The cyclin-dependent kinase inhibitor Orysa;KRP1 plays an important role in seed development of rice

Kip-related proteins (KRPs) play a major role in the regulation of the plant cell cycle. We report the identification of five putative rice (Oryza sativa) proteins that share characteristic motifs with previously described plant KRPs. To investigate the function of KRPs in rice development, we generated transgenic plants overexpressing the Orysa; KRP1 gene. Phenotypic analysis revealed that overexpressed KRP1 reduced cell production during leaf development. The reduced cell production in the leaf meristem was partly compensated by an increased cell size, demonstrating the existence of a compensatory mechanism in monocot species by which growth rate is less reduced than cell production, through cell expansion. Furthermore, Orysa; KRP1 overexpression dramatically reduced seed filling. Sectioning through the overexpressed KRP1 seeds showed that KRP overproduction disturbed the production of endosperm cells. The decrease in the number of fully formed seeds was accompanied by a drop in the endoreduplication of endosperm cells, pointing toward a role of KRP1 in connecting endocycle with endosperm development. Also, spatial and temporal transcript detection in developing seeds suggests that Orysa; KRP1 plays an important role in the exit from the mitotic cell cycle during rice grain formation

Evaluation of metatarsal relationships in the biomechanics of 332 normal feet using the method of measuring relative lengthst

OBJECTIVE: To identify the mean normal length of the metatarsals and the most common metatarsal formulas through a simple measurement method, thereby providing surgeons with data for planning treatment on symptomatic individuals with biometric abnormalities of the foot. METHODS: We evaluated and measured dorsoplantar weight-bearing radiographs of normal adult feet (83 males and 83 females). RESULTS: We found relative mean lengths for metatarsus I of 125.4 mm for males and 115.1 mm for females; for metatarsus II, 127.8 mm for males and 117.3 mm for females; for metatarsus III, 123.4 mm for males and 113.5 mm for females; for metatarsus IV, 114.2 mm for males and 105.3 mm for females; for metatarsus V, 99.5 mm for males and 91.7 mm for females. The mean forefoot width was 87.1 mm for males and 80.8 mm for females. CONCLUSION: Feet with index minus occurred most frequently in both sexes, although all three metatarsal formulas can be considered to be normal patterns. The mean normal pattern for males and females respectively was the following: metatarsus I 2.4 mm and 2.2 mm shorter than metatarsus II; metatarsus III 4.4 mm and 3.8 mm shorter than metatarsus II; metatarsus IV 9.2 mm and 8.2 mm shorter than metatarsus III; metatarsus V 14.7 mm and 13.6 mm shorter than metatarsus IV.OBJETIVO: Identificar o comprimento normal médio dos metatarsais e as fórmulas metatarsais mais comuns, através de um método de mensuração simples, fornecendo substrato ao cirurgião para o planejamento do tratamento dos portadores sintomáticos de alterações biométricas do pé. MÉTODOS: Avaliamos e mensuramos radiografias de adultos com pés normais na incidência dorso-plantar com carga, sendo 83 do sexo masculino e 83 do feminino. RESULTADOS: Encontramos o valor relativo médio do comprimento metatarsal para os homens e para as mulheres, respectivamente, de 125,4mm e 115,1mm para o I metatarsal; de 127,8mm e 117,3mm para o II metatarsal; de 123,4mm e 113,5mm para o III metatarsal; de 114,2mm e 105,3mm para o IV metatarsal e de 99,5mm e 91,7mm para o V metatarsal. A largura média do antepé para os homens foi de 87,1mm e para as mulheres, 80,8mm. CONCLUSÃO: Pés com Index minus em ambos os sexos foram mais frequentes, embora as três fórmulas metatarsais devam ser consideradas normais. O padrão médio normal para homens e para mulheres respectivamente foi o seguinte: o I metatarsal 2,4mm e 2,2mm menor que o II. O III foi menor que o II em 4,4mm e 3,8mm. O IV metatarsal foi 9,2mm e 8,2mm menor que o III. O V foi 14,7mm e 13,6mm menor que o IV.Faculdade de Medicina do ABCUNIFESP Departamento de Ortopedia e TraumatologiaUNIFESP, Depto. de Ortopedia e TraumatologiaSciEL

