Crystal structures of the tRNA:m2G6 methyltransferase Trm14/TrmN from two domains of life

Methyltransferases (MTases) form a major class of tRNA-modifying enzymes needed for the proper functioning of tRNA. Recently, RNA MTases from the TrmN/Trm14 family that are present in Archaea, Bacteria and Eukaryota have been shown to specifically modify tRNAPhe at guanosine 6 in the tRNA acceptor stem. Here, we report the first X-ray crystal structures of the tRNA m2G6 (N2-methylguanosine) MTase TTCTrmN from Thermus thermophilus and its ortholog PfTrm14 from Pyrococcus furiosus. Structures of PfTrm14 were solved in complex with the methyl donor S-adenosyl-l-methionine (SAM or AdoMet), as well as the reaction product S-adenosyl-homocysteine (SAH or AdoHcy) and the inhibitor sinefungin. TTCTrmN and PfTrm14 consist of an N-terminal THUMP domain fused to a catalytic Rossmann-fold MTase (RFM) domain. These results represent the first crystallographic structure analysis of proteins containing both THUMP and RFM domain, and hence provide further insight in the contribution of the THUMP domain in tRNA recognition and catalysis. Electrostatics and conservation calculations suggest a main tRNA binding surface in a groove between the THUMP domain and the MTase domain. This is further supported by a docking model of TrmN in complex with tRNAPhe of T. thermophilus and via site-directed mutagenesis

Functional characterization of the YmcB and YqeV tRNA methylthiotransferases of Bacillus subtilis

Methylthiotransferases (MTTases) are a closely related family of proteins that perform both radical-S-adenosylmethionine (SAM) mediated sulfur insertion and SAM-dependent methylation to modify nucleic acid or protein targets with a methyl thioether group (–SCH3). Members of two of the four known subgroups of MTTases have been characterized, typified by MiaB, which modifies N6-isopentenyladenosine (i6A) to 2-methylthio-N6-isopentenyladenosine (ms2i6A) in tRNA, and RimO, which modifies a specific aspartate residue in ribosomal protein S12. In this work, we have characterized the two MTTases encoded by Bacillus subtilis 168 and find that, consistent with bioinformatic predictions, ymcB is required for ms2i6A formation (MiaB activity), and yqeV is required for modification of N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) to 2-methylthio-N6-threonylcarbamoyladenosine (ms2t6A) in tRNA. The enzyme responsible for the latter activity belongs to a third MTTase subgroup, no member of which has previously been characterized. We performed domain-swapping experiments between YmcB and YqeV to narrow down the protein domain(s) responsible for distinguishing i6A from t6A and found that the C-terminal TRAM domain, putatively involved with RNA binding, is likely not involved with this discrimination. Finally, we performed a computational analysis to identify candidate residues outside the TRAM domain that may be involved with substrate recognition. These residues represent interesting targets for further analysis

Functional characterization of the YmcB and YqeV tRNA methylthiotransferases of Bacillus subtilis

Methylthiotransferases (MTTases) are a closely related family of proteins that perform both radical-S-adenosylmethionine (SAM) mediated sulfur insertion and SAM-dependent methylation to modify nucleic acid or protein targets with a methyl thioether group (–SCH3). Members of two of the four known subgroups of MTTases have been characterized, typified by MiaB, which modifies N6-isopentenyladenosine (i6A) to 2-methylthio-N6-isopentenyladenosine (ms2i6A) in tRNA, and RimO, which modifies a specific aspartate residue in ribosomal protein S12. In this work, we have characterized the two MTTases encoded by Bacillus subtilis 168 and find that, consistent with bioinformatic predictions, ymcB is required for ms2i6A formation (MiaB activity), and yqeV is required for modification of N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) to 2-methylthio-N6-threonylcarbamoyladenosine (ms2t6A) in tRNA. The enzyme responsible for the latter activity belongs to a third MTTase subgroup, no member of which has previously been characterized. We performed domain-swapping experiments between YmcB and YqeV to narrow down the protein domain(s) responsible for distinguishing i6A from t6A and found that the C-terminal TRAM domain, putatively involved with RNA binding, is likely not involved with this discrimination. Finally, we performed a computational analysis to identify candidate residues outside the TRAM domain that may be involved with substrate recognition. These residues represent interesting targets for further analysis

Deletion of CDKAL1 Affects Mitochondrial ATP Generation and First-Phase Insulin Exocytosis

