11 research outputs found

    Physiological role of AMPAR nanoscale organization at basal state and during synaptic plasticities

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    Le cerveau est formé d’un réseau complexe de neurones responsables de nos fonctions cognitives et de nos comportements. Les neurones reçoivent via des contacts spécialisés nommés « synapses », des signaux d’autres neurones.[...] Le mécanisme par lequel les neurones reçoivent, intègrent et transmettent ces informations est très complexe et n'est toujours pas parfaitement compris. Dans les synapses excitatrices, les récepteurs AMPA (AMPARs) sont responsables de la transmission synaptique rapide. Les récents développements en microscopie de super résolution ont permis à la communauté scientifique de changer la vision de la transmission synaptique. Une première avancée fait suite à l’observation que les AMPARs ne sont pas distribués de façon homogène dans les synapses, mais sont organisés en nanodomaines de ~ 80 nm de diamètre contenant ~ 20 récepteurs. Ce contenu est un facteur important pour déterminer l'amplitude de la réponse synaptique. En raison de la basse affinité des AMPARs pour le glutamate, un AMPAR ne peut être activé que lorsqu'il est situé dans une zone de ~ 150 nm en face du site de libération des neurotransmetteurs. Récemment, il a été montré que les nanodomaines d’AMPARs sont situés en face de ces sites de libération, formant des nano-colonnes trans-synaptiques à l'état basal. Cette organisation précise à l’échelle nanométrique semble être un facteur clé dans l'efficacité de la transmission synaptique. Une autre avancée a été l'observation que les AMPARs diffusent à la surface des neurones et sont immobilisés à la synapse pour participer à la transmission synaptique. L'échange dynamique entre le pool diffusif d’AMPARs et les récepteurs immobilisés dans les nanodomaines participe au maintien de l’efficacité de la réponse synaptique lors de stimulations à hautes fréquences. L'objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle des paramètres indiqués ci-dessus sur les propriétés de la transmission synaptique, à l'état basal et au cours de phénomènes dits de plasticité synaptique. Tout d'abord, nous avons identifié le rôle crucial de la Neuroligine dans l'alignement des nanodomaines d’AMPARs avec les sites de libération du glutamate. En plus de cela, nous avons mis en évidence l’impact de cet alignement sur l’efficacité de la transmission synaptique en perturbant celui-ci. En parallèle, nous avons démontré que les AMPARs désensibilisés sont plus mobiles à la membrane plasmatique que les récepteurs ouverts ou fermés, et ce, en raison d'une diminution de leur affinité pour les sites d’immobilisation synaptiques. Nous avons montré que ce mécanisme permettait aux synapses de récupérer plus rapidement de la désensibilisation et d'assurer la fidélité de la transmission synaptique lors de stimulations à hautes fréquences. Enfin, les synapses peuvent moduler leurs intensités de réponse grâce à des mécanismes de plasticité synaptique à long terme, et plus particulièrement, la dépression à long terme (LTD) qui correspond à un affaiblissement durable de ce poids synaptique. [...] À la suite des découvertes précédentes concernant le rôle de la nano-organisation dynamique des AMPARs pour réguler le poids et la fiabilité de la transmission synaptique, j'ai décidé d'étudier leur rôle dans l'affaiblissement et la sélection des synapses. J'ai découvert que la quantité d’AMPAR par nanodomaine diminue rapidement et durablement. Cette première phase semble due à une augmentation de l’internalisation des AMPARs. Dans un deuxième temps, la mobilité des AMPARs augmente suite à une réorganisation moléculaire de la synapse. Ce changement de mobilité des AMPARs permet aux synapses déprimées de maintenir leur capacité à répondre aux signaux neuronaux à hautes fréquences. Ainsi, nous proposons que l'augmentation de la mobilité des AMPARs au cours de la LTD permet de transmettre une réponse fidèle dans les synapses stimulées à hautes fréquences et donc de sélectivement les maintenir tout en éliminant les synapses inactives.The brain is a complex network of interconnected neurons responsible for all our cognitive functions and behaviors. Neurons receive inputs at specialized contact zones named synapses which convert an all or none electrical signal to a chemical one, through the release of neurotransmitters. This chemical signal is then turned back in a tunable electrical signal by receptors to neurotransmitters. However, a single neuron receives thousands of inputs coming from several neurons in a spatial- and temporal-dependent manner. The precise mechanism by which neurons receive, integrate and transmit this synaptic inputs is highly complex and is still not perfectly understood. At excitatory synapses, AMPA receptors (AMPARs) are responsible for the fast synaptic transmission. With the recent developments in super-resolution microscopy, the community has changed its vision of synaptic transmission. One breakthrough was the discovery that AMPARs are not randomly distributed at synapses but are organized in nanodomains of ~80 nm of diameter containing ~20 receptors. This content is an important factor since it will determine the intensity of the synaptic response. Due to their mM affinity for glutamate, AMPARs can only be activated when located in an area of ~150 nm in front of the neurotransmitter release site. Recently, AMPAR nanodomains have been shown to be located in front of glutamate release sites and to form trans-synaptic nanocolumns at basal state. Thus, the nanoscale organization of AMPARs regarding release sites seems to be a key parameter for the efficiency of synaptic transmission. Another breakthrough in the field was the observation that AMPARs diffuse at the cell surface and are immobilized at synapses to participate to synaptic transmission. The dynamic exchange between AMPAR diffusive pool and the receptors immobilized into the nanodomains participates to maintain the efficiency of synaptic response upon high-frequency stimulation.The overall aim of my PhD has been to determine the role of each above listed parameters on the intimate properties of synaptic transmission both at basal state and during synaptic plasticity. First, we identified the crucial role of Neuroligin in the alignment of AMPAR nanodomains with glutamate release sites. In addition, we managed to break this alignment to understand its impact on synaptic transmission properties. In parallel, we demonstrated that, due to a decrease in their affinity for synaptic traps, desensitized AMPARs diffuse more at the plasma membrane than opened or closed receptors. This mechanism allows synapses to recover faster from desensitization and ensure the fidelity of synaptic transmission upon high-frequency release of glutamate. Finally, synapses can modulate their strength through long-term synaptic plasticity, in particular, Long-Term Depression (LTD) corresponds to a long-lasting weakening of synaptic strength and is thought to be important in some cognitive processes and behavioral flexibility through synapse selective elimination. Following the previous discoveries about the impact of AMPAR dynamic nano-organization at synapses on the regulation of the synaptic transmission strength and reliability, I decided to investigate their role in the weakening of synapses. I found that AMPAR nanodomain content drops down rapidly and this depletion last several minutes to hours. The initial phase seems due to an increase of endocytosis events, but in a second phase, AMPAR mobility is increased following a reorganization of the post-synaptic density. This change in mobility allows depressed synapses to maintain their capacity to answer to high-frequency inputs. Thus, we propose that LTD-induced increase in AMPAR mobility allows to conduct a reliable response in synapses under high-frequency stimulation and thus to selectively maintain them while eliminating the inactive ones