Ectopic expression of Kip-related proteins restrains root-knot nematode-feeding site expansion

The development of nematode feeding sites induced by root-knot nematodes involves the synchronized activation of cell cycle processes such as acytokinetic mitoses and DNA amplification. A number of key cell cycle genes are reported to be critical for nematode feeding site development. However, it remains unknown whether plant cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors such as the Arabidopsis interactor/inhibitor of CDK (ICK)/Kip-related protein (KRP) family are involved in nematode feeding site development. This study demonstrates the involvement of Arabidopsis ICK2/KRP2 and ICK1/KRP1 in the control of mitosis to endoreduplication in galls induced by the root-knot nematode Meloidogyne incognita. ! Using ICK/KRP promoter-GUS fusions and mRNA in situ hybridizations, we showed that ICK2/KRP2, ICK3/KRP5 and ICK4/KRP6 are expressed in galls after nematode infection. Loss-of-function mutants have minor effects on gall development and nematode reproduction. Conversely, overexpression of both ICK1/KRP1 and ICK2/KRP2 impaired mitosis in giant cells and blocked neighboring cell proliferation, resulting in a drastic reduction of gall size. ! Studying the dynamics of protein expression demonstrated that protein levels of ICK2/ KRP2 are tightly regulated during giant cell development and reliant on the presence of the nematode. ! This work demonstrates that impeding cell cycle progression by means of ICK1/KRP1 and ICK2/KRP2 overexpression severely restricts gall development, leading to a marked limitation of root-knot nematode development and reduced numbers of offsprin

Evaluation of the immunotherapeutic activity of probiotic LLHsp65 in asthma experimental

A asma alérgica é uma doença pulmonar de inflamação crônica caracterizada por uma resposta imune do tipo Th2 e uma das principais abordagens terapêuticas para o seu tratamento no futuro, poderia ser a imunoterapia baseada na modulação da resposta imune Th2 para um perfil Th1 e anti-inflamatório. Nosso grupo já demonstrou a eficácia de uma imunoterapia, baseada em um plasmídeo de DNA contendo o gene hsp65 de M. Leprae (DNAHsp65) em modelo murino de asma alérgica. No entanto, apesar dos excelentes resultados, o grupo está procurando outras alternativas imunoterapêuticas, usando a Hsp65 micobacteriana, para futura utilização clinica na área de saúde humana e veterinária. Efeitos benéficos na prevenção e tratamento de doenças alérgicas vêm sendo obtidos com o uso de probióticos. Nossa hipótese é de que uma nova formulação terapêutica, como o probiótico Lactococcus lactis expressando Hsp65 micobacteriana (LLHsp65), apresentaria vantagens significativas no desenvolvimento de pesquisas translacionais. Diante disso, este estudo teve como objetivo avaliar se o probiótico LLHsp65 apresenta atividades imunoterapêuticas no modelo de asma experimental induzida por ovalbumina (OVA). Em diferentes grupos experimentais, 5x109 CFU de LLHsp65 ou de L. lactis selvagem (LLSELV), foram administrados por via oral durante 10 dias consecutivos aos camundongos BALB/c previamente sensibilizados e desafiados com OVA. Em seguida, investigamos os efeitos do tratamento na inflamação alérgica, modulação do padrão de citocinas, produção de anticorpos específicos, hiper-responsividade das vias aéreas e inflamação pulmonar. Nossos resultados demonstraram que o tratamento oral com LLhsp65 modula a resposta imune alérgica de padrão Th2 para o perfil Th1 com aumento dos níveis de IFN-?, IL-12, TNF-?, IL-10, IL-6 e IL- 17, e com a redução das citocinas IL-4, IL-5 e IL-13. Os níveis de IgE e IgG1 anti-OVA no soro também foram significativamente diminuídos. Como consequência desses resultados, também observamos diminuição significativa do infiltrado de eosinófilos no lavado broncoalveolar, na hiper-responsividade nas vias aéreas e a atenuação da inflamação e produção de muco no tecido pulmonar, quando comparados com o grupo controle (OVA/SAL). Por conseguinte, nossos resultados demonstraram que a administração oral de LLHsp65 proporciona uma melhora significativa do processo inflamatório alérgico induzido por OVA, sendo portanto, uma estratégia terapêutica promissora para o desenvolvimento de pesquisa translacional no tratamento de asma alérgica.Allergic asthma is a chronic inflammatory lung disease characterized by a Th2-type immune response and one of the main therapeutic approaches to its treatment in the future could be immunotherapy based on the modulation of the Th2 immune response to a Th1 and anti-inflammatory profile. Our group has already demonstrated the efficacy of an immunotherapy based on a DNA plasmid carrying the mycobacterial hsp65 gene (DNAHsp65) in murine model of allergic asthma. However, despite the excellent results, our group is looking for other immunotherapeutic alternatives, using mycobacterial Hsp65, for future clinical use in the area of human and veterinary health. Beneficial effects in the prevention and treatment of allergic diseases have been obtained with the use of probiotics. Our hypothesis is that a new therapeutic formulation, such as the probiotic Lactococcus lactis expressing mycobacterial Hsp65 (LLHsp65), would present significant advantages in the development of translational research. The objective of this study was to evaluate whether the probiotic LLHsp65 has immunotherapeutic activities in the ovalbumin-induced asthma model. In different experimental groups, 5x109 CFU of LLHsp65 or control L. lactis (ctLL) were administered orally for 10 consecutive days to BALB/c mice previously sensitized and challenged with OVA. We then investigated the effects of treatment on allergic inflammation, modulation of the cytokine pattern, production allergen-specific antibodies, airway hyperresponsiveness and pulmonary inflammation. Our results demonstrated that oral treatment with LLhsp65 modulates the allergic Th2 immune response to Th1 profile with increased levels of IFN-?, IL-12, TNF-?, IL-10, IL-6 and IL-17 and with the reduction of IL-4, IL-5 and IL-13 cytokines. Serum anti-OVA IgE and IgG1 levels were also significantly decreased. Correspondingly with these results, we also observed a significant decrease in eosinophil infiltrate in bronchoalveolar lavage, airway hyper responsiveness and attenuation of inflammation and mucus production in lung tissue when compared to the control group (OVA/SAL). Therefore, our results demonstrated that oral administration of LLHsp65 provides a significant improvement of the OVA-induced allergic inflammatory process and is therefore a promising therapeutic strategy for the development of translational research in the treatment of allergic asthma