A variant of the CDKAL1 gene was reported to be associated with type 2 diabetes and reduced insulin release in humans; however, the role of CDKAL1 in β cells is largely unknown. Therefore, to determine the role of CDKAL1 in insulin release from β cells, we studied insulin release profiles in CDKAL1 gene knockout (CDKAL1 KO) mice.Total internal reflection fluorescence imaging of CDKAL1 KO β cells showed that the number of fusion events during first-phase insulin release was reduced. However, there was no significant difference in the number of fusion events during second-phase release or high K(+)-induced release between WT and KO cells. CDKAL1 deletion resulted in a delayed and slow increase in cytosolic free Ca(2+) concentration during high glucose stimulation. Patch-clamp experiments revealed that the responsiveness of ATP-sensitive K(+) (K(ATP)) channels to glucose was blunted in KO cells. In addition, glucose-induced ATP generation was impaired. Although CDKAL1 is homologous to cyclin-dependent kinase 5 (CDK5) regulatory subunit-associated protein 1, there was no difference in the kinase activity of CDK5 between WT and CDKAL1 KO islets.We provide the first report describing the function of CDKAL1 in β cells. Our results indicate that CDKAL1 controls first-phase insulin exocytosis in β cells by facilitating ATP generation, K(ATP) channel responsiveness and the subsequent activity of Ca(2+) channels through pathways other than CDK5-mediated regulation

Analyse structurale et fonctionnelle de la réplication et de la transcription des Bunyavirales

