A survey on zoonotic helminths in farmed fish to evaluate the safety of Italian aquaculture products

Introduction: Several zoonotic helminths can be transmitted to humans by consumption of raw, undercooked, marinated or cold smoked fish products, representing a relevant public health concern. Although up to now in Italy the presence of zoonotic helminths has been documented only in wild fish populations, extensive epidemiological surveys are needed in order to assess the possible zoonotic risks linked to consumption of national aquaculture products. At this purpose, a wide parasitological survey has being undertaken on rainbow trout Oncorhynchus mykiss (RBT), gilthead seabream Sparus aurata (GSB) and European seabass Dicentrarchus labrax (ESB) farmed in Italy. Methodology: From spring 2016 to spring 2017 a total of 2347 fish have been examined. In particular, 738 RBT from 4 Italian freshwater trout farms (two farms located in the area endemic for diphyllobothriasis in Northwestern Italy, 1 in the area endemic for opisthorchiasis in Central Italy and 1 in a highly productive area of Northeastern Italy) were subjected to methods aimed to search for larval stages of diphyllobothriid cestodes (visual inspection and candling) and opisthorchiid digeneans (muscular compression/artificial digestion followed by microscopic examination). Furthermore, 781 GSB and 828 ESB from 4 marine farms (3 cage systems and 1 inland farm located in Tyrrhenian and Adriatic seas) were examined for anisakid larvae by UV-press method and artificial digestion. A seasonal periodicity has been applied, sampling 65 specimens/fish species/farm/season in order to reach a statistically significant amount of fish at the end of the survey (258 fish/farm). Results: No zoonotic parasites have been found in all the examined fish at the level of confidence of 99% with a margin of error of 5%. Conclusions: The results so far obtained during this survey are encouraging and seem to confirm that the risks linked to zoonotic helminths in Italian aquacultured fish species are null or negligible, when good farming practices are applied along the production chain

An ISH technique for the early detection of Enterospora nucleophila, an intranuclear microsporidian causing emaciative disease in gilthead sea bream

Enterospora nucleophila is a microsporidian parasite causing serious emaciative disease in cultured gilthead sea bream (GSB), Sparus aurata, and closely related to Enterocytozoon hepatopenaei from shrimp. The parasite can be found within the nuclei of enterocytes and rodlet cells of the fish intestinal epithelium, and occasionally in the cytoplasm of phagocytes in more advanced infections. However, spores are the only stage that can be unmistakably identified but even this may require thorough histopathological examination and use of chitin fluorescent stains for a proper confirmatory diagnosis, due to their minute size and intranuclear location. In the absence of spores, the infection can be suspected from a remarkable hypercelullarity and the presence of altered nuclei in the epithelial layer. This results in a very poor correlation of disease signs with diagnosis of E. nucleophila infection, and to current uncertainty about its real impact in GSB culture. This work describes the development and application of an in situ hybridization (ISH) technique as a powerful tool to overcome current diagnostic limitations for this species, and to decipher basic data on the infection and disease onset. We designed DIG-labelled oligonucleotide probes targeting unique regions of the (+) strand of E. nucleophila rDNA gene, and we developed an ISH protocol that results in good staining of infected host cells prior to the development of spores or other conspicuous stages. On clinically infected samples, numerous ISH-positive cells are present which are not stained with fluorescent whiteners that bind to parasite spores. In contrast, poor staining of spores was obtained with the DNA probes, due to their limited penetration in these stages and the low number of target gene copies that they harbour. These aspects might be improved using specific steps (e.g., chitinase or more aggressive permeabilization strategies) but they are not necessary in a clinical diagnostic context. Due to the relevance of E. nucleophila infections it is essential to decipher unknown aspects of the parasite\u2019s biology and course of infection using proper diagnostic tools. Their cryptic nature makes this a challenging task for microsporidians like E. nucleophila, which can benefit from the method hereby presented

Viral nervous necrosis outbreaks caused by the RGNNV/SJNNV reassortant betanodavirus in gilthead sea bream (Sparus aurata) and European sea bass (Dicentrarchus labrax)