Cálculos de estrutura electrónica de fosfitos quirais e seus complexos metálicos: Avaliação na reacção de hidrogenação catalítica

O trabalho descrito nesta dissertação orientou-se no sentido de recorrer à utilização de métodos computacionais para determinar a estrutura de mais baixa energia de fosfitos, derivados do BINOL e de alguns dos seus complexos metálicos, de forma a racionalizar/interpretar dados experimentais obtidos na reacção de hidrogenação catalítica assimétrica de olefinas. Os estudos efectuados têm um cariz pluridisciplinar, envolvendo a síntese de um monofosfito quiral, do tipo P(OR)3 derivado do BINOL, cálculos de estrutura electrónica de ligandos e seus complexos metálicos pelos métodos semi-empírico PM6 e DFT e ainda, a sua avaliação como catalisadores de ródio em reacções de hidrogenação catalítica assimétrica. Assim, numa primeira fase, procedeu-se à optimização da estrutura electrónica dos ligandos do tipo monofosfito de simetria C3, com quiralidade helicoidal, o tris[(S)-2’-adamantanoato de 1,1’-binafto- 2-ilo] fosfito, e o tris[(S)-2’-benziloxi-1,1’-binafto-2-ilo] fosfito, a nível PM6 e DFT. Destes resultados foi possível observar uma boa correlação entre os resultados obtidos pelos dois métodos, principalmente para o ligando com menor liberdade conformacional, imposta pelo grupo substituinte na posição 2’ do BINOL, o adamantanoato, bem como determinar alguns parâmetros relevantes para a análise dos resultados catalíticos, nomeadamente, o ângulo cónico. Foram ainda efectuados cálculos de estrutura electrónica, pelos mesmos métodos, para os ligandos ditópicos do tipo bis-BINOL-fosfito, derivados da piridina, o 2,6-bis((11bR)-dinafto[2,1- d:1’,2’-f][1,3,2]dioxafosfepin-4-iloxi)piridina, e o 2,6-bis((11bR)-dinafto[2,1-d:1’,2’- f][1,3,2]dioxafosfepin-4-iloxi)metil)piridina, onde também se observou concordância entre os dois métodos utilizados. viii Seguidamente, procedeu-se à síntese dos complexos de ródio destes ligandos e caracterização por RMN de 31P, o que permitiu propor estruturas para esses complexos, as quais foram corroboradas por cálculos de estrutura electrónica, a nível PM6 e DFT. Dos estudos experimentais de hidrogenação catalítica assimétrica do itaconato de dimetilo, com os complexos de ródio dos ligandos tris[(S)-2’-adamantanoato de 1,1’-binafto-2-ilo] fosfito, tris[(S)-2’- benziloxi-1,1’-binafto-2-ilo] fosfito, 2,6-bis((11bR)-dinafto[2,1-d:1’,2’-f][1,3,2]dioxafosfepin-4- iloxi)piridina e 2,6-bis((11bR)-dinafto[2,1-d:1’,2’-f][1,3,2]dioxafosfepin-4-iloxi)metil)piridina, observase uma forte dependência da estrutura dos ligandos na actividade e enantiosselectividade da reacção, assim como da pressão global de hidrogénio. O complexo de ródio do ligando do tipo bis-BINOL-fosfito, 2,6-bis((11bR)-dinafto[2,1-d:1’,2’- f][1,3,2]dioxafosfepin-4-iloxi)metil)piridina, revelou ser o mais activo com 96 % de conversão após 24 horas, mas apenas com 23 % excesso enantiomérico. Por outro lado, o complexo de ródio do monofosfito tris[(S)-2’-adamantanoato de 1,1’-binafto-2-ilo] fosfito originou sistemas moderadamente activos, com 36 % de conversão às 24 horas e 87 % às 48 horas, mas com enantiosselectividade de 62%. Este resultado foi interpretado pelas estruturas obtidas a partir dos cálculos de estrutura electrónica e estudos de RMN de 31P do complexo em solução, que apontam para a existência de uma estrutura organizada do tipo M, com pouca liberdade conformacional, imposta pela presença de um grupo rígido e volumoso, o adamantanoato, na posição 2’ do BINOL, tendo-se atribuído como um dos principais factores para a elevada indução de quiralidade do sistema catalítico

Evaluation of the immunotherapeutic activity of probiotic LLHsp65 in asthma experimental