The Bunyavirales order encompasses over 500 species of segmented negative stranded RNA viruses (sNSV). Widespread throughout the world and considered as emerging viruses, the infection of humans by bunyaviruses can lead to serious diseases. In the Hantaviridae family, hemorrhagic fevers have been reported after Hantaan virus (HTNV) infection, while in the Peribunyaviridae family, La Crosse virus (LACV) infections have resulted in cases of encephalitis in children. In addition, the order Bunyavirales is related to other sNSVs such as influenza virus (Orthomyxoviridae), an infectious agent responsible for seasonal epidemics.The genomes of HTNV and LACV consist of three segments that encode four structural proteins: the glycoproteins (Gn and Gc), encoded on the M segment, the nucleoprotein (NP), encoded on the S segment and the polymerase, also known as L protein, encoded on the L segment. During infection, NPs protect the viral genome from damage and against innate immune response of the infected cell by multimerizing around the viral genome. These protein-RNA complexes form helical assemblies called nucleocapsids (NC). Both the 5' and 3' ends of each segment of the viral genome (vRNA) are respectively bound to an L protein. Interactions between L, NP and vRNA form a circularized complex called ribonucleoprotein (RNP). The RNPs present in the virus are the functional units that perform the replication and the transcription of each of the three viral segments.The replication of the vRNA first consists in the production of the complementary genome (cRNA) using vRNA as template, followed by the generation of new vRNA based on the cRNA template. The L protein, and in particular its RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) region, plays an essential role in this reaction. During infection, the L protein also initiates the production of messenger RNAs that encode viral proteins. It first “steals” a 5' capped RNA segment from the infected cell via its cap-binding domain (CBD). This capped RNA is then cleaved by an endonuclease domain (ENDO) also present in the L protein, which ultimately initiates the synthesis of viral messenger RNA (mRNA) thanks to the RdRp catalytic domain: this is transcription.Currently, there is no treatment to counteract bunyavirus infections. It is therefore crucial to analyze the essential steps of their viral cycle described above in order to understand their mechanism of operation and potentially allow the development of new antiviral treatments.The overall objective of this thesis was to take advantage of cryo-electron microscopy to structurally and functionally characterize two major actors of replication and transcription in bunyaviruses, NPs and L proteins, using HTNV and LACV as models. I first determined the high-resolution structure of the recombinant HTNV nucleocapsid (HTNV-NC) to characterize the different interactions between the different NPs and understand the mechanism of encapsidation of the vRNA within the HTNV-NCs. Secondly, I determined the cryo-EM structures of both HTNV and LACV L proteins (respectively called HTNV-L and LACV-L) in complex with the 5' and 3' promoter regions. Finally, I performed the functional characterization of LACV-L via the implementation of in vitro activity assays. This enabled to stall LACV-L in several key stages of both replication and transcription, a pre-requisite that permitted the determination of seven high-resolution structures of LACV-L in action. The combination of these structural snapshots shows with unprecedented details the mechanisms underlying peribunyaviruses replication and transcription.L’ordre des Bunyavirales englobe plus de 450 espèces de virus à ARN négatif segmenté (sNSV). Répandus dans le monde entier et considérés comme émergents, l’infection de l'homme par certains Bunyavirus peut