Epac-vermittelte Modulation der Neurotransmitterfreisetzung bei neuronalen Zellkulturen des Hippocampus

cAMP beeinflusst sekretorische Prozesse sowohl durch Protein Kinase A (PKA)-abhängige als auch durch PKA-unabhängige Signaltransduktionsprozesse. Dennoch ist der jeweilige Anteil an einer cAMP-vermittelten Regulation der Neurotransmission nur unzureichend bekannt. In verschiedenen Preparationen von Nervenzellen konnte gezeigt werden, dass eine cAMP-bedingte Steigerung der Neurotransmitterfreisetzung sowohl auf eine Erhöhung der vesikulären Freisetzungswahrscheinlichkeit als auch auf eine Zunahme der Zahl freisetzbarer Vesikel zurückgeführt werden kann. In der vorliegenden Dissertation wurde die Beteilung des neuen cAMP Rezeptors Epac an der cAMP-vermittelten Regulation der Neurotransmission untersucht. Mit Hilfe des Patch-Clamp Verfahrens wurde die Neurotransmitterfreisetzung bei hoch oder niedrigfrequenter Stimulation kultivierter exzitatorischer autaptischer Nervenzellen bestimmt; und zwar in An- oder Abwesenheit Epac-selektiver cylischer AMP Analoga (ESCAs). Bei niedrigfrequenter Stimulation (0.2 Hz) von autaptischen Neuronen des Dentatus Gyrus führte eine ESCA-induzierte Epac Aktivierung sowohl zur Erhöhung Aktionspotential evozierter exzitatorischer postsynaptischer Stromamplituden als auch zur Zunahme der Anzahl spontaner Vesikelfusionen mit der presynaptischen Plasmamembran. Das Ausmaß der beobachteten Potenzierungen war abhängig von der in den ersten zwei Minuten gemessenene mittleren Stromamplitude der Nervenzelle, aber auch vom Alter der Zellkultur und der presynaptischen Kalziumionenkonzentration. Die ESCA1 (8-pCPT-2 -O-Me-cAMP)-induzierte Epac Aktivierung konnte eine Forskolin vermittelte Erhöhung von Aktionspotential evozierten exzitatorischen postsynaptischen Stromamplituden im Durchschnitt zu 38 % und die Forskolin-vermittelten Zunahme der Anzahl spontaner Vesikelfusionen zu 100 % erklären. Allgemein wird angenommen, dass Forskolin die Aktivität von Adenylatcyclasen erhöht und damit die intrazelluläre cAMP Konzentration. Die Stromamplitude spontaner Vesikelfusionen wurde durch eine kurzzeitige Applikation von ESCA1 (1.2 Minuten) nicht verändert. Gleiches traf auf die Anzahl schnell freisetzbarer Vesikel zu. Kurzzeitige ESCA1 Applikation führte daher zu einer Erhöhung der vesikulären Freisetzungswahrscheinlichkeit. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die an der Neurotransmission beteiligten ESCA1- und Phorbolester-induzierten Signaltransduktionswege miteinander gekoppelt sind. Diese Kopplung war von der Protein Kinase C Aktivität abhängig

Activation of Protein Kinase Cα by EPAC1 Is Required for the ERK- and CCAAT/Enhancer-binding Protein β-dependent Induction of the SOCS-3 Gene by Cyclic AMP in COS1 Cells*

We recently found that induction of the anti-inflammatory SOCS-3 gene by cyclic AMP occurs through novel cyclic AMP-dependent protein kinase-independent mechanisms involving activation of CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) transcription factors, notably C/EBPβ, by the cyclic AMP GEF EPAC1 and the Rap1 GTPase. In this study we show that down-regulation of phospholipase (PL) Cϵ with small interfering RNA or blockade of PLC activity with chemical inhibitors ablates exchange protein directly activated by cyclic AMP (EPAC)-dependent induction of SOCS-3 in COS1 cells. Consistent with this, stimulation of cells with 1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol and phorbol 12-myristate 13-acetate, both cell-permeable analogues of the PLC product diacylglycerol, are sufficient to induce SOCS-3 expression in a Ca2+-dependent manner. Moreover, the diacylglycerol- and Ca2+-dependent protein kinase C (PKC) isoform PKCα becomes activated following cyclic AMP elevation or EPAC stimulation. Conversely, down-regulation of PKC activity with chemical inhibitors or small interfering RNA-mediated depletion of PKCα or -δ blocks EPAC-dependent SOCS-3 induction. Using the MEK inhibitor U0126, we found that activation of ERK MAPKs is essential for SOCS-3 induction by either cyclic AMP or PKC. C/EBPβ is known to be phosphorylated and activated by ERK. Accordingly, we found ERK activation to be essential for cyclic AMP-dependent C/EBP activation and C/EBPβ-dependent SOCS-3 induction by cyclic AMP and PKC. Moreover, overexpression of a mutant form of C/EBPβ (T235A), which lacks the ERK phosphorylation site, blocks SOCS-3 induction by cyclic AMP and PKC in a dominant-negative manner. Together, these results indicate that EPAC mediates novel regulatory cross-talk between the cyclic AMP and PKC signaling pathways leading to ERK- and C/EBPβ-dependent induction of the SOCS-3 gene

Novel control of cAMP-regulated transcription in vascular endothelial cells

Chronic inflammatory diseases, such as atherosclerosis, are a major cause of death and disability in the developed world. In this respect, although cholesterol obviously plays a predominant role in atherosclerosis, targeting inflammation at lesion sites may be just as important. Indeed, elevated IL-6 (interleukin 6) levels are as strongly associated with coronary heart disease as increased cholesterol. We have been investigating novel cAMP-regulated pathways that combat the action of pro-inflammatory cytokines, such as IL-6 and leptin, in the VECs (vascular endothelial cells) of the circulatory system. In this respect, we have begun to unravel new molecular mechanisms by which the cAMP/Epac1 (exchange protein directly activated by cAMP 1)/Rap1 pathway can initiate a rigorous programme of protective anti-inflammatory responses in VECs. Central to this is the coupling of cAMP elevation to the mobilization of two C/EBP (CCAAT/enhancer-binding protein) family transcription factors, resulting in the induction of the SOCS3 (suppressor of cytokine signalling 3) gene, which attenuates pro-inflammatory cytokine signalling in VECs. These novel 'protective' mechanisms of cAMP action will inform the development of the next generation of pharmaceuticals specifically designed to combat endothelial inflammation associated with cardiovascular disease