A asma alérgica é uma doença pulmonar de inflamação crônica caracterizada por uma resposta imune do tipo Th2 e uma das principais abordagens terapêuticas para o seu tratamento no futuro, poderia ser a imunoterapia baseada na modulação da resposta imune Th2 para um perfil Th1 e anti-inflamatório. Nosso grupo já demonstrou a eficácia de uma imunoterapia, baseada em um plasmídeo de DNA contendo o gene hsp65 de M. Leprae (DNAHsp65) em modelo murino de asma alérgica. No entanto, apesar dos excelentes resultados, o grupo está procurando outras alternativas imunoterapêuticas, usando a Hsp65 micobacteriana, para futura utilização clinica na área de saúde humana e veterinária. Efeitos benéficos na prevenção e tratamento de doenças alérgicas vêm sendo obtidos com o uso de probióticos. Nossa hipótese é de que uma nova formulação terapêutica, como o probiótico Lactococcus lactis expressando Hsp65 micobacteriana (LLHsp65), apresentaria vantagens significativas no desenvolvimento de pesquisas translacionais. Diante disso, este estudo teve como objetivo avaliar se o probiótico LLHsp65 apresenta atividades imunoterapêuticas no modelo de asma experimental induzida por ovalbumina (OVA). Em diferentes grupos experimentais, 5x109 CFU de LLHsp65 ou de L. lactis selvagem (LLSELV), foram administrados por via oral durante 10 dias consecutivos aos camundongos BALB/c previamente sensibilizados e desafiados com OVA. Em seguida, investigamos os efeitos do tratamento na inflamação alérgica, modulação do padrão de citocinas, produção de anticorpos específicos, hiper-responsividade das vias aéreas e inflamação pulmonar. Nossos resultados demonstraram que o tratamento oral com LLhsp65 modula a resposta imune alérgica de padrão Th2 para o perfil Th1 com aumento dos níveis de IFN-?, IL-12, TNF-?, IL-10, IL-6 e IL- 17, e com a redução das citocinas IL-4, IL-5 e IL-13. Os níveis de IgE e IgG1 anti-OVA no soro também foram significativamente diminuídos. Como consequência desses resultados, também observamos diminuição significativa do infiltrado de eosinófilos no lavado broncoalveolar, na hiper-responsividade nas vias aéreas e a atenuação da inflamação e produção de muco no tecido pulmonar, quando comparados com o grupo controle (OVA/SAL). Por conseguinte, nossos resultados demonstraram que a administração oral de LLHsp65 proporciona uma melhora significativa do processo inflamatório alérgico induzido por OVA, sendo portanto, uma estratégia terapêutica promissora para o desenvolvimento de pesquisa translacional no tratamento de asma alérgica.Allergic asthma is a chronic inflammatory lung disease characterized by a Th2-type immune response and one of the main therapeutic approaches to its treatment in the future could be immunotherapy based on the modulation of the Th2 immune response to a Th1 and anti-inflammatory profile. Our group has already demonstrated the efficacy of an immunotherapy based on a DNA plasmid carrying the mycobacterial hsp65 gene (DNAHsp65) in murine model of allergic asthma. However, despite the excellent results, our group is looking for other immunotherapeutic alternatives, using mycobacterial Hsp65, for future clinical use in the area of human and veterinary health. Beneficial effects in the prevention and treatment of allergic diseases have been obtained with the use of probiotics. Our hypothesis is that a new therapeutic formulation, such as the probiotic Lactococcus lactis expressing mycobacterial Hsp65 (LLHsp65), would present significant advantages in the development of translational research. The objective of this study was to evaluate whether the probiotic LLHsp65 has immunotherapeutic activities in the ovalbumin-induced asthma model. In different experimental groups, 5x109 CFU of LLHsp65 or control L. lactis (ctLL) were administered orally for 10 consecutive days to BALB/c mice previously sensitized and challenged with OVA. We then investigated the effects of treatment on allergic inflammation, modulation of the cytokine pattern, production allergen-specific antibodies, airway hyperresponsiveness and pulmonary inflammation. Our results demonstrated that oral treatment with LLhsp65 modulates the allergic Th2 immune response to Th1 profile with increased levels of IFN-?, IL-12, TNF-?, IL-10, IL-6 and IL-17 and with the reduction of IL-4, IL-5 and IL-13 cytokines. Serum anti-OVA IgE and IgG1 levels were also significantly decreased. Correspondingly with these results, we also observed a significant decrease in eosinophil infiltrate in bronchoalveolar lavage, airway hyper responsiveness and attenuation of inflammation and mucus production in lung tissue when compared to the control group (OVA/SAL). Therefore, our results demonstrated that oral administration of LLHsp65 provides a significant improvement of the OVA-induced allergic inflammatory process and is therefore a promising therapeutic strategy for the development of translational research in the treatment of allergic asthma