entrainer de graves maladies. Chez la famille des Hantaviridae, le virus Hantaan (HTNV) provoque des fièvres hémorragiques tandis que chez les Peribunyaviridae, le virus La Crosse (LACV) entraine des cas d’encéphalites chez les enfants. De plus, l’ordre des Bunyavirales est proche d’autres sNSV comme le virus influenza (Orthomyxoviridae), un agent infectieux responsable d’épidémies saisonnières.Les génomes d’HTNV et de LACV sont constitués de trois segments codant pour quatre protéines structurales : les glycoprotéines (Gn et Gc), encodées sur le segment M, la nucléoprotéine (NP), encodée sur le segment S et la polymérase, aussi appelée protéine L, encodée sur le segment L. Au cours d’une infection, les NPs protègent le génome viral des dégradations et de la réponse immunitaire innée de la cellule infectée en multimérisant autour du génome viral. Ces complexes protéine-ARN forment des assemblages hélicoïdaux appelés nucléocapsides (NC). Les extrémités 5′ et 3′ de chacun des segments du génome viral (ARNv) sont liées à une protéine L. Le complexe L-NP-ARN, appelé particule ribonucléoprotéique (RNP), représente l’unité fonctionnelle nécessaire à la réalisation de deux étapes essentielles à la suite de l’infection virale : la réplication et la transcription des trois segments qui composent l’ARNv.La réplication de l’ARNv débute par la production d’un génome viral complémentaire (ARNc) en prenant l’ARNv comme modèle, suivie de la genèse de nouveaux ARNv, en se basant sur les ARNc. La protéine L, et en particulier son domaine ARN-polymérase ARN-dépendante (RdRp), joue un rôle central dans cette réaction. Au cours de l’infection, la protéine L permet également d’initier la production d’ARN messagers codant pour les quatre protéines virales. Pour cela, elle « vole » à la cellule infectée un segment d'ARN coiffé en 5′ via son domaine de liaison de la coiffe (CBD). Cet ARN coiffé est ensuite clivé par un domaine endonucléase (ENDO) également présent au sein de la protéine L et permettant in fine d’initier la synthèse de l'ARN messager (ARNm) viral au niveau de son domaine RdRp : c’est la transcription.Actuellement, il n’existe aucun traitement pour combattre les infections dues à ces virus. Il est donc crucial d'analyser les étapes essentielles de leur cycle viral décrites ci-dessus afin de comprendre leur mécanisme de fonctionnement et de potentiellement permettre le développement de nouveaux traitements antiviraux.L’objectif global de cette thèse était donc de tirer profit des derniers développements en cryo-microscopie électronique (cryo-ME) afin de caractériser au niveau structural puis au niveau fonctionnel, deux acteurs majeurs de la réplication et de la transcription chez les Bunyavirus en utilisant comme modèle d’étude les NPs et les protéines L de HTNV et LACV. Au cours de cette thèse, j’ai tout d’abord déterminé la structure à haute résolution de la nucléocapside recombinante du HTNV (HTNV-NC) afin de caractériser les différentes interactions entre les NPs et de comprendre le mécanisme d’encapsidation de l’ARNv au sein des HTNV-NCs. Puis, j’ai déterminé les structures à résolution quasi-atomique de la protéine L du HTNV (HTNV-L) et du virus La Crosse (LACV-L) en complexe avec les régions promotrices 5’ et 3’ de l’ARNv. Enfin, j’ai caractérisé fonctionnellement LACV-L via la mise en place de tests d’activités réalisés in vitro. Ceci a permis de bloquer LACV-L à plusieurs étapes clés de la réplication et de la transcription, un prérequis qui m’a permis de déterminer sept structures à haute résolution de LACV-L en action. La combinaison de ces instantanés structuraux montre avec grande précision les mécanismes moléculaires sous-tendant la réplication et la transcription des Peribunyavirus

Analyse structurale et fonctionnelle de la réplication et de la transcription des Bunyavirales