Mediterranean marine aquaculture has suffered significant economic losses due to viral nervous necrosis (VNN) outbreaks mainly caused by different RGNNV betanodavirus strains. In recent years, the marine aquaculture sector has experienced the emergence of the RGNNV/SJNNV reassortant betanodavirus, harbouring the RNA1 segment of RGNNV genotype and the RNA2 segment of SJNNV genotype. So far, the reassortant strains caused massive mortality outbreaks in gilthead sea bream (Sparus aurata) larvae sparing the European sea bass (Dicentrarchus labrax). In this study, multiple mortality outbreaks occurred in one Italian marine hatchery involving both European sea bass and gilthead sea bream at different life stages were investigated through a complete microbiological and molecular analysis. Gilthead sea bream larvae and juveniles have recorded the highest mortality rates, however, both European sea bass and gilthead sea bream incurred a RGNNV/SJNNV reassortant betanodavirus persistent infection, able to act as asymptomatic carriers and viral source for susceptible fish. These new epidemiological data on nervous necrosis virus (NNV) reassortant infection provide precious advice on how to manage fish to reduce VNN spread in Mediterranean aquaculture. Evidence of interspecies transmission of RGNNV/SJNNV reassortant strains and the persistent infection in both European sea bass and gilthead sea bream, point out the importance to enforce a wide surveillance and a strict biosecurity programme addressing both RGNNV and reassortant RGNNV/SJNNV betanodaviruses in Mediterranean European sea bass and gilthead sea bream farms. Furthermore, the presence assessment of betanoviruses in all newly-introduced fish batches in the farm, regardless of the species and a strict segregation between European sea bass and gilthead sea bream batches within farms can significantly reduce the risk of NNV transmission. Finally, surviving fish can act as carrier fish, and thereby must be segregated from other batches and protected from stress conditions that could trigger a new clinical phase

INDAGINE PARASSITOLOGICA SULLA PRESENZA DI STADI LARVALI DI NEMATODI ANISAKIDAE IN PESCI MARINI ALLEVATI IN ITALIA

L\u2019anisakiasi \ue8 una zoonosi parassitaria di origine alimentare sostenuta da larve al terzo stadio (L3) di nematodi appartenenti alla famiglia Anisakidae ed in particolare al genere Anisakis. Soprattutto in seguito alla recente emergenza di sindromi allergiche da Anisakis, l\u2019EFSA nel 2010 ha pubblicato un parere scientifico sui rischi correlati alla presenza di parassiti zoonotici in prodotti ittici, considerando sicura la pratica d\u2019allevamento del salmone atlantico (Salmo salar) in quanto, se allevati partendo da avannotti prodotti in sistemi chiusi e alimentati sempre con mangime inerte, questi animali presenterebbero un rischio di infestazione da larve di Anisakis trascurabile. Su questa base, il Reg. UE n. 1276/2011, che modifica l\u2019allegato III del Reg. CE n. 853\2004, puntualizza la possibile deroga al trattamento di congelamento, obbligatorio per i prodotti della pesca destinati ad essere consumati sotto forma di preparazioni a rischio (crudi, marinati, affumicati a freddo, ecc.), per i prodotti ittici derivanti da allevamento quando vengono rispettati i criteri definiti dall\u2019EFSA analogamente al salmone atlantico. Appare quindi d\u2019importanza strategica fornire dati scientifici estesi ed attendibili sull\u2019assenza di parassiti zoonotici nei prodotti della maricoltura mediterranea non solo ai fini di una loro migliore qualificazione commerciale ma anche per una pi\uf9 facile applicabilit\ue0 di tale deroga da parte delle autorit\ue0 competenti. Nell\u2019ambito delle attivit\ue0 di ricerca previste dal progetto europeo H2020 ParaFishControl \u201cAdvanced Tools and Research Strategies for Parasite Control in European farmed fish\u201d, da marzo 2016 a giugno 2017 \ue8 stato condotto un esteso monitoraggio parassitologico in spigole (Dicentrarchus labrax) ed orate (Sparus aurata) allevate in Italia. Le attivit\ue0 di campionamento hanno coinvolto 4 allevamenti nazionali, di cui 3 in gabbie galleggianti ed uno in vasche a terra, prelevando almeno 258 esemplari per specie/allevamento suddivisi in 4 campionamenti a cadenza stagionale per un totale di 1040 spigole e 1090 orate. La numerosit\ue0 campionaria \ue8 stata calcolata in modo da ottenere almeno il 95% di probabilit\ue0 di evidenziare un esemplare positivo con prevalenza >2%. Per la ricerca di larve di nematodi Anisakidae sono stati associati: esame visivo diretto e mediante transilluminatore di visceri e porzioni muscolari, metodo della UV-press dei filetti e digestione con soluzione cloro- peptica del pacchetto viscerale. Tutti gli esemplari di spigola e orata esaminati sono risultati negativi per la presenza di stadi larvali di Anisakis spp. In un unico esemplare di spigola proveniente da un allevamento in gabbia \ue8 stata evidenziata la presenza di una larva di Hysterothylacium fabri (nematode non zoonotico) incistata sulla superficie del fegato ed identificata a livello di specie mediante PCR-RFLP. Alla luce della trasmissione di questo parassita a pesci predatori per via trofica, similmente ai nematodi Anisakidae zoonotici, nel prossimo futuro verranno condotte indagini mirate ad identificare i fattori di rischio che hanno condotto all\u2019infestazione da H. fabri in allevamento, seppur in un unico esemplare, ed individuare gli eventuali punti critici da monitorare. I risultati ottenuti da questa indagine indicano comunque come nelle spigole e nelle orate allevate in Italia il rischio d\u2019infestazione da Anisakis sia da ritenersi trascurabile, aprendo la via ad azioni di qualificazione dei prodotti della maricoltura mediterranea