ADVANCED MICROWAVE TECHNOLOGY IN RADIOPHARMACEUTICAL SYNTHESIS

Tese de Doutoramento em Ciências Farmacêuticas, Química Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra.Nuclear medicine is a very powerful tool in the diagnosis and treatment of multiple pathologies with important clinical and research applications in areas such as oncology, cardiology, and neurosciences. In the basis of this important clinical speciality is the use of radiopharmaceuticals, molecules that include a radioisotope in their composition and therefore allow us to map in detail molecular processes and interactions in living organisms. Many different radionuclides have been used since the 1940’s for multiple clinical applications. In the diagnostic setting, most of the efforts in recent years have been directed towards positron emitters. Of those, the most important are 11C and 18F with half-lives of 20 and 109 minutes, respectively. These physical characteristics make radiopharmaceutical production quite challenging. The radioactivity produced must be enough to complete chemical synthesis, purification, quality control and the clinical examination. In practice, a radiopharmaceutical synthesis process should be automatic, fast, robust, reproducible, and present good chemical and radiochemical yields. The work leading to this PhD thesis focuses on the implementation of a fully automated GMP synthesis process of 6-[18F]FDOPA necessary to support the request to the Portuguese authorities, to produce and distribute the radiopharmaceutical. The main interest of this radiopharmaceutical lies in its clinical application, not only in neurology, but also in oncology, in the diagnosis of neuroendocrine tumours. In this thesis we describe the implementation of a production process of 6-[18F]FDOPA as well as the submission of an application for authorisation for its commercialisation. The company ICNAS-P being authorised to market it since June 2019. Its complex and expensive synthesis process means that there are very few centres producing and marketing it, which makes it difficult for clinicians to access the radiopharmaceutical. In order to improve the yields of this process, microwave heating was applied to critical steps of this process, such as in the drying of [18F]fluoride,18F-fluorination of possible 6-[18F]FDOPA precursors and hydrolysis of protected 6-[18F]FDOPA. In all steps a reduction of reaction time was observed, being the most significant in hydrolysis, with a reduction from 20 to 3.4 minutes, which means a reduction of about 80% in hydrolysis time. Additionally, a new possible precursor for 6-[18F]FDOPA was synthesised and fully characterised, with isolated yields of 23%. Another challenging process was the synthesis of [11C]UCB-J, a radiopharmaceutical used to quantify synaptic density in vivo, whose synthesis is performed via the palladium-catalysed Suzuki-Miyaura cross-coupling. One of the main challenges for the implementation of this production in the routine, had to do with all the conditions that this type of reactions requires, de-aeration of solvents, agitation, reaction temperature, which were implemented for the first time, in reactions with carbon-11, at ICNAS-P. Considering the 20 minutes half-life of carbon-11, the low radiochemical yields obtained with conventional heating led to the need of its optimisation. Different solvents, reaction times, as well as the influence of precursor activation were tested. Additionally, the effect of microwave heating vs. conventional heating was compared. The development resulted in a robust, reproducible process, with a yield of 53%, dc, in 55 minutes by conventional heating and a yield of 51%, dc, in 49 minutes by microwave, minus 6 minutes total time which, means a 20 % reduction