The Bunyavirales order encompasses over 500 species of segmented negative stranded RNA viruses (sNSV). Widespread throughout the world and considered as emerging viruses, the infection of humans by bunyaviruses can lead to serious diseases. In the Hantaviridae family, hemorrhagic fevers have been reported after Hantaan virus (HTNV) infection, while in the Peribunyaviridae family, La Crosse virus (LACV) infections have resulted in cases of encephalitis in children. In addition, the order Bunyavirales is related to other sNSVs such as influenza virus (Orthomyxoviridae), an infectious agent responsible for seasonal epidemics.The genomes of HTNV and LACV consist of three segments that encode four structural proteins: the glycoproteins (Gn and Gc), encoded on the M segment, the nucleoprotein (NP), encoded on the S segment and the polymerase, also known as L protein, encoded on the L segment. During infection, NPs protect the viral genome from damage and against innate immune response of the infected cell by multimerizing around the viral genome. These protein-RNA complexes form helical assemblies called nucleocapsids (NC). Both the 5' and 3' ends of each segment of the viral genome (vRNA) are respectively bound to an L protein. Interactions between L, NP and vRNA form a circularized complex called ribonucleoprotein (RNP). The RNPs present in the virus are the functional units that perform the replication and the transcription of each of the three viral segments.The replication of the vRNA first consists in the production of the complementary genome (cRNA) using vRNA as template, followed by the generation of new vRNA based on the cRNA template. The L protein, and in particular its RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) region, plays an essential role in this reaction. During infection, the L protein also initiates the production of messenger RNAs that encode viral proteins. It first “steals” a 5' capped RNA segment from the infected cell via its cap-binding domain (CBD). This capped RNA is then cleaved by an endonuclease domain (ENDO) also present in the L protein, which ultimately initiates the synthesis of viral messenger RNA (mRNA) thanks to the RdRp catalytic domain: this is transcription.Currently, there is no treatment to counteract bunyavirus infections. It is therefore crucial to analyze the essential steps of their viral cycle described above in order to understand their mechanism of operation and potentially allow the development of new antiviral treatments.The overall objective of this thesis was to take advantage of cryo-electron microscopy to structurally and functionally characterize two major actors of replication and transcription in bunyaviruses, NPs and L proteins, using HTNV and LACV as models. I first determined the high-resolution structure of the recombinant HTNV nucleocapsid (HTNV-NC) to characterize the different interactions between the different NPs and understand the mechanism of encapsidation of the vRNA within the HTNV-NCs. Secondly, I determined the cryo-EM structures of both HTNV and LACV L proteins (respectively called HTNV-L and LACV-L) in complex with the 5' and 3' promoter regions. Finally, I performed the functional characterization of LACV-L via the implementation of in vitro activity assays. This enabled to stall LACV-L in several key stages of both replication and transcription, a pre-requisite that permitted the determination of seven high-resolution structures of LACV-L in action. The combination of these structural snapshots shows with unprecedented details the mechanisms underlying peribunyaviruses replication and transcription.L’ordre des Bunyavirales englobe plus de 450 espèces de virus à ARN négatif segmenté (sNSV). Répandus dans le monde entier et considérés comme émergents, l’infection de l'homme par certains Bunyavirus peut entrainer de graves maladies. Chez la famille des Hantaviridae, le virus Hantaan (HTNV) provoque des fièvres hémorragiques tandis que chez les Peribunyaviridae, le virus La Crosse (LACV) entraine des cas d’encéphalites chez les enfants. De plus, l’ordre des Bunyavirales est proche d’autres sNSV comme le virus influenza (Orthomyxoviridae), un agent infectieux responsable d’épidémies saisonnières.Les génomes d’HTNV et de LACV sont constitués de trois segments codant pour quatre protéines structurales : les glycoprotéines (Gn et Gc), encodées sur le segment M, la nucléoprotéine (NP), encodée sur le segment S et la polymérase, aussi appelée protéine L, encodée sur le segment L. Au cours d’une infection, les NPs protègent le génome viral des dégradations et de la réponse immunitaire innée de la cellule infectée en multimérisant autour du génome viral. Ces complexes protéine-ARN forment des assemblages hélicoïdaux appelés nucléocapsides (NC). Les extrémités 5′ et 3′ de chacun des segments du génome viral (ARNv) sont liées à une protéine L. Le complexe L-NP-ARN, appelé particule ribonucléoprotéique (RNP), représente l’unité fonctionnelle nécessaire à la réalisation de deux étapes essentielles à la suite de l’infection virale : la réplication et la transcription des trois segments qui composent l’ARNv.La réplication de l’ARNv débute par la production d’un génome viral complémentaire (ARNc) en prenant l’ARNv comme modèle, suivie de la genèse de nouveaux ARNv, en se basant sur les ARNc. La protéine L, et en particulier son domaine ARN-polymérase ARN-dépendante (RdRp), joue un rôle central dans cette réaction. Au cours de l’infection, la protéine L permet également d’initier la production d’ARN messagers codant pour les quatre protéines virales. Pour cela, elle « vole » à la cellule infectée un segment d'ARN coiffé en 5′ via son domaine de liaison de la coiffe (CBD). Cet ARN coiffé est ensuite clivé par un domaine endonucléase (ENDO) également présent au sein de la protéine L et permettant in fine d’initier la synthèse de l'ARN messager (ARNm) viral au niveau de son domaine RdRp : c’est la transcription.Actuellement, il n’existe aucun traitement pour combattre les infections dues à ces virus. Il est donc crucial d'analyser les étapes essentielles de leur cycle viral décrites ci-dessus afin de comprendre leur mécanisme de fonctionnement et de potentiellement permettre le développement de nouveaux traitements antiviraux.L’objectif global de cette thèse était donc de tirer profit des derniers développements en cryo-microscopie électronique (cryo-ME) afin de caractériser au niveau structural puis au niveau fonctionnel, deux acteurs majeurs de la réplication et de la transcription chez les Bunyavirus en utilisant comme modèle d’étude les NPs et les protéines L de HTNV et LACV. Au cours de cette thèse, j’ai tout d’abord déterminé la structure à haute résolution de la nucléocapside recombinante du HTNV (HTNV-NC) afin de caractériser les différentes interactions entre les NPs et de comprendre le mécanisme d’encapsidation de l’ARNv au sein des HTNV-NCs. Puis, j’ai déterminé les structures à résolution quasi-atomique de la protéine L du HTNV (HTNV-L) et du virus La Crosse (LACV-L) en complexe avec les régions promotrices 5’ et 3’ de l’ARNv. Enfin, j’ai caractérisé fonctionnellement LACV-L via la mise en place de tests d’activités réalisés in vitro. Ceci a permis de bloquer LACV-L à plusieurs étapes clés de la réplication et de la transcription, un prérequis qui m’a permis de déterminer sept structures à haute résolution de LACV-L en action. La combinaison de ces instantanés structuraux montre avec grande précision les mécanismes moléculaires sous-tendant la réplication et la transcription des Peribunyavirus

