Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Malaria is a vector borne disease that causes 1 million deaths annually. Gene expression control of Plasmodium parasites is poorly understood. A recently identified group of AP2/ERF-like proteins, ApiAP2 proteins, may represent the main transcriptional regulators. Gene expression in gametocytes (sexual precursor cells) is regulated by translational repression through the storage of certain mRNAs (for example transcripts encoding the surface proteins P25 and P28 ) in translationally silent P granule-like complexes. Only after fertilization are they activated, providing essential proteins for ookinete transformation during its early mosquito stage development. The main objective of this study was to understand whether the 3’ untranslated region (UTR), widely believed to target mRNAs to translationally quiescent P bodies, are responsible for the silencing of certain ApiAP2 molecules in female gametocytes. Using a combination of bioinformatics, imaging, molecular and genetic tools we aimed to GFP-tag AP2 C-termini and at the same time replace the endogenous 3’ UTR with a known one that allow translation in gametocytes. We successfully generated a stable transgenic Plasmodium berghei line, AP2-O::GFP (PBANKA_090590), that expresses AP2-O under the control of its endogenous promoter with an altered 3’ UTR. Infection patterns (growth kinetics, parasite morphology and sporozoite numbers) of this mutant line were analysed and shown to be comparable to wild type parasites. Furthermore, AP2-O::GFP expression was restricted to early mosquito stages (i.e. female gamete and ookinete) when AP2-O is naturally expressed. These experiments indicate that the 3’ UTR of AP2-O is not sufficient to trigger silencing in female gametocytes.A malária é uma doença causada por um parasita do género Plasmodium e transmitida pela picada de um mosquito do género Anopheles. De acordo com o último relatório da Organização Mundial de Saúde (OMS) esta doença ameaça sensivelmente metade da população mundial, ceifando um milhão de vidas anualmente. As crianças com idade inferior a cinco anos são as mais afectadas por este flagelo. Actualmente encontram-se descritas mais de 5000 espécies de Plasmodium que infectam não só o Homem mas também animais como macacos, pequenos roedores, aves e répteis. Entre as quatro espécies que infectam o Homem, a mais virulenta e prevalente é Plasmodium falcifarum. Nas últimas décadas tem-se verificado um aumento preocupante das resistências aos fármacos. Deste modo, actualmente vários programas de investigação científica dedicam-se ao estudo de potenciais alvos para vacinas. Consoante o estádio que a vacina ambiciona bloquear e o efeito surtido, assim a sua designação. Se o objectivo for bloquear a fase hepática, será uma vacina profiláctica, se o bloqueio for direccionado para a fase sanguínea será uma vacina ―curativa‖ e se procurar interromper a infecção no mosquito é considerada uma vacina de bloqueio de transmissão. Neste último exemplo a vacina não tem como objectivo proteger o indivíduo imunizado mas sim desencadear uma resposta imunitária humoral que será capaz de bloquear o desenvolvimento do parasita num mosquito que pique, posteriormente, o indivíduo vacinado, reduzindo-se o número de parasitas com capacidade infecciosa na comunidade.No entanto, para desenvolver este tipo de tecnologia é necessário um conhecimento mais profundo da biologia molecular do parasita, nomeadamente ao nível do seu desenvolvimento sexual (fase do mosquito). O genoma de Plasmodium falciparum codifica sensivelmente 5400 genes, contudo, mais de 60% apresenta uma reduzida ou mesmo nenhuma homologia relativamente aos genes dos outros eucariotas. Entre as espécies de Plasmodium que infectam o Homem e os roedores verifica-se uma elevada sintenia entre blocos de cromossomas e equivalente predição do número total de genes. Este facto permite que estudos efectuados no modelo animal possam ser extrapolados com relativa credibilidade para o caso da infecção em humanos. Assim, neste projecto foi utilizado o parasita de roedores, P. berghei. A utilização do modelo animal apresenta inúmeras vantagens, uma vez que não só as técnicas moleculares são mais eficientes para este modelo como todo o ciclo de vida pode ser mantido no laboratório. Actualmente, o controlo transcricional dos parasitas da malária encontra-se fracamente descrito. A rápida expansão e adaptação que segue a transmissão entre hospedeiros (vertebrado e mosquito) sugerem uma complexa coordenação a nível molecular. Deste modo, devido ao reduzido número de activadores transcricionais identificados, foi sugerido que a regulação da expressão génica seja efectuada a nível pós-transcricional. De facto, foi demonstrado que este tipo de regulação ocorre no gametócito feminino e medeia o silenciamento de centenas de transcritos, mantendo-os num estado quiescente em grânulos citoplasmáticos. A tradução destes transcritos só decorre na fase do mosquito, após fertilização. Pensa-se que um motivo localizado na região não