Molecular characterization of novel Cryptosporidium fish genotypes in edible marine fish

Current knowledge of Cryptosporidium species/genotypes in marine fish is limited. Following phylogenetic analysis at the 18S rDNA locus, a recent study identified six new genotypes of Cryptosporidium colonizing edible fish found in European seas. Of these, five grouped in a clade together (#Cryptofish 1–5) and one grouped separately (#Cryptofish 7). In the present study, after phylogenetic analyses of #Cryptofish1, #Cryptofish2, #Cryptofish4, #Cryptofish5 and #Cryptofish7 at the actin locus, the presence of two major clades was confirmed. In addition, when possible, longer 18S amplicons were generated. In conclusion, the small genetic distances between these genotypes designated as a novel marine genotype I (#Cryptofish 1-5) suggest that they may be genetic variants of the same species, while the designated novel marine genotype 2 (#Cryptofish 7) is clearly representative of a separate species

Infection par Cryptosporidium spp. du modèle souris SCID traité à la dexaméthasone : caractérisation cellulaire et moléculaire du processus de cancérisation des épithéliums digestifs

Certad and col, showed recently that Cryptosporidium parvum is also capable of inducing gastrointestinal adenomas with intraepithelial neoplasia of low and high grade, and adenocarcinomas in situ in SCID mice (Severe Combined immunodeficiency), treated with dexamethasone (SCID-D). In addition, we also know that Cryptosporidium muris induces a chronic infection but no neoplastic lesions.This is why we decided first to determine the minimum dose of C. parvum (IOWA) which can infect and cause digestive neoplasia in this model. This work allowed us to conclude that one oocyst is able to induce in SCID-D mice not only a chronic infection but also the development of neoplastic lesions in both the antropyloric region of the stomach and the ileocecal region at 45 days post infection. We also followed up the progression of these lesions after infection with several doses of C. parvum strain IOWA (theoretically: 1, 10, 100 and 105 oocysts). This work was also performed after inoculation of another strain of different origin isolated from an immunosupressed patient suffering from a severe cryptosporidiosis after a near-drowning). To do this we have achieved: an extended follow-up of animals (over 84 days) and an histopathological analysis based on immunohistochemical detection of cytokeratin and alpha smooth actin. For the first time it was noted with all doses and for the two strains, in both the antropyloric and ileocecal region of animals, a patern characteristic of invasif adenocarcinoma: desmoplasia and buds of tumor cells invading the lamina propria. In addition to these histological features, a discontinuous basement membrane, the presence of epithelial cells in the stroma, an interruption of the muscularis mucosa and an invasion of the muscularis were also detected. In the case of the strain of C. parvum of human origin, the adenocarcinoma also invaded the serosa and epithelial cells were observed inside blood vessels (vascular tumor emboli). Lesion’s progression was so fast that after only 60 days post-infection we observed at least, the invasion of the submucosa at ileocecal region. Furthermore, the results of this study showed for the first time the ability of an isolate of C. parvum of human origin to cause chologiocarcinoma in an experimental model. Finally, using an immunohistochemical approach, we explored metabolic pathways involved in the development of C. parvum-induced neoplastic lesions at the ileocecal region. Four markers involved in major pathways altered in colorectal cancer were chosen: APC, beta-catenin, p53 and K-ras. The assesment of tumor marker expression in the ileocaecal area showed an abnormal localization of APC, beta-catenin and p53. Beta-catenin and p53 accumulated in the cytoplasm, while APC labelling decreased or even disappeared. Meanwhile, K-ras was still at membrane level as in normal cells. these results suggest the involvement of p53 and Wnt pathway in the phenomenon of carcinogenesis in our mouse model (SCID-D). Studies to search the implication of other markers and possible mutations of the genes encoding these proteins are underway. In