Insertion de soufre en biologie par voie radicalaire. Etude des méthylthiotransférases

One of the chemically most challenging problems in enzymology is the functionalization of non-reactive C–H bonds. Such reactions require specialized cofactors as heme, Fe-µ-oxo or vitamin B12. In 2001, special Fe-S centers able to bind S-Adenosylmethionine (SAM) have been shown to activate non-reactive C-H bonds toward subsequent functionalization. Enzymes containing this new cofactor constitute a super-family called “Radical SAM”. Methylthiotransferases (MTTases) belong to the “Radical SAM” super-family and catalyse the insertion of a methylthio group (-SCH3) in C-H bonds. By doing in vitro and in vivo experiments, we were able to classify them into three groups. The first class, (RimO) catalyses the formation of β-methylthio-aspartate 89 on the ribosomal protein S12 (β-ms-D89-S12) whereas the two others (MiaB and MtaB/eMtaB) respectively catalyse the thiomethylation of the nucleosides 2-methylthio-N6-isopentenyladenosine 37 (ms2i6A-37) and 2-methylthio-N6-threoninecarbamoyl adenosine 37 (ms2t6A-37) present in some tRNA. Our studies have shown that, in vitro, MTTases catalyse the insertion of a SCH3 group in a catalytic way suggesting entirely new radical sulfur insertion mechanisms.Un des problèmes majeurs en enzymologie est la fonctionnalisation de liaisons C-H peu réactives. Ces réactions nécessitent des cofacteurs spécialisés tels que l'hème, des Fer-oxo ou encore la vitamine B12. En 2001, il a été montré que des centres Fe-S particuliers liant la S-Adénosyle méthionine (SAM) pouvaient activer des liaisons C-H non réactives. Les enzymes utilisant ce cofacteur constituent une super-famille appelée « Radical SAM ». Les thiométhyltransférases (MTTases) sont des enzymes « Radical SAM » qui catalysent l'insertion d'un groupe thiométhyle (-SCH3) dans des liaisons C-H non réactives. Par des expériences in vivo et in vitro, nous avons montré qu'on pouvait les regrouper en trois classes. La première classe (RimO) catalyse la formation du β-thiométhylaspartate 89 sur la protéine ribosomale S12 (β-ms-D89-S12) alors que les deux dernières (MiaB et MtaB/eMtaB) catalysent respectivement la thiométhylation des nucléosides 2-methylthio-N6-isopentenyladenosine 37 (ms2i6A-37) et 2-methylthio-N6-threoninecarbamoyl adenosine 37 (ms2t6A-37) de certains ARNts. L'étude in vitro du mécanisme de ces enzymes a permis de démontrer que les MTTases catalysent l'insertion d'un groupement -SCH3 de façon catalytique invalidant l'hypothèse généralement retenue dans la littérature que le soufre inséré dérive de la destruction d'un centre Fe-S

Analyse structurale et fonctionnelle de la réplication et de la transcription des Bunyavirales