in time.A medicina nuclear é uma ferramenta poderosa no diagnóstico de doenças com importantes aplicações clínicas e de investigação em áreas como Oncologia, Cardiologia e Neurociências. Na base desta importante especialidade clínica está o uso de radiofármacos, moléculas que incluem um radioisótopo na sua composição e, portanto, permitem-nos mapear em detalhe processos moleculares e interações em organismos vivos. Vários radionuclídeos têm sido utilizados para múltiplas aplicações clínicas, desde a década de 1940. No contexto de diagnóstico, a maioria dos esforços nos últimos anos têm sido direcionados para emissores de positrões. Destes, os mais importantes são o 11C e o 18F, com meias-vidas curtas, de 20 e 109 minutos, respetivamente. Estas características físicas tornam a produção de radiofármacos bastante desafiante. A radioatividade produzida deve ser suficiente para efetuar a síntese química completa, o controlo de qualidade e o exame clínico. Na prática, um processo de síntese de um radiofármaco, deve ser automático, rápido, robusto, reprodutível e apresentar bons rendimentos químicos e radioquímicos. O trabalho que conducente à escrita desta tese de doutoramento centra-se na implementação de um processo de síntese de GMP totalmente automatizado de 6-[18F]FDOPA, necessário para suportar o pedido de autorização, às autoridades portuguesas, para produzir e distribuir o radiofármaco. O principal interesse neste agente de diagnóstico assenta na sua aplicação clínica, não só na neurologia, mas também na oncologia, no diagnóstico de tumores neuroendócrinos. Nesta tese, será descrita a implementação de um processo de produção de 6-[18F]FDOPA, necessária ao pedido de autorização para a sua comercialização. A ICNAS-P está autorizada a comercializá-lo desde junho de 2019. A complexidade e o custo associado ao processo de produção deste radiofármaco, faz com que haja muito poucos centros que o produzem e comercializam, dificultando o acesso dos médicos a este agente de diagnóstico. De forma a melhorar os rendimentos deste processo, o aquecimento por micro-ondas foi aplicado em etapas críticas deste processo, tais como na secagem do [18F]fluoreto, a 18F-fluoração de possíveis precursores de 6-[18F]FDOPA e hidrólise de grupos protetores nos intermediários de 6-[18F]FDOPA. Em todas as etapas observou-se uma redução do tempo de reação, sendo a mais significativa na reação de hidrólise de grupos protetores, com uma redução de 20 para 3,4 minutos, o que significa uma redução de cerca de 80% no tempo dessa etapa de reação. Adicionalmente, foi sintetizado e caracterizado um novo possível precursor de 6-[18F]FDOPA, com rendimento isolado de 23%. Outro processo desafiante foi a síntese de [11C]UCB-J, um radiofármaco usado para quantificar a densidade sináptica in vivo, cuja síntese é realizada através do acoplamento de Suzuki-Miyaura. Um dos principais desafios para a implementação deste processo de produção na rotina, teve a ver com todas as condições que este tipo de reações, que foram implementadas pela primeira vez, em reações de marcação com carbono-11, na ICNAS-P. Considerando os 20 minutos de meia-vida do carbono-11, e os baixos rendimentos radioquímicos obtidos na síntese deste radiofármaco, procedeu-se à otimização. Foram testados diferentes solventes, tempos de reação, bem como a influência da ativação do precursor. Adicionalmente, o efeito do aquecimento micro-ondas vs aquecimento convencional foi também comparado. O desenvolvimento resultou num processo robusto e reprodutível, com um rendimento de 53%, dc, em 55 minutos por aquecimento convencional e um rendimento de 51%, dc, em 49 minutos por micro-ondas, menos 6 minutos de tempo total, o que significa uma redução de 20 % no tempo.ICNAS-Produção Unipessoal, Ld