Time-integrated luminosity recorded by the BABAR detector at the PEP-II e+e- collider

This article is the Preprint version of the final published artcile which can be accessed at the link below.We describe a measurement of the time-integrated luminosity of the data collected by the BABAR experiment at the PEP-II asymmetric-energy e+e- collider at the ϒ(4S), ϒ(3S), and ϒ(2S) resonances and in a continuum region below each resonance. We measure the time-integrated luminosity by counting e+e-→e+e- and (for the ϒ(4S) only) e+e-→μ+μ- candidate events, allowing additional photons in the final state. We use data-corrected simulation to determine the cross-sections and reconstruction efficiencies for these processes, as well as the major backgrounds. Due to the large cross-sections of e+e-→e+e- and e+e-→μ+μ-, the statistical uncertainties of the measurement are substantially smaller than the systematic uncertainties. The dominant systematic uncertainties are due to observed differences between data and simulation, as well as uncertainties on the cross-sections. For data collected on the ϒ(3S) and ϒ(2S) resonances, an additional uncertainty arises due to ϒ→e+e-X background. For data collected off the ϒ resonances, we estimate an additional uncertainty due to time dependent efficiency variations, which can affect the short off-resonance runs. The relative uncertainties on the luminosities of the on-resonance (off-resonance) samples are 0.43% (0.43%) for the ϒ(4S), 0.58% (0.72%) for the ϒ(3S), and 0.68% (0.88%) for the ϒ(2S).This work is supported by the US Department of Energy and National Science Foundation, the Natural Sciences and Engineering Research Council (Canada), the Commissariat à l’Energie Atomique and Institut National de Physique Nucléaire et de Physiquedes Particules (France), the Bundesministerium für Bildung und Forschung and Deutsche Forschungsgemeinschaft (Germany), the Istituto Nazionale di Fisica Nucleare (Italy), the Foundation for Fundamental Research on Matter (The Netherlands), the Research Council of Norway, the Ministry of Education and Science of the Russian Federation, Ministerio de Ciencia e Innovación (Spain), and the Science and Technology Facilities Council (United Kingdom). Individuals have received support from the Marie-Curie IEF program (European Union) and the A.P. Sloan Foundation (USA)