The Bunyavirales order encompasses over 500 species of segmented negative stranded RNA viruses (sNSV). Widespread throughout the world and considered as emerging viruses, the infection of humans by bunyaviruses can lead to serious diseases. In the Hantaviridae family, hemorrhagic fevers have been reported after Hantaan virus (HTNV) infection, while in the Peribunyaviridae family, La Crosse virus (LACV) infections have resulted in cases of encephalitis in children. In addition, the order Bunyavirales is related to other sNSVs such as influenza virus (Orthomyxoviridae), an infectious agent responsible for seasonal epidemics.The genomes of HTNV and LACV consist of three segments that encode four structural proteins: the glycoproteins (Gn and Gc), encoded on the M segment, the nucleoprotein (NP), encoded on the S segment and the polymerase, also known as L protein, encoded on the L segment. During infection, NPs protect the viral genome from damage and against innate immune response of the infected cell by multimerizing around the viral genome. These protein-RNA complexes form helical assemblies called nucleocapsids (NC). Both the 5' and 3' ends of each segment of the viral genome (vRNA) are respectively bound to an L protein. Interactions between L, NP and vRNA form a circularized complex called ribonucleoprotein (RNP). The RNPs present in the virus are the functional units that perform the replication and the transcription of each of the three viral segments.The replication of the vRNA first consists in the production of the complementary genome (cRNA) using vRNA as template, followed by the generation of new vRNA based on the cRNA template. The L protein, and in particular its RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) region, plays an essential role in this reaction. During infection, the L protein also initiates the production of messenger RNAs that encode viral proteins. It first “steals” a 5' capped RNA segment from the infected cell via its cap-binding domain (CBD). This capped RNA is then cleaved by an endonuclease domain (ENDO) also present in the L protein, which ultimately initiates the synthesis of viral messenger RNA (mRNA) thanks to the RdRp catalytic domain: this is transcription.Currently, there is no treatment to counteract bunyavirus infections. It is therefore crucial to analyze the essential steps of their viral cycle described above in order to understand their mechanism of operation and potentially allow the development of new antiviral treatments.The overall objective of this thesis was to take advantage of cryo-electron microscopy to structurally and functionally characterize two major actors of replication and transcription in bunyaviruses, NPs and L proteins, using HTNV and LACV as models. I first determined the high-resolution structure of the recombinant HTNV nucleocapsid (HTNV-NC) to characterize the different interactions between the different NPs and understand the mechanism of encapsidation of the vRNA within the HTNV-NCs. Secondly, I determined the cryo-EM structures of both HTNV and LACV L proteins (respectively called HTNV-L and LACV-L) in complex with the 5' and 3' promoter regions. Finally, I performed the functional characterization of LACV-L via the implementation of in vitro activity assays. This enabled to stall LACV-L in several key stages of both replication and transcription, a pre-requisite that permitted the determination of seven high-resolution structures of LACV-L in action. The combination of these structural snapshots shows with unprecedented details the mechanisms underlying peribunyaviruses replication and transcription.L’ordre des Bunyavirales englobe plus de 450 espèces de virus à ARN négatif segmenté (sNSV). Répandus dans le monde entier et considérés comme émergents, l’infection de l'homme par certains Bunyavirus peut entrainer de graves maladies. Chez la famille des Hantaviridae, le virus Hantaan (HTNV) provoque des fièvres hémorragiques tandis que chez les Peribunyaviridae, le virus La Crosse (LACV) entraine des cas d’encéphalites chez les enfants. De plus, l’ordre des Bunyavirales est proche d’autres sNSV comme le virus influenza (Orthomyxoviridae), un agent infectieux responsable d’épidémies saisonnières.Les génomes d’HTNV et de LACV sont constitués de trois segments codant pour quatre protéines structurales : les glycoprotéines (Gn et Gc), encodées sur le segment M, la nucléoprotéine (NP), encodée sur le segment S et la polymérase, aussi appelée protéine L, encodée sur le segment L. Au cours d’une infection, les NPs protègent le génome viral des dégradations et de la réponse immunitaire innée de la cellule infectée en multimérisant autour du génome viral. Ces complexes protéine-ARN forment des assemblages hélicoïdaux appelés nucléocapsides (NC). Les extrémités 5′ et 3′ de chacun des segments du génome viral (ARNv) sont liées à une protéine L. Le complexe L-NP-ARN, appelé particule ribonucléoprotéique (RNP), représente l’unité fonctionnelle nécessaire à la réalisation de deux étapes essentielles à la suite de l’infection virale : la réplication et la transcription des trois segments qui composent l’ARNv.La réplication de l’ARNv débute par la production d’un génome viral complémentaire (ARNc) en prenant l’ARNv comme modèle, suivie de la genèse de nouveaux ARNv, en se basant sur les ARNc. La protéine L, et en particulier son domaine ARN-polymérase ARN-dépendante (RdRp), joue un rôle central dans cette réaction. Au cours de l’infection, la protéine L permet également d’initier la production d’ARN messagers codant pour les quatre protéines virales. Pour cela, elle « vole » à la cellule infectée un segment d'ARN coiffé en 5′ via son domaine de liaison de la coiffe (CBD). Cet ARN coiffé est ensuite clivé par un domaine endonucléase (ENDO) également présent au sein de la protéine L et permettant in fine d’initier la synthèse de l'ARN messager (ARNm) viral au niveau de son domaine RdRp : c’est la transcription.Actuellement, il n’existe aucun traitement pour combattre les infections dues à ces virus. Il est donc crucial d'analyser les étapes essentielles de leur cycle viral décrites ci-dessus afin de comprendre leur mécanisme de fonctionnement et de potentiellement permettre le développement de nouveaux traitements antiviraux.L’objectif global de cette thèse était donc de tirer profit des derniers développements en cryo-microscopie électronique (cryo-ME) afin de caractériser au niveau structural puis au niveau fonctionnel, deux acteurs majeurs de la réplication et de la transcription chez les Bunyavirus en utilisant comme modèle d’étude les NPs et les protéines L de HTNV et LACV. Au cours de cette thèse, j’ai tout d’abord déterminé la structure à haute résolution de la nucléocapside recombinante du HTNV (HTNV-NC) afin de caractériser les différentes interactions entre les NPs et de comprendre le mécanisme d’encapsidation de l’ARNv au sein des HTNV-NCs. Puis, j’ai déterminé les structures à résolution quasi-atomique de la protéine L du HTNV (HTNV-L) et du virus La Crosse (LACV-L) en complexe avec les régions promotrices 5’ et 3’ de l’ARNv. Enfin, j’ai caractérisé fonctionnellement LACV-L via la mise en place de tests d’activités réalisés in vitro. Ceci a permis de bloquer LACV-L à plusieurs étapes clés de la réplication et de la transcription, un prérequis qui m’a permis de déterminer sept structures à haute résolution de LACV-L en action. La combinaison de ces instantanés structuraux montre avec grande précision les mécanismes moléculaires sous-tendant la réplication et la transcription des Peribunyavirus

