genoma de Plasmodium falciparum codifica sensivelmente 5400 genes, contudo, mais de 60% apresenta uma reduzida ou mesmo nenhuma homologia relativamente aos genes dos outros eucariotas. Entre as espécies de Plasmodium que infectam o Homem e os roedores verifica-se uma elevada sintenia entre blocos de cromossomas e equivalente predição do número total de genes. Este facto permite que estudos efectuados no modelo animal possam ser extrapolados com relativa credibilidade para o caso da infecção em humanos. Assim, neste projecto foi utilizado o parasita de roedores, P. berghei. A utilização do modelo animal apresenta inúmeras vantagens, uma vez que não só as técnicas moleculares são mais eficientes para este modelo como todo o ciclo de vida pode ser mantido no laboratório. Actualmente, o controlo transcricional dos parasitas da malária encontra-se fracamente descrito. A rápida expansão e adaptação que segue a transmissão entre hospedeiros (vertebrado e mosquito) sugerem uma complexa coordenação a nível molecular. Deste modo, devido ao reduzido número de activadores transcricionais identificados, foi sugerido que a regulação da expressão génica seja efectuada a nível pós-transcricional. De facto, foi demonstrado que este tipo de regulação ocorre no gametócito feminino e medeia o silenciamento de centenas de transcritos, mantendo-os num estado quiescente em grânulos citoplasmáticos. A tradução destes transcritos só decorre na fase do mosquito, após fertilização. Pensa-se que um motivo localizado na região não traduzida da extremidade 3’ (3’UTR) seja responsável pelo recrutamento dos transcritos para os grânulos. Parasitas incapazes de produzir a proteína DOZI e/ou CITH funcionais, não geram zigotos viáveis. Estas proteínas estão presentes nestes complexos de repressão e pensa-se que por interagirem fisicamente com os transcritos, quando ausentes destabilizam o complexo levando à desregulação de cerca de 300 transcritos. Entre esses transcritos encontram-se 5 factores de transcrição da família ApiAP2. As proteínas, ApiAP2, foram recentemente descritas e actualmente constituem o principal grupo de reguladores da transcrição destes parasitas; estas contêm domínios de ligação ao DNA, homólogos aos encontrados na família de factores de transcrição AP2/ERF, identificada em plantas, como Arabidopsis. O facto destes factores de transcrição estarem desregulados no mutante com deleção do gene dozi sugere que talvez tenham um papel preponderante na activação transcricional no estádio de zigoto. Este projecto teve como objectivos a caracterização dos padrões de expressão genética de genes ApiAP2 e avaliar quais se encontravam regulados a nível pós-transcricional nos estádios de transmissão, nomeadamente no gametócito e no esporozoito. Para mais, este trabalho também visou determinar as funções moleculares de cinco factores ApiAP2 (PBANKA_090590 [também designado ap2-o], PBANKA_140370, PBANKA_093910, PBANKA_010290, PBANKA_131320), que são potencialmente regulados por mecanismos pós-transcricionais pelo facto de se encontrarem desregulados no mutante com delecção do gene dozi. Para tal tentou-se interferir com o seu padrão de expressão genética. Foram então utilizadas técnicas moleculares, genéticas, de microscopia e bioinformáticas para confirmar tanto os modelos genéticos dos cinco alvos propostos como o modelo proposto para a sua regulação (supressão da tradução). Vectores de transfecção foram preparados de modo gerar genes de fusão com o gene gfp (green fluorescent protein) para que a expressão das respectivas proteínas pudesse ser seguida por análise de fluorescência. A transfecção foi efectuada numa estirpe selvagem de P. berghei ANKA. Posteriormente, a correcta integração dos vectores no genoma dos parasitas foi avaliada por técnicas de PCR. Para induzir alterações no padrão de expressão destas moléculas, ou seja evitar o seu recrutamento para os grânulos citoplasmáticos dos gametócitos, os vectores de transfecção foram construídos de modo a que a sua integração no genoma do parasita deslocalizasse a região 3’UTR, substituindo-a por outra de um transcrito traduzido constitutivamente. As populações de mutantes obtidas foram então clonadas seguindo-se a análise e detecção das proteínas de fusão fluorescentes. Tendo em conta que estas moléculas são factores de transcrição, ao tentar induzir precocemente a sua expressão esperava-se induzir também a expressão dos genes que controlam. Se esta indução resultasse na produção de proteínas de superfície (típicas da fase do mosquito) capazes de gerar uma resposta imunitária no hospedeiro vertebrado então essas proteínas seriam potenciais alvos para vacinas de bloqueio de transmissão. Numa primeira análise os resultados da análise bioinformática sugeriram uma localização nuclear para estas proteínas. A análise por imunofluorescência, em combinação com técnicas moleculares de RT-PCR indicou ainda que as cinco moléculas ApiAP2 são reguladas pós-transcricionalmente no gametócito feminino. A genotipagem dos parasitas transfectados revelou a presença de uma linha de parasitas mutantes para o gene ap2-o (ap2-o::gfp). Sendo naturalmente expresso nos estádios iniciais da fase do mosquito a presença da proteína AP2-O::GFP na fase sanguínea indicaria um papel para a região 3’ UTR no silenciamento do respectivo transcrito. No entanto após análise de todos os estádios da fase sanguínea por técnicas de fluorescência a proteína não foi detectada. Procedeu-se também à infecção de mosquitos e todos os indicadores de infecciosidade eram comparáveis aos da estirpe selvagem, nomeadamente, número de oocistos, número de esporozoitos gerados e capacidade de infectar novo hospedeiro vertebrado. Tendo em conta os resultados obtidos procedeu-se à observação de oocinetos - o estádio onde foi demonstrada a presença da proteína AP2-O. Para tal efectuaram-se culturas in vitro de oocinetos. Utilizando técnicas de microscopia de amostras vivas foi detectada a presença da proteína de fusão AP2-O::GFP tanto em oocinetos como em gâmetas femininos não fertilizados, estádio onde expressão desta proteína nos gâmetas não tinha sido previamente descrita. Estes resultados sugerem que no caso do gene ap2-o a repressão da tradução no gametócito ou é independente da região 3’ UTR ou requer a interacção com um outro motivo, como por exemplo a região 5’ UTR. Deste modo, idealizam-se como experiências futuras uma alteração concomitante de ambas as regiões não traduzidas (3’ e 5’) e/ou a sobre-expressão deste gene através da introdução de um promotor de expressão constitutiva, como por exemplo o promotor do gene efIα