conclusion,, these findings show that different strains of C. parvum including a strain of human origin induce digestif invasive adenocarcinomas whatever the inoculum size administered to SCID-D mice. These results confirm the role of C. parvum in the induction of digestive cancer in immunocompromised hosts. In addition, the pathways involved in the process of carcinogenesis in mice (SCID-D) appeared to be the same as those altered in humans. Moreover, the Wnt signaling pathway in which the actin polymerization and rearrangement of the cytoskeleton are involved is a major event during Cryptosporidium infection and appears to play a role in the carcinogenic process induced by the parasite.Au vu des travaux de Certad et de ses collaborateurs, nous savons que Cryptosporidium parvum est également capable d’induire des adénomes avec des néoplasies digestives intraépithéliales de bas grade et de haut grade, ainsi que des adénocarcinomes in situ, chez des souris SCID (Severe Combined Immunodeficiency) déficientes en lymphocytes T et B, traitées par la dexaméthasone (SCID-D). De plus, nous savons aussi que Cryptosporidium muris induit une infection chronique mais pas de lésions néoplasiques. C’est pour faire suite à ces observations que nous avons entrepris dans un premier temps de déterminer la dose minimale de Cryptosporidium parvum (souche IOWA d’origine animale) pouvant infecter ce modèle et induire des néoplasies digestives. Nous avons montré qu’une dose très faible de parasites (théoriquement 1 oocyste) est capable d’induire non seulement une infection chronique chez les souris (SCID-D) mais également l’apparition de lésions néoplasiques aussi bien dans la région antropylorique de l’estomac qu’au niveau de la région iléo-caecale et cela dès 45 jours post infection. Nous avons également suivi la progression de ces lésions à la suite d’infection des souris par plusieurs doses de C. parvum (souche IOWA) (théoriquement : 1, 10, 100 et 105 oocystes). Ce travail a également été réalisé après inoculation d’une souche de C. parvum d’origine humaine (isolée à partir d’un patient immunodeprimée soufrant d’une cryptosporidiose grave à la suite d’une noyade). Pour cela, nous avons réalisé un suivi prolongé des animaux (au delà de 84 jours) et des analyses histopathologiques associées à la détection immuno-histochimique de la cytokeratine et de l’alpha actine lisse. Il a été observé, avec toutes les doses et pour les deux souches, aussi bien dans la région antropylorique qu’iléo-caecale des animaux, la présence d’adénomes contenant un grand nombre de parasites. Nous avons noté pour la première fois au niveau de ces lésions néoplasiques la présence d’une desmoplasie et de bourgeons de cellules tumorales envahissant le chorion de la muqueuse. En plus de ces éléments histologiques caractéristiques des adénocarcinomes invasifs, les différentes colorations et marquages ont mis en évidence d’autres signes d’invasion: une membrane basale discontinue, la présence de cellules épithéliales au niveau du stroma et enfin une interruption de la muscularis mucosa, voire une invasion de la musculeuse. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés aux voies de cancérogénèse impliquées dans le processus d’induction des lésions néoplasiques par C. parvum (IOWA) au niveau de la région iléocæcale. Afin d’initier nos travaux dans cette perspective, nous avons choisi quatre marqueurs impliqués dans les principales voies altérées dans les cancers colorectaux: APC, Beta-catenine, P53 et K-ras. Des études immunohistochimiques ont été réalisées et nous ont permis de noter qu’il y avait une localisation anormale aussi bien de l’APC, que de la Beta-catenine ou de la P53. La Beta-catenine (normalement localisée au niveau de la membrane cellulaire) et la P53 (normalement localisée dans le noyau) s’accumulent dans le cytoplasme alors que le marquage de l’APC dans les cellules néoplasiques diminue, voire même disparait. Le marquage de K-ras, quant à lui, est toujours membranaire comme dans les cellules normales. Tout cela semble indiquer l’implication des voies P53 et Wnt dans le phénomène de cancérogénèse chez notre modèle de souris (SCID-D). Des études visant à rechercher d’autres marqueurs et d’éventuelles mutations des gènes codant ces protéines sont en cours