    Rôle physiologique de l’organisation des récepteurs AMPA à l’échelle nanométrique à l’état basal et lors des plasticités synaptiques

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    The brain is a complex network of interconnected neurons responsible for all our cognitive functions and behaviors. Neurons receive inputs at specialized contact zones named synapses which convert an all or none electrical signal to a chemical one, through the release of neurotransmitters. This chemical signal is then turned back in a tunable electrical signal by receptors to neurotransmitters. However, a single neuron receives thousands of inputs coming from several neurons in a spatial- and temporal-dependent manner. The precise mechanism by which neurons receive, integrate and transmit this synaptic inputs is highly complex and is still not perfectly understood. At excitatory synapses, AMPA receptors (AMPARs) are responsible for the fast synaptic transmission. With the recent developments in super-resolution microscopy, the community has changed its vision of synaptic transmission. One breakthrough was the discovery that AMPARs are not randomly distributed at synapses but are organized in nanodomains of ~80 nm of diameter containing ~20 receptors. This content is an important factor since it will determine the intensity of the synaptic response. Due to their mM affinity for glutamate, AMPARs can only be activated when located in an area of ~150 nm in front of the neurotransmitter release site. Recently, AMPAR nanodomains have been shown to be located in front of glutamate release sites and to form trans-synaptic nanocolumns at basal state. Thus, the nanoscale organization of AMPARs regarding release sites seems to be a key parameter for the efficiency of synaptic transmission. Another breakthrough in the field was the observation that AMPARs diffuse at the cell surface and are immobilized at synapses to participate to synaptic transmission. The dynamic exchange between AMPAR diffusive pool and the receptors immobilized into the nanodomains participates to maintain the efficiency of synaptic response upon high-frequency stimulation.The overall aim of my PhD has been to determine the role of each above listed parameters on the intimate properties of synaptic transmission both at basal state and during synaptic plasticity. First, we identified the crucial role of Neuroligin in the alignment of AMPAR nanodomains with glutamate release sites. In addition, we managed to break this alignment to understand its impact on synaptic transmission properties. In parallel, we demonstrated that, due to a decrease in their affinity for synaptic traps, desensitized AMPARs diffuse more at the plasma membrane than opened or closed receptors. This mechanism allows synapses to recover faster from desensitization and ensure the fidelity of synaptic transmission upon high-frequency release of glutamate. Finally, synapses can modulate their strength through long-term synaptic plasticity, in particular, Long-Term Depression (LTD) corresponds to a long-lasting weakening of synaptic strength and is thought to be important in some cognitive processes and behavioral flexibility through synapse selective elimination. Following the previous discoveries about the impact of AMPAR dynamic nano-organization at synapses on the regulation of the synaptic transmission strength and reliability, I decided to investigate their role in the weakening of synapses. I found that AMPAR nanodomain content drops down rapidly and this depletion last several minutes to hours. The initial phase seems due to an increase of endocytosis events, but in a second phase, AMPAR mobility is increased following a reorganization of the post-synaptic density. This change in mobility allows depressed synapses to maintain their capacity to answer to high-frequency inputs. Thus, we propose that LTD-induced increase in AMPAR mobility allows to conduct a reliable response in synapses under high-frequency stimulation and thus to selectively maintain them while eliminating the inactive ones.Le cerveau est formé d’un réseau complexe de neurones responsables de nos fonctions cognitives et de nos comportements. Les neurones reçoivent via des contacts spécialisés nommés « synapses », des signaux d’autres neurones.