Structural and functional analysis of Bunyavirales replication and transcription

L’ordre des Bunyavirales englobe plus de 450 espèces de virus à ARN négatif segmenté (sNSV). Répandus dans le monde entier et considérés comme émergents, l’infection de l'homme par certains Bunyavirus peut entrainer de graves maladies. Chez la famille des Hantaviridae, le virus Hantaan (HTNV) provoque des fièvres hémorragiques tandis que chez les Peribunyaviridae, le virus La Crosse (LACV) entraine des cas d’encéphalites chez les enfants. De plus, l’ordre des Bunyavirales est proche d’autres sNSV comme le virus influenza (Orthomyxoviridae), un agent infectieux responsable d’épidémies saisonnières.Les génomes d’HTNV et de LACV sont constitués de trois segments codant pour quatre protéines structurales : les glycoprotéines (Gn et Gc), encodées sur le segment M, la nucléoprotéine (NP), encodée sur le segment S et la polymérase, aussi appelée protéine L, encodée sur le segment L. Au cours d’une infection, les NPs protègent le génome viral des dégradations et de la réponse immunitaire innée de la cellule infectée en multimérisant autour du génome viral. Ces complexes protéine-ARN forment des assemblages hélicoïdaux appelés nucléocapsides (NC). Les extrémités 5′ et 3′ de chacun des segments du génome viral (ARNv) sont liées à une protéine L. Le complexe L-NP-ARN, appelé particule ribonucléoprotéique (RNP), représente l’unité fonctionnelle nécessaire à la réalisation de deux étapes essentielles à la suite de l’infection virale : la réplication et la transcription des trois segments qui composent l’ARNv.La réplication de l’ARNv débute par la production d’un génome viral complémentaire (ARNc) en prenant l’ARNv comme modèle, suivie de la genèse de nouveaux ARNv, en se basant sur les ARNc. La protéine L, et en particulier son domaine ARN-polymérase ARN-dépendante (RdRp), joue un rôle central dans cette réaction. Au cours de l’infection, la protéine L permet également d’initier la production d’ARN messagers codant pour les quatre protéines virales. Pour cela, elle « vole » à la cellule infectée un segment d'ARN coiffé en 5′ via son domaine de liaison de la coiffe (CBD). Cet ARN coiffé est ensuite clivé par un domaine endonucléase (ENDO) également présent au sein de la protéine L et permettant in fine d’initier la synthèse de l'ARN messager (ARNm) viral au niveau de son domaine RdRp : c’est la transcription.Actuellement, il n’existe aucun traitement pour combattre les infections dues à ces virus. Il est donc crucial d'analyser les étapes essentielles de leur cycle viral décrites ci-dessus afin de comprendre leur mécanisme de fonctionnement et de potentiellement permettre le développement de nouveaux traitements antiviraux.L’objectif global de cette thèse était donc de tirer profit des derniers développements en cryo-microscopie électronique (cryo-ME) afin de caractériser au niveau structural puis au niveau fonctionnel, deux acteurs majeurs de la réplication et de la transcription chez les Bunyavirus en utilisant comme modèle d’étude les NPs et les protéines L de HTNV et LACV. Au cours de cette thèse, j’ai tout d’abord déterminé la structure à haute résolution de la nucléocapside recombinante du HTNV (HTNV-NC) afin de caractériser les différentes interactions entre les NPs et de comprendre le mécanisme d’encapsidation de l’ARNv au sein des HTNV-NCs. Puis, j’ai déterminé les structures à résolution quasi-atomique de la protéine L du HTNV (HTNV-L) et du virus La Crosse (LACV-L) en complexe avec les régions promotrices 5’ et 3’ de l’ARNv. Enfin, j’ai caractérisé fonctionnellement LACV-L via la mise en place de tests d’activités réalisés in vitro. Ceci a permis de bloquer LACV-L à plusieurs étapes clés de la réplication et de la transcription, un prérequis qui m’a permis de déterminer sept structures à haute résolution de LACV-L en action. La combinaison de ces instantanés structuraux montre avec grande précision les mécanismes moléculaires sous-tendant la réplication et la transcription des Peribunyavirus.The Bunyavirales order encompasses over 500 species of segmented negative stranded RNA viruses (sNSV). Widespread throughout the world and considered as emerging viruses, the infection of humans by bunyaviruses can lead to serious diseases. In the Hantaviridae family, hemorrhagic fevers have been reported after Hantaan virus (HTNV) infection, while in the Peribunyaviridae family, La Crosse virus (LACV) infections have resulted in cases of encephalitis in children. In addition, the order Bunyavirales is related to other sNSVs such as influenza virus (Orthomyxoviridae), an infectious agent responsible for seasonal epidemics.The genomes of HTNV and LACV consist of three segments that encode four structural proteins: the glycoproteins (Gn and Gc), encoded on the M segment, the nucleoprotein (NP), encoded on the S segment and the polymerase, also known as L protein, encoded on the L segment. During infection, NPs protect the viral genome from damage and against innate immune response of the infected cell by multimerizing around the viral genome. These protein-RNA complexes form helical assemblies called nucleocapsids (NC). Both the 5' and 3' ends of each segment of the viral genome (vRNA) are respectively bound to an L protein. Interactions between L, NP and vRNA form a circularized complex called ribonucleoprotein (RNP). The RNPs present in the virus are the functional units that perform the replication and the transcription of each of the three viral segments.The replication of the vRNA first consists in the production of the complementary genome (cRNA) using vRNA as template, followed by the generation of new vRNA based on the cRNA template. The L protein, and in particular its RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) region, plays an essential role in this reaction. During infection, the L protein also initiates the production of messenger RNAs that encode viral proteins. It first “steals” a 5' capped RNA segment from the infected cell via its cap-binding domain (CBD). This capped RNA is then cleaved by an endonuclease domain (ENDO) also present in the L protein, which ultimately initiates the synthesis of viral messenger RNA (mRNA) thanks to the RdRp catalytic domain: this is transcription.Currently, there is no treatment to counteract bunyavirus infections. It is therefore crucial to analyze the essential steps of their viral cycle described above in order to understand their mechanism of operation and potentially allow the development of new antiviral treatments.The overall objective of this thesis was to take advantage of cryo-electron microscopy to structurally and functionally characterize two major actors of replication and transcription in bunyaviruses, NPs and L proteins, using HTNV and LACV as models. I first determined the high-resolution structure of the recombinant HTNV nucleocapsid (HTNV-NC) to characterize the different interactions between the different NPs and understand the mechanism of encapsidation of the vRNA within the HTNV-NCs. Secondly, I determined the cryo-EM structures of both HTNV and LACV L proteins (respectively called HTNV-L and LACV-L) in complex with the 5' and 3' promoter regions. Finally, I performed the functional characterization of LACV-L via the implementation of in vitro activity assays. This enabled to stall LACV-L in several key stages of both replication and transcription, a pre-requisite that permitted the determination of seven high-resolution structures of LACV-L in action. The combination of these structural snapshots shows with unprecedented details the mechanisms underlying peribunyaviruses replication and transcription