Cryptosporidium infection of dexamethasone-treated mice : Characterization of the cancerogenic process of gastrointestinal epithelial cells

Au vu des travaux de Certad et de ses collaborateurs, nous savons que Cryptosporidium parvum est également capable d’induire des adénomes avec des néoplasies digestives intraépithéliales de bas grade et de haut grade, ainsi que des adénocarcinomes in situ, chez des souris SCID (Severe Combined Immunodeficiency) déficientes en lymphocytes T et B, traitées par la dexaméthasone (SCID-D). De plus, nous savons aussi que Cryptosporidium muris induit une infection chronique mais pas de lésions néoplasiques. C’est pour faire suite à ces observations que nous avons entrepris dans un premier temps de déterminer la dose minimale de Cryptosporidium parvum (souche IOWA d’origine animale) pouvant infecter ce modèle et induire des néoplasies digestives. Nous avons montré qu’une dose très faible de parasites (théoriquement 1 oocyste) est capable d’induire non seulement une infection chronique chez les souris (SCID-D) mais également l’apparition de lésions néoplasiques aussi bien dans la région antropylorique de l’estomac qu’au niveau de la région iléo-caecale et cela dès 45 jours post infection. Nous avons également suivi la progression de ces lésions à la suite d’infection des souris par plusieurs doses de C. parvum (souche IOWA) (théoriquement : 1, 10, 100 et 105 oocystes). Ce travail a également été réalisé après inoculation d’une souche de C. parvum d’origine humaine (isolée à partir d’un patient immunodeprimée soufrant d’une cryptosporidiose grave à la suite d’une noyade). Pour cela, nous avons réalisé un suivi prolongé des animaux (au delà de 84 jours) et des analyses histopathologiques associées à la détection immuno-histochimique de la cytokeratine et de l’alpha actine lisse. Il a été observé, avec toutes les doses et pour les deux souches, aussi bien dans la région antropylorique qu’iléo-caecale des animaux, la présence d’adénomes contenant un grand nombre de parasites. Nous avons noté pour la première fois au niveau de ces lésions néoplasiques la présence d’une desmoplasie et de bourgeons de cellules tumorales envahissant le chorion de la muqueuse. En plus de ces éléments histologiques caractéristiques des adénocarcinomes invasifs, les différentes colorations et marquages ont mis en évidence d’autres signes d’invasion: une membrane basale discontinue, la présence de cellules épithéliales au niveau du stroma et enfin une interruption de la muscularis mucosa, voire une invasion de la musculeuse. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés aux voies de cancérogénèse impliquées dans le processus d’induction des lésions néoplasiques par C. parvum (IOWA) au niveau de la région iléocæcale. Afin d’initier nos travaux dans cette perspective, nous avons choisi quatre marqueurs impliqués dans les principales voies altérées dans les cancers colorectaux: APC, Beta-catenine, P53 et K-ras. Des études immunohistochimiques ont été réalisées et nous ont permis de noter qu’il y avait une localisation anormale aussi bien de l’APC, que de la Beta-catenine ou de la P53. La Beta-catenine (normalement localisée au niveau de la membrane cellulaire) et la P53 (normalement localisée dans le noyau) s’accumulent dans le cytoplasme alors que le marquage de l’APC dans les cellules néoplasiques diminue, voire même disparait. Le marquage de K-ras, quant à lui, est toujours membranaire comme dans les cellules normales. Tout cela semble indiquer l’implication des voies P53 et Wnt dans le phénomène de cancérogénèse chez notre modèle de souris (SCID-D). Des études visant à rechercher d’autres marqueurs et d’éventuelles mutations des gènes codant ces protéines sont en cours.Certad and col, showed recently that Cryptosporidium parvum is also capable of inducing gastrointestinal adenomas with intraepithelial neoplasia of low and high grade, and adenocarcinomas in situ in SCID mice (Severe Combined immunodeficiency), treated with dexamethasone (SCID-D). In addition, we also know that Cryptosporidium muris induces a chronic infection but no neoplastic lesions.This is why we decided first to determine the minimum dose of C. parvum (IOWA) which can infect and cause digestive neoplasia in this model. This work allowed us to conclude that one oocyst is able to induce in SCID-D mice not only a chronic infection but also the development of neoplastic lesions in both the antropyloric region of the stomach and the ileocecal region at 45 days post infection. We also followed up the progression of these lesions after infection with several doses of C. parvum strain IOWA (theoretically: 1, 10, 100 and 105 oocysts). This work was also performed after inoculation of another strain of different origin isolated from an immunosupressed patient suffering from a severe cryptosporidiosis after a near-drowning). To do this we have achieved: an extended follow-up of animals (over 84 days) and an histopathological analysis based on immunohistochemical detection of cytokeratin and alpha smooth actin. For the first time it was noted with all doses and for the two strains, in both the antropyloric and ileocecal region of animals, a patern characteristic of invasif adenocarcinoma: desmoplasia and buds of tumor cells invading the lamina propria. In addition to these histological features, a discontinuous basement membrane, the presence of epithelial cells in the stroma, an interruption of the muscularis mucosa and an invasion of the muscularis were also detected. In the case of the strain of C. parvum of human origin, the adenocarcinoma also invaded the serosa and epithelial cells were observed inside blood vessels (vascular tumor emboli). Lesion’s progression was so fast that after only 60 days post-infection we observed at least, the invasion of the submucosa at ileocecal region. Furthermore, the results of this study showed for the first time the ability of an isolate of C. parvum of human origin to cause chologiocarcinoma in an experimental model. Finally, using an immunohistochemical approach, we explored metabolic pathways involved in the development of C. parvum-induced neoplastic lesions at the ileocecal region. Four markers involved in major pathways altered in colorectal cancer were chosen: APC, beta-catenin, p53 and K-ras. The assesment of tumor marker expression in the ileocaecal area showed an abnormal localization of APC, beta-catenin and p53. Beta-catenin and p53 accumulated in the cytoplasm, while APC labelling decreased or even disappeared. Meanwhile, K-ras was still at membrane level as in normal cells. these results suggest the involvement of p53 and Wnt pathway in the phenomenon of carcinogenesis in our mouse model (SCID-D). Studies to search the implication of other markers and possible mutations of the genes encoding these proteins are underway. In conclusion,, these findings show that different strains of C. parvum including a strain of human origin induce digestif invasive adenocarcinomas whatever the inoculum size administered to SCID-D mice. These results confirm the role of C. parvum in the induction of digestive cancer in immunocompromised hosts. In addition, the pathways involved in the process of carcinogenesis in mice (SCID-D) appeared to be the same as those altered in humans. Moreover, the Wnt signaling pathway in which the actin polymerization and rearrangement of the cytoskeleton are involved is a major event during Cryptosporidium infection and appears to play a role in the carcinogenic process induced by the parasite