[...] Le mécanisme par lequel les neurones reçoivent, intègrent et transmettent ces informations est très complexe et n'est toujours pas parfaitement compris. Dans les synapses excitatrices, les récepteurs AMPA (AMPARs) sont responsables de la transmission synaptique rapide. Les récents développements en microscopie de super résolution ont permis à la communauté scientifique de changer la vision de la transmission synaptique. Une première avancée fait suite à l’observation que les AMPARs ne sont pas distribués de façon homogène dans les synapses, mais sont organisés en nanodomaines de ~ 80 nm de diamètre contenant ~ 20 récepteurs. Ce contenu est un facteur important pour déterminer l'amplitude de la réponse synaptique. En raison de la basse affinité des AMPARs pour le glutamate, un AMPAR ne peut être activé que lorsqu'il est situé dans une zone de ~ 150 nm en face du site de libération des neurotransmetteurs. Récemment, il a été montré que les nanodomaines d’AMPARs sont situés en face de ces sites de libération, formant des nano-colonnes trans-synaptiques à l'état basal. Cette organisation précise à l’échelle nanométrique semble être un facteur clé dans l'efficacité de la transmission synaptique. Une autre avancée a été l'observation que les AMPARs diffusent à la surface des neurones et sont immobilisés à la synapse pour participer à la transmission synaptique. L'échange dynamique entre le pool diffusif d’AMPARs et les récepteurs immobilisés dans les nanodomaines participe au maintien de l’efficacité de la réponse synaptique lors de stimulations à hautes fréquences. L'objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle des paramètres indiqués ci-dessus sur les propriétés de la transmission synaptique, à l'état basal et au cours de phénomènes dits de plasticité synaptique. Tout d'abord, nous avons identifié le rôle crucial de la Neuroligine dans l'alignement des nanodomaines d’AMPARs avec les sites de libération du glutamate. En plus de cela, nous avons mis en évidence l’impact de cet alignement sur l’efficacité de la transmission synaptique en perturbant celui-ci. En parallèle, nous avons démontré que les AMPARs désensibilisés sont plus mobiles à la membrane plasmatique que les récepteurs ouverts ou fermés, et ce, en raison d'une diminution de leur affinité pour les sites d’immobilisation synaptiques. Nous avons montré que ce mécanisme permettait aux synapses de récupérer plus rapidement de la désensibilisation et d'assurer la fidélité de la transmission synaptique lors de stimulations à hautes fréquences. Enfin, les synapses peuvent moduler leurs intensités de réponse grâce à des mécanismes de plasticité synaptique à long terme, et plus particulièrement, la dépression à long terme (LTD) qui correspond à un affaiblissement durable de ce poids synaptique. [...] À la suite des découvertes précédentes concernant le rôle de la nano-organisation dynamique des AMPARs pour réguler le poids et la fiabilité de la transmission synaptique, j'ai décidé d'étudier leur rôle dans l'affaiblissement et la sélection des synapses. J'ai découvert que la quantité d’AMPAR par nanodomaine diminue rapidement et durablement. Cette première phase semble due à une augmentation de l’internalisation des AMPARs. Dans un deuxième temps, la mobilité des AMPARs augmente suite à une réorganisation moléculaire de la synapse. Ce changement de mobilité des AMPARs permet aux synapses déprimées de maintenir leur capacité à répondre aux signaux neuronaux à hautes fréquences. Ainsi, nous proposons que l'augmentation de la mobilité des AMPARs au cours de la LTD permet de transmettre une réponse fidèle dans les synapses stimulées à hautes fréquences et donc de sélectivement les maintenir tout en éliminant les synapses inactives