Ricerche su zoonosi parassitarie di origine ittica

Nella prima fase della ricerca sono state condotte estese ricerche bibliografiche su Anisakiosi ittica ed umana e sono state stabilite collaborazioni con i Servizi Veterinari dei mercati ittici di Cesenatico (FC), Ancona, Giulianova (TE), Vasto (CH), Manfredonia (FG) e Taranto al fine della pianificazione delle attivit\ue0 di campionamento. Sono stati inoltre definiti protocolli su a) modalit\ue0 di prelievo ed invio del campione al laboratorio, b) ricerca parassitologica di larve Anisakidae, c) tecniche di identificazione di larve Anisakidae. Nella seconda fase sono stati condotti campionamenti periodici di alici (Engraulis encrasicholus) e sardine (Sardina pilchardus) prelevati presso i mercati ittici sopra citati. L'entit\ue0 del campione, in genere intorno a 50 soggetti/specie, ha presentato oscillazioni numeriche in relazione alla disponibilit\ue0 del pescato, alle condizioni metereologiche ed alle direttive di fermo pesca. Sono stati analizzati complessivamente 3950 soggetti, di cui 2636 alici (958 provenienti dal mercato ittico di Cesenatico, 409 da Ancona, 697 da Manfredonia, 181 da Giulianova, 366 da Vasto e 25 da Taranto) e 1314 sardine (330 provenienti dal mercato ittico di Cesenatico, 327 da Ancona, 433 da Manfredonia, 192 da Giulianova, 32 da Taranto). Su ogni soggetto \ue8 stata condotta la ricerca visiva di stadi larvali di nematodi Anisakidae. Dopo averne rilevato lo stato di vitalit\ue0 e l'intensit\ue0 d'infestazione, i parassiti reperiti sono stati isolati, fissati in alcool etilico 70% e chiarificati in lattofenolo di Amman. L'identificazione \ue8 stata condotta mediante osservazione microscopica, utilizzando chiavi tassonomiche specifiche. Vengono qui riportati in modo sintetico i principali risultati della ricerca. La presenza di stadi larvali di nematodi Anisakidae \ue8 stata evidenziata in 1244 (31,5%) soggetti. In particolare sono risultate parassitate 700 (26.6%) alici e 544 (41.4%) sardine. Per quanto concerne i siti di campionamento, si sono riscontate le seguenti percentuali di positivit\ue0 complessive (tra parentesi viene riportata la percentuale di positivit\ue0 riferita alla specie ittica): Cesenatico 32% (22.96% in alici e 58.18% in sardine), Ancona 55,3% (56.48% in alici e 53.82% in sardine), Manfredonia 18,5% (11.05% in alici e 30.48% in sardine), Giulianova 26,54% (24.86% in alici e 22.92% in sardine), Vasto 34,15% (riferita alle alici), Taranto 8% (riferita alle alici). In relazione al genere di appartenenza dei parassiti reperiti, sono state reperite solo larve di terzo stadio di Anisakis e Hysterothylacium. E\u2019 interessante notare come nelle sardine siano state reperite larve di Anisakis sp. solo in due casi (0,4%), mentre larve di Hysterothylacium sp. erano presenti nel 99,6% dei positivi. Riguardo alle alici, 54 soggetti sono risultati parassitati da larve di Anisakis sp. (7,7%) con valori estremamente bassi rispetto a quelli riferiti a Hysterothylacium sp. (98,6%). In alcuni soggetti (6,3%) si sono rilevate coinfezioni sostenute da entrambi i generi parassitari. L\u2019elaborazione statistica, condotta mediante analisi della varianza (ANOVA), test del χ2, McNemar e test di Mann-Whitney, ha evidenziato differenze significative tra le percentuali di positivit\ue0 osservate nelle alici provenienti dai diversi siti di campionamento, con valori di prevalenza significativamente maggiori (p<0,001) negli areali marchigiani. Ha inoltre messo in rilievo una differenza significativa (p<0,001) tra le prevalenze per Anisakis e Hysterothylacium riscontrate in alici e sardine provenienti dai diversi siti in studio, evidenziando valori di positivit\ue0 per Anisakis significativamente pi\uf9 bassi rispetto a Hysterothylacium in entrambe le specie ittiche. Questi risultati sembrano indicare come le alici e le sardine (e quest\u2019ultima specie in particolare) pescate lungo gli areali costieri presi in considerazione siano ospiti poco frequenti di Anisakis sp., genere Anisakidae di interesse zoonosico, presentando quindi bassi livelli di ri..

Indagine sulla diffusione delle plerocercosi ittiche in Italia

Obiettivo principale della ricerca vuole essere un aggiornamento scientifico sulla diffusione delle plerocercosi da Diphyllobothrium latum e da Triaenophorus spp. in popolazioni ittiche di ambienti lacustri nazionali. Nello specifico, per quanto concerne la plerocercosi da D. latum ci si propone di definire i livelli di infestazione in diverse specie ittiche (in particolare Perca fluviatilis e Esox lucius) presenti in laghi settentrionali del nostro paese e riguardo alla plerocercosi da Triaenophorus spp. si intende valutare l\u2019entit\ue0 di diffusione di T. nodulosus e T. crassus in pesci lacustri dell\u2019Italia centro-settentrionale, volgendo una particolare attenzione alla presenza di T. crassus nei diversi ospiti invertebrati e vertebrati al fine di stabilirne il grado di colonizzazione e le possibili modalit\ue0 di controllo. La ricerca verr\ue0 articolata secondo le seguenti fasi: - Fase 1: ricerca bibliografica, incontri con il personale operante presso i servizi veterinari ed i settori ittici provinciali e pianificazione dei prelievi; - Fase 2: campionamenti di specie ittiche in base alle disposizioni locali ed in collaborazione con gli enti territoriali (almeno 3 volte/anno per sito); analisi parassitologiche sulle specie ittiche campionate volte alla ricerca di larve plerocercoidi in sede viscerale e muscolare, loro identificazione e definizione dei valori di prevalenza, abbondanza ed intensit\ue0 di infestazione in rapporto a specie ittica, taglia dell\u2019ospite, localit\ue0 di campionamento e momento stagionale. Campionamento (almeno 2 volte/anno per sito) di crostacei copepodi mediante strumenti di raccolta per zooplancton ed analisi parassitologiche volte a rilevare la presenza di larve procercoidi e permetterne l\u2019isolamento e l\u2019identificazione; - Fase 3: elaborazione finale dei dati raccolti e valutazione dei rischi sanitari