La cryptosporidiose et son impact en santé publique

International audienceCryptosporidium est une cause majeure de diarrhée à travers le monde et l’infection par ce parasite touche en particulier les jeunes enfants et les patients immunodéprimés. La gravité de l’infection intestinale induite par ce protozoaire intracellulaire est variable et les symptômes cliniques de la cryptosporidiose dépendent non seulement de l'état nutritionnel et immunitaire de l'hôte mais également des facteurs de virulence du parasite. L’infection humaine résulte d’une propagation zoonotique (de l’animal à l’Homme) ou anthroponotique (inter-humaine) du parasite dont la transmission est facilitée par sa résistance aux nombreux désinfectants couramment utilisés. Les mesures de prévention et de contrôle de l’infection sont capitales pour la protection des groupes vulnérables car les options de traitement restent encore limitée

Prevalence, molecular identification, and risk factors for cryptosporidium infection in edible marine fish: A survey across sea areas surrounding France

Cryptosporidium, a zoonotic pathogen, is able to infect a wide range of hosts including wild and domestic animals, and humans. Although it is well known that some parasites are both fish pathogens and recognized agents of zoonosis with a public health impact, little information is available concerning the prevalence of Cryptosporidium in wild aquatic environments. To evaluate the prevalence of Cryptosporidium spp. in commercially important edible marine fish in different European seas (English channel, North sea, Bay of Biscay, Celtic sea and Mediterranean sea), 1,853 specimens were collected as part of two surveys. Nested PCR followed by sequence analysis at the 18S rRNA gene locus was used to identify Cryptosporidium spp. The overall prevalence of Cryptosporidium spp. in sampled fish reached 2.3% (35 out of 1,508) in a first campaign and 3.2% (11 out of 345) in a second campaign. Sequence and phylogenetic analysis of positive samples identified Cryptosporidium parvum (n = 10) and seven genotypes which exhibited between 7.3 and 10.1% genetic distance from C. molnari, with the exception of one genotype which exhibited only 0.5–0.7% genetic distance from C. molnari. Among 31 analyzed fish species, 11 (35.5%) were identified as potential hosts for Cryptosporidium. A higher prevalence of Cryptosporidium spp. was observed in larger fish, in fish collected during the spring-summer period, and in those caught in the North East Atlantic. Pollachius virens (saithe) was the most frequently Cryptosporidium positive species. In fish infected by other parasites, the risk of being Cryptosporidium positive increased 10-fold (OR: 9.95, CI: 2.32–40.01.04, P = 0.0002). Four gp60 subtypes were detected among the C. parvum positive samples: IIaA13G1R1, IIaA15G2R1, IIaA17G2R1, and IIaA18G3R1. These C. parvum subtypes have been previously detected in terrestrial mammals and may constitute an additional source of infection for other animals and in particular for humans. Microscopical examination of histological sections confirmed the presence of round bodies suggestive of the development of C. parvum within digestive glands. We report herein the first epidemiological and molecular data concerning the detection of Cryptosporidium in edible marine fish in European seas surrounding France broadening its host range and uncovering potential novel infection routes

La cryptosporidiose et son impact en santé publique

International audienceCryptosporidium est une cause majeure de diarrhée à travers le monde et l’infection par ce parasite touche en particulier les jeunes enfants et les patients immunodéprimés. La gravité de l’infection intestinale induite par ce protozoaire intracellulaire est variable et les symptômes cliniques de la cryptosporidiose dépendent non seulement de l'état nutritionnel et immunitaire de l'hôte mais également des facteurs de virulence du parasite. L’infection humaine résulte d’une propagation zoonotique (de l’animal à l’Homme) ou anthroponotique (inter-humaine) du parasite dont la transmission est facilitée par sa résistance aux nombreux désinfectants couramment utilisés. Les mesures de prévention et de contrôle de l’infection sont capitales pour la protection des groupes vulnérables car les options de traitement restent encore limitée