    A super-resolution platform for correlative live single-molecule imaging and STED microscopy

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    Super-resolution microscopy offers tremendous opportunities to unravel the complex and dynamic architecture of living cells. However, current super-resolution microscopes are well suited for revealing protein distributions or cell morphology, but not both. We present a super-resolution platform that permits correlative single-molecule imaging and stimulated emission depletion microscopy in live cells. It gives nanoscale access to the positions and movements of synaptic proteins within the morphological context of growth cones and dendritic spines

    Engineering paralog-specific PSD-95 recombinant binders as minimally interfering multimodal probes for advanced imaging techniques

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    Despite the constant advances in fluorescence imaging techniques, monitoring endogenous proteins still constitutes a major challenge in particular when considering dynamics studies or super-resolution imaging. We have recently evolved specific protein-based binders for PSD-95, the main postsynaptic scaffold proteins at excitatory synapses. Since the synthetic recombinant binders recognize epitopes not directly involved in the target protein activity, we consider them here as tools to develop endogenous PSD-95 imaging probes. After confirming their lack of impact on PSD-95 function, we validated their use as intrabody fluorescent probes. We further engineered the probes and demonstrated their usefulness in different super-resolution imaging modalities (STED, PALM, and DNA-PAINT) in both live and fixed neurons. Finally, we exploited the binders to enrich at the synapse genetically encoded calcium reporters. Overall, we demonstrate that these evolved binders constitute a robust and efficient platform to selectively target and monitor endogenous PSD-95 using various fluorescence imaging techniques

    Glutamate-induced AMPA receptor desensitization increases their mobility and modulates short-term plasticity through unbinding from stargazin

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    Short-term plasticity of AMPAR currents during high-frequency stimulation depends not only on presynaptic transmitter release and postsynaptic AMPAR recovery from desensitization, but also on fast AMPAR diffusion. How AMPAR diffusion within the synapse regulates synaptic transmission on the millisecond scale remains mysterious. Using single-molecule tracking, we found that, upon glutamate binding, synaptic AMPAR diffuse faster. Using AMPAR stabilized in different conformational states by point mutations and pharmacology, we show that desensitized receptors bind less stargazin and are less stabilized at the synapse than receptors in opened or closed-resting states. AMPAR mobility-mediated regulation of short-term plasticity is abrogated when the glutamate-dependent loss in AMPAR-stargazin interaction is prevented. We propose that transition from the activated to the desensitized state leads to partial loss in AMPAR-stargazin interaction that increases AMPAR mobility and allows faster recovery from desensitization-mediated synaptic depression, without affecting the overall nano-organization of AMPAR in synapses

    Mapping the Phosphoproteome of Influenza A and B Viruses by Mass Spectrometry

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