Core cell cycle regulatory genes in rice and their expression profiles across the growth zone of the leaf

Rice (Oryza sativa L.) as a model and crop plant with a sequenced genome offers an outstanding experimental system for discovering and functionally analyzing the major cell cycle control elements in a cereal species. In this study, we identified the core cell cycle genes in the rice genome through a hidden Markov model search and multiple alignments supported with the use of short protein sequence probes. In total we present 55 rice putative cell cycle genes with locus identity, chromosomal location, approximate chromosome position and EST accession number. These cell cycle genes include nine cyclin dependent-kinase (CDK) genes, 27 cyclin genes, one CKS gene, two RBR genes, nine E2F/DP/DEL genes, six KRP genes, and one WEE gene. We also provide characteristic protein sequence signatures encoded by CDK and cyclin gene variants. Promoter analysis by the FootPrinter program discovered several motifs in the regulatory region of the core cell cycle genes. As a first step towards functional characterization we performed transcript analysis by RT-PCR to determine gene specific variation in transcript levels along the rice leaves. The meristematic zone of the leaves where cells are actively dividing was identified based on kinematic analysis and flow cytometry. As expected, expression of the majority of cell cycle genes was exclusively associated with the meristematic region. However genes such as different D-type cyclins, DEL1, KRP1/3, and RBR2 were also expressed in leaf segments representing the transition zone in which cells start differentiation. © 2015, The Botanical Society of Japan and Springer Japan

Novel complexes of cyclin-dependent kinases and a cyclin-like protein from Arabidopsis thaliana with a function unrelated to cell division

Although the majority of cyclin-dependent kinases (CDKs) play a key role in cell cycle progression, recent evidence has shown that CDKs are also implicated in transcription regulation. Here, we describe two Arabidopsis CDKs designated Arath;CDKC;1 and Arath; CDKC;2. These CDKs share a PITAIRE signature in the cyclin-binding domain and the structural characteristics of mammalian CDK9. Yeast two-hybrid screens and immunoprecipitation assays identified CDKC-interacting proteins with homology to the animal cyclin T/cyclin K group. We suggest that these Arabidopsis CDKCs may be part of a kinase complex similar to the animal positive transcription elongation factor b, whose activity is essential for transcription control. Expression studies showed that Arath; CDKC transcripts are mainly confined to epidermal tissues and are most abundant in flower tissues. No expression was detected in actively dividing Arabidopsis tissues, suggesting a role for the CDKC proteins in differentiated cells