traduzida da extremidade 3’ (3’UTR) seja responsável pelo recrutamento dos transcritos para os grânulos. Parasitas incapazes de produzir a proteína DOZI e/ou CITH funcionais, não geram zigotos viáveis. Estas proteínas estão presentes nestes complexos de repressão e pensa-se que por interagirem fisicamente com os transcritos, quando ausentes destabilizam o complexo levando à desregulação de cerca de 300 transcritos. Entre esses transcritos encontram-se 5 factores de transcrição da família ApiAP2. As proteínas, ApiAP2, foram recentemente descritas e actualmente constituem o principal grupo de reguladores da transcrição destes parasitas; estas contêm domínios de ligação ao DNA, homólogos aos encontrados na família de factores de transcrição AP2/ERF, identificada em plantas, como Arabidopsis. O facto destes factores de transcrição estarem desregulados no mutante com deleção do gene dozi sugere que talvez tenham um papel preponderante na activação transcricional no estádio de zigoto. Este projecto teve como objectivos a caracterização dos padrões de expressão genética de genes ApiAP2 e avaliar quais se encontravam regulados a nível pós-transcricional nos estádios de transmissão, nomeadamente no gametócito e no esporozoito. Para mais, este trabalho também visou determinar as funções moleculares de cinco factores ApiAP2 (PBANKA_090590 [também designado ap2-o], PBANKA_140370, PBANKA_093910, PBANKA_010290, PBANKA_131320), que são potencialmente regulados por mecanismos pós-transcricionais pelo facto de se encontrarem desregulados no mutante com delecção do gene dozi. Para tal tentou-se interferir com o seu padrão de expressão genética. Foram então utilizadas técnicas moleculares, genéticas, de microscopia e bioinformáticas para confirmar tanto os modelos genéticos dos cinco alvos propostos como o modelo proposto para a sua regulação (supressão da tradução). Vectores de transfecção foram preparados de modo gerar genes de fusão com o gene gfp (green fluorescent protein) para que a expressão das respectivas proteínas pudesse ser seguida por análise de fluorescência. A transfecção foi efectuada numa estirpe selvagem de P. berghei ANKA. Posteriormente, a correcta integração dos vectores no genoma dos parasitas foi avaliada por técnicas de PCR. Para induzir alterações no padrão de expressão destas moléculas, ou seja evitar o seu recrutamento para os grânulos citoplasmáticos dos gametócitos, os vectores de transfecção foram construídos de modo a que a sua integração no genoma do parasita deslocalizasse a região 3’UTR, substituindo-a por outra de um transcrito traduzido constitutivamente. As populações de mutantes obtidas foram então clonadas seguindo-se a análise e detecção das proteínas de fusão fluorescentes. Tendo em conta que estas moléculas são factores de transcrição, ao tentar induzir precocemente a sua expressão esperava-se induzir também a expressão dos genes que controlam. Se esta indução resultasse na produção de proteínas de superfície (típicas da fase do mosquito) capazes de gerar uma resposta imunitária no hospedeiro vertebrado então essas proteínas seriam potenciais alvos para vacinas de bloqueio de transmissão. Numa primeira análise os resultados da análise bioinformática sugeriram uma localização nuclear para estas proteínas. A análise por imunofluorescência, em combinação com técnicas moleculares de RT-PCR indicou ainda que as cinco moléculas ApiAP2 são reguladas pós-transcricionalmente no gametócito feminino. A genotipagem dos parasitas transfectados revelou a presença de uma linha de parasitas mutantes para o gene ap2-o (ap2-o::gfp). Sendo naturalmente expresso nos estádios iniciais da fase do mosquito a presença da proteína AP2-O::GFP na fase sanguínea indicaria um papel para a região 3’ UTR no silenciamento do respectivo transcrito. No entanto após análise de todos os estádios da fase sanguínea por técnicas de fluorescência a proteína não foi detectada. Procedeu-se também à infecção de mosquitos e todos os indicadores de infecciosidade eram comparáveis aos da estirpe selvagem, nomeadamente, número de oocistos, número de esporozoitos gerados e capacidade de infectar novo hospedeiro vertebrado. Tendo em conta os resultados obtidos procedeu-se à observação de oocinetos - o estádio onde foi demonstrada a presença da proteína AP2-O. Para tal efectuaram-se culturas in vitro de oocinetos. Utilizando técnicas de microscopia de amostras vivas foi detectada a presença da proteína de fusão AP2-O::GFP tanto em oocinetos como em gâmetas femininos não fertilizados, estádio onde expressão desta proteína nos gâmetas não tinha sido previamente descrita. Estes resultados sugerem que no caso do gene ap2-o a repressão da tradução no gametócito ou é independente da região 3’ UTR ou requer a interacção com um outro motivo, como por exemplo a região 5’ UTR. Deste modo, idealizam-se como experiências futuras uma alteração concomitante de ambas as regiões não traduzidas (3’ e 5’) e/ou a sobre-expressão deste gene através da introdução de um promotor de expressão constitutiva, como por exemplo o